WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

««существенных» легких цепей миозина в процессе работы миозиновой головки», представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности ...»

ОТЗЫВ

официального оппонента на диссертационную работу Дарьи Сергеевны Логвиновой «Роль

«существенных» легких цепей миозина в процессе работы миозиновой головки»,

представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по

специальности 03.01.04 – «Биохимия»

Актуальность .

Миозин II типа является основным молекулярным мотором всех эукариотических

клеток и одним из мажорных белков поперечнополосатых мышц. Взаимодействие

миозина с актином лежит в основе сокращения скелетных, сердечных и гладких мышц, а также в основе разнообразных форм подвижности немышечных клеток, в том числе, миграции, секреции, эндоцитоза, цитокинеза, кластеризации мембранных рецепторов и др. С помощью методов рентгеноструктурного анализа, криоэлектронной микроскопии, изучения механики одиночных молекул миозина и ряда биохимических подходов стало в целом понятно, каким образом на молекулярном уровне происходит актомиозиновое сокращение. Были выделены и смоделированы отдельные стадии АТФ-азного цикла миозина и определены этапы в этом цикле, когда происходит расщепление макроэргической связи АТФ и генерируется сила, двигающая миозиновые головки относительно актина. Вместе с тем ряд важных аспектов актомиозинового сокращения остается на уровне гипотез и требует дальнейших сфокусированных исследований. К таким аспектам относится, в частности, роль легких цепей миозина, которые представлены т.н. существенными и регуляторными легкими цепями, ассоциированными с регуляторным доменом головки миозина .

Известно, что регуляторные легкие цепи могут фосфорилироваться, и эта посттрансляционная модификация активирует АТФ-азный центр миозина, находящийся достаточно далеко от регуляторной легкой цепи. Каким образом эффект фосфорилирования трансформируется в активацию миозиновой АТФ-азы остается не до конца понятным. Известно, что существенные легкие цепи не фосфорилируются, но выполняют структурную роль, стабилизируя моторный домен миозина. Однако на более детальном уровне, а именно, на уровне взаимодействий доменов существенной легкой цепи с миозином и с актином в процессе АТФ-азного цикла актомиозина, эти вопросы изучены крайне мало. Исследования в этом направлении несомненно необходимы. Они позволяют не только углубить фундаментальные знания о работе одного из важнейших молекулярных хемомеханических конвертеров организма – белка миозина, но и дают возможность более ясно представлять молекулярные причины развития наследственных миопатий и кардиомиопатий, связанных с мутациями в генах сократительных и регуляторных белков, которые часто ассоциированы с изменениями параметров взаимодействия этих белков. Диссертационная работа Д.С. Логвиновой направлена на решение обозначенной проблемы и является несомненно актуальной .

Основные задачи работы включали:

1) Выполнение экспериментов, подтверждающих гипотезу о том, что в процессе АTФ-азной реакции с моторным доменом миозиновой головки может взаимодействовать С-концевая часть существенной легкой цепи и уникальный N-концевой домен изоформы легкой цепи А1 .

2) Изучение взаимодействия N-концевого домена легкой цепи А1 с актином при связывании головок миозина с актиновыми филаментами в условиях физиологических значений ионной силы .

Методы .

Для решения поставленных задач автор использовал широкий спектр молекулярнобиологических, биохимических и физико-химических методов исследования. Был получен набор мутантных конструкций существенных легких цепей миозина, содержащих остаток цистеина в различных положениях аминокислотной последовательности белка с целью введения в эти положения флуоресцентной метки .





Одновременно единственный собственный остаток цистеина (Cys180) в составе легкой цепи заменяли на аланин. Все рекомбинантные белки были выделены из бактерий с помощью металл-хелатной хроматографии и охарактеризованы. Параллельно из миозина скелетных мышц был приготовлен его фрагмент S1, использовавшийся в дальнейшей работе. С помощью стандартных биохимических подходов проводилось замещение эндогенных легких цепей миозина на рекомбинантные легкие цепи. Полученные препараты S1 и актина в дальнейшем исследовали с помощью седиментации и электрофореза, методами анализа флуоресценции, включая FRET, использовали метод динамического светорассеяния и дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, измеряли АТФ-азную активность S1. Для моделирования различных состояний моторного домена миозина в процессе АТФазного цикла автор создавал стабильные тройные комплексы S1 c АДФ и фторидом бериллия или алюминия .

Методическое оснащение диссертационной работы большим арсеналом современных количественных методов не оставляет сомнений в том, что с их помощью возможно получить достоверные и воспроизводимые результаты .

Результаты работы. Основные результаты, полученные автором, следующие:

Впервые показано, что образование стабильных тройных комплексов 1 .

изолированной головки миозина с AДФ и аналогами Фн, имитирующими главные интермедиаты АТФ-азной реакции S1 – S1-ATФ и S1-АДФ-Фн, приводит к резкому повышению термостабильности регуляторного домена S1. Методом FRET определено, что в этих условиях С-концевая часть существенной легкой цепи в составе регуляторного домена S1 сближается с областью АТФ-азного центра S1 на 2 и более нанометров .

2. Методом FRET продемонстрировано, что при физиологических значениях ионной силы раствора в комплексах S1 с А1, т.е. S1 с «длинной» существенной легкой цепью А1, реализуется значительное сближение (дистанция менее 2,5 нм) самого N-конца уникального N-концевого домена А1 и Ф-актина .

3. Эта же N-концевая последовательность А1 сближается на 2 и более нанометров (до 3.5 нм) с моторным доменом S1 в комплексах S1-АДФ-BeFx по сравнению с S1-АДФ или S1 без нуклеотидов. В дополнительных экспериментах такое сближение двух удаленных частей S1 полностью предотвращало агрегацию S1(A1) при низкой ионной силе, что свидетельствует о способности А1 в определенных конформациях S1 взаимодействовать с другими его частями помимо регуляторного домена .

Полученные диссертантом результаты существенно углубляют понимание механизмов функционирования основного молекулярного мотора клетки – миозина .

Автору впервые удалось количественно оценить перемещения существенных легких цепей в составе миозиновой головки в процессе АТФ-азного цикла и получить дополнительные подтверждения взаимодействия легких цепей с моторным доменом миозина и с актином. В отсутствие полных структурных данных относительно этой области миозиновой молекулы находки автора позволяют частично реконструировать происходящие здесь события, и это несомненная новизна и прогресс в понимании молекулярных основ мышечного сокращения, привнесенные в науку данной диссертационной работой .

Основные замечания и вопросы по сути работы Д.С. Логвиновой следующие .

1. Для введения флуоресцентной метки в N-конец А1 в ее аминокислотную последовательность рядом с актин-связывающим участком была введена дополнительная последовательность CGI. Проверялось ли ее влияние на связывание А1 с актином?

2. Какова эффективность замены эндогенных существенных легких цепей в S1 на рекомбинантные легкие цепи?

3. Эксперименты по определению расстояния между флуоресцентными метками на легкой цепи и в моторном домене S1 показывают изменение этих расстояний при образовании тройных комплексов S1 с AДФ и аналогами Фн, в том числе, достаточно большие. Эти данные интерпретируются автором в пользу наличия взаимодействия между ними. Не отрицая такой трактовки, можно также предположить, что наблюдаемое сближение хромофоров происходит вследствие глобальных структурных изменений в S1, вызываемых связыванием аналогов нуклеотидов (в данном случае – тройных комплексов S1 с AДФ и аналогами Фн). Известно, что в процессе АТФ-азного цикла происходит значительный (на 60 градусов) поворот регуляторного домена относительно моторного домена, естественно, что и ассоциированные с регуляторным доменом легкие цепи также переносятся в новое более близкое положение, что и регистрирует FRET .

Дополнительным подтверждением в этом случае были бы данные по анизотропии флуоресценции изучаемых сигналов. При наличии взаимодействия А1 с моторным доменом S1 подвижность флуоресцентной метки, скорее всего, будет ограничена, что отразится на этом параметре .

Не стоит сбрасывать со счетов и простые эксперименты по соосаждению белков .

Для доказательства, что А1 и актин могут взаимодействовать при физиологических значениях ионной силы раствора, что предполагают результаты FRET экспериментов, можно было бы исследовать соосаждение изолированной А1 и Ф-актина при ультрацентрифугировании. Если взаимодействие достаточно сильное и не требует дополнительного связывания моторного домена S1 с актином, то перераспределение А1 в осадок будет однозначно свидетельствовать о наличии взаимодействия двух белков .

4. По данным FRET, расстояние N-конца А1 до моторного домена S1 резко падает для комплекса S1-АДФ-BeFx. Как и в случае с С-концевым доменом легкой цепи, автор считает это подтверждением наличия взаимодействия двух белков в этой области S1. Это утверждение также можно было бы усилить результатами экспериментов по поляризации флуоресценции. С другой стороны, можно предположить, что наличие дополнительного по сравнению с А2 взаимодействия в комплексе S1-АДФ-BeFx отразится на стабильности этого комплекса и скажется на параметрах его агрегации в результате тепловой денатурации моторного домена S1. Однако, данные автора показывают, что поведение при нагревании S1(A1) и S1(A2) в тройном комплексе не отличается (Рис. 31). Не свидетельствует ли это против постулируемого взаимодействия?

5. В ряде FRET экспериментов автор использовал флуоресцирующий TNP-АДФ вместо АДФ для сборки тройных комплексов. Насколько успешно собираются такие комплексы и насколько адекватно они моделируют интермедиаты АТФ-азной реакции S1?

6. В выводе 3 заявляется, что наблюдаемые межмолекулярные взаимодействия А1 при агрегации отражают внутримолекулярные взаимодействия А1 с собственным моторным доменом. Почему же тогда в эксперименте «выигрывают» межмолекулярные взаимодействия?

Структура и оформление работы .

Диссертационная работа Д.С. Логвиновой изложена на 119 страницах и написана по традиционному плану. Она включает введение, обзор литературы, раздел материалы и методы, раздел результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы (126 источников). Работа снабжена 37 рисунками и 7 таблицами .

Обзор литературы написан логично хорошим языком и иллюстрирован 15 рисунками и схемами, помогающими читателю лучше понять суть проблемы и направление работы автора. Этот раздел работы демонстрирует, что диссертант хорошо владеет литературным материалом в своей области и в смежных областях и способен к аналитической работе. В целом, обзор литературы успешно выполняет роль подготовки читателя к восприятию экспериментальной части работы .

Раздел Материалы и Методы содержит достаточно подробное описание использованных автором подходов, Из этого раздела видно, что диссертант полностью понимает суть и особенности применения описанных методов. Даны ссылки на стандартные методики .

Раздел собственных исследований показывает, какую объемную работу провел автор при исследовании роли существенных легких цепей при работе миозиновой головки .

Раздел иллюстрирован большим количеством графиков, в основном демонстрирующих температурные зависимости плавления, флуоресценции и агрегации S1, ассоциированного с различными вариантами существенных легких цепей и находящегося в комплексе с различными нуклеотидами. В разделе также представлены электрофореграммы S1, спектры флуоресценции и таблицы с результатами расчета дистанций между флуоресцентными метками на изучаемых белках, рассчитанными из данных FRET анализа. Качество представления экспериментальных данных высокое, что свидетельствует о тщательности работы автора и не оставляет сомнений в достоверности полученных им результатов. В этом же разделе приведены схемы, графически обобщающие полученные результаты. Обсуждение результатов проведено корректно, без больших отступлений от сути выполненной работы. При этом все основные находки автора подробно обсуждены и сопоставлены с данными литературы .

00 pe3YJlbTaTaM pa60TbI CCPOPMYJlHpOBaHo 4 BbIBO,ll.a. OHH a,ll.eKBaTHO OTpmKaIOT CYTb nOJlY4eHHbIX aBTopoM pe3YJlbTaToB .

–  –  –

ocpopMJleml1O pa60Tbi HMeIOTC5I HeKoTopble 3aMe4aHH5I. TaK, B TeKCTe BCTpe4aIOTC5I one4aTKH, HanpHMep, Ha CTp. 66, 82, 103, 107. B PYCCK05l3bI4HOH HaY4HoH JlHTepaType npHH5ITO nHcaTb KOHCTPYKUH5I, a He KOHCTPYKT (CTp. 54). Ha CTp. 91 YKmaHa CCbIJlKa Ha pHC. 30 6,B BMeCTO pHC .

28 6,B. Ha pHC. 30 B (CTp. 94) nepenYTaHbl MeCTaMH 0603Ha4eHH5I Sl(AI) H SI(A2) .

O,ll.HaKO 3aMe4aHH5I no CyTH H ocpopMJleHHIO,ztHcCepTaUHOHHOH pa60TbI He 51BJl5lIOTC5I

–  –  –

KOHcpepeHUI151X H ony6JlHKOBaHbI B 3 CTaTb5lX B peHTI1HrOBblx POCCHHCKHX H Me)K,Il.YHapO,ll.HbIX )KypHaJlax. CO,ll.ep)KaHHe aBTopecpepaTa nOJIHOCTblO cOOTBeTCTByeT cO,ll.ep)KaHHIO,Il.HCCepTaUHH .

–  –  –

JlerKHX ueneH MH03HHa B npouecce pa60TbI MH03HHOBOH rOJlOBKH», HeCOMHeHHO, 51BJl5leTC5I 3aBepweHHoH HaY4Ho-KBaJll1cpHKaUHoHHoH pa60ToH BblCOKoro Ka4eCTBa. Pa60Ta BbInOJlHeHa HenOCpe,ll.CTBeHHo,Il.HCCepTaHToM H nOJlHOCTblO cooTBeTcTByeT 1'pe60BaHH5IM OOJlO)KeHH5I «0

–  –  –

CTeneHI1 KaH,Il.H,Il.aTa 6HOJlOrH4eCKHx HayK no CneUHaJlbHOCTH 03.01.04 - 6HOXHMH5I .

rJlaBHblH HaY4HbIH COTPY,ll.HHK H.O. PYKoBO,ll.HTeJl51 Jla60paTopHH KJleT04HOH nO,ll.BH)KHOCTH I1HcTHTYTa 3KcnepHMeHTaJlbHOH Kap,ll.HOJlOrHH HaUHOHaJlbHOrO Me,ll.HUHHCKoro HCCJle,ll.OBaTeJlbCKOrO ueHTpa Kap,ll.HOJlOrHH MHH3,1l.paBa POCCHH,,Il.OKTOP 6HOJlOrH4eCKHx HayK (14.00.06 - Kap,ll.HOJlOrH5I, 03.00.04 - 6HOXHMH5I) B.O. illHPHHCKHH npocpeccop BJla,ll.HMHp OaBJlOBH4 illHPHHCKHH A,Il.pec: IrEY HMI1L( Kap,ll.HOJlorHH M3 PI, YJl. 3-51 LJ:epenKOBCKa5l,,Il.. 15a, MocKBa 121552, POCCH5I E-mail: ~ hirin~kvi(ll gll1ail. c )m: TeJl.: 8-495-414-7246 OO,ll.nHCb,Il..6.H., npocp. B.D. illHpHHcKoro 3aBep5l1O Y4eHblH ceKpeTapb I13K HMI1L( Kap,ll.HOJlOrHH M3 PI,Il.OKTOP Me,ll.HUHHCKHX HayK 28.05.2018





Похожие работы:

«147 [46] СТРОГАНОВ Николай Сергеевич Строганов Николай Сергеевич (1902 1982) – известный ученый, гидробиолог, профессор МГУ им. Ломоносова. Заслуженный деятель науки РСФСР . Строганов Н.С. родился 25 декабря 1902 г...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОЛОГОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ А.С. НОВОСЁЛОВ _ ОСНОВЫ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ _ Утверждено редакционно-издательским советом Вологодского государственного университета в качестве учебного пособия для студентов,...»

«2. Плодородие почв и применение удобрений 12. Подоляк, А.Г. Травосмеси на основе клевера в зоне радиоактивного загрязнения / А.Г. Подоляк, Т.В. Арастович // Белорусское сельское хозяйство. – 2005. – № 6(38). – С...»

«Афонин А.Н., Соколова Ю.В. Эколого-географический анализ и моделирование распространения биологических объектов с использованием ГИС Учебное пособие (Практикум) УДК 91 ББК 26.17 А94 Одобрено Учебно-методической комиссии Института наук о Земле Санкт-Петербургского государственного университета 21 ноября 2017...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2010, Том 19, Экспресс-выпуск 584: 1239-1242 О заселении малой пестрогрудкой Tribura (Dumeticola) davidi восточной окраины Азии: новое, недавнее и изолированное, место...»

«TAU-1M.IP Руководство по эксплуатации, версия 1.4 (02.2016) Абонентский шлюз IP-телефонии IP-адрес: http://192.168.1.1 имя пользователя: admin пароль: password Версия документа Дата выпуска Содержание измен...»

«ДОБРЖАНСКАЯ Анна Валерьевна СОСТАВ И СВОЙСТВА ТОНКИХ НИТЕЙ ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS 03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени канд...»

«Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2008. №2(61). 339 УДК 577.4 РОЛЬ ЧЕЛОВЕКА В СУДЬБЕ БИОСФЕРЫ С ПОЗИЦИИ СИСТЕМНОГО АНАЛИЗА1 Ю.П. Фролов2 © 2008 Биологическая эволюция создала человека не для господства над Природой. Его основная задача — защита живой части биосфер...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРОГРАММА Курса: ГЕОЛОГИЯ МЕСТОРОЖДЕНИЙ ПОЛЕЗНЫХ ИСКОПАЕМЫХ Специальность 013300 – экологическая геология ОПД.Ф.10 ВОРОНЕЖ 2003г. Утверждено научно-методическим советом Геологического факультета Протокол № 5 от 03.04. 2003 г. Составите...»







 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.