WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ L12/P-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ И. В. МИТРОШИН, М. Б. ГАРБЕР, 8 2016 г. А. Г. ГАБДУЛХАКОВ Институт белка РАН, Пущино, Московская область I. Введение. II. ...»

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы химии, т. 56, 2016, с. 25–52

Успехи биологической 25

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ

L12/P-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ

И. В. МИТРОШИН, М. Б. ГАРБЕР,

8 2016 г .

А. Г. ГАБДУЛХАКОВ

Институт белка РАН, Пущино, Московская область

I. Введение. II. Номенклатура рибосомных белков. III. Компоненты

L12/Р­выступа рибосомы. IV. Взаимозаменяемость бокового

выступа бактерий, архей и эукариот. V. Кристаллографические исследования L12/P­выступа в составе рибосом. VI. Заключение .

I. ВВЕДЕНИЕ В 1950­х годах были открыты клеточные органеллы, которые ответ­ ственны за биосинтез белка в клетке. Эти органеллы были названы рибосомами. Рибосома представляет собой макромолекулярный рибо­ нуклеопротеидный комплекс. Рибосомная РНК (рРНК) определяет основные структурные и функциональные свойства рибосомы, но для нормального функционирования рибосомы необходимо наличие как рРНК, так и рибосомных белков .

Строение рибосом на ранних этапах исследовалось методами ультрацентрифугирования и электронной микроскопии. Эти иссле­ дования показали, что в определенных условиях (например, низкая концентрация ионов магния) рибосома диссоциирует на малую и большую субчастицы. Для большой субчастицы рибосомы харак­ терны три периферических выступа: с одной стороны субчастицы рас­ положен боковой пальцеобразный выступ (L12­выступ в бактериях и Р­выступ в археях и эукариотах), посередине – центральный проту­ беранец, который можно назвать головкой большой субчастицы, и с другой стороны – боковой L1­выступ [1, 2] .



В процессе биосинтеза белка рибосома взаимодействует с мат­ ричной РНК (мРНК), транспортными РНК (тРНК), факторами инициа­ Принятые сокращения: рРНК – рибосомная РНК, мРНК – матричная РНК, тРНК – транспортная РНК, IF2 – фактор инициации трансляции 2 .

Адрес для корреспонденции: garber@vega.protres.ru Работа выполнена при поддержке программы президиума РАН «Молекуляр­ ная и клеточная биология» .

26 И.В.Митрошин и соавт .

ции, элонгации и терминации трансляции и с другими лигандами [3] .

Рабочий цикл рибосомы состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации. Факторы трансляции способствуют белковому синтезу на каждом этапе рабочего цикла рибосомы. Боковой L12/P­выступ рибо сомы способствует взаимодействию рибосомы с факторами элонгации и терминации трансляции, а L12­выступ бактерий участ­ вует еще и в инициации трансляции, увеличивая скорость ассо­ циации малой и большой субчастиц рибосомы [4]. С помощью крио электронной микроскопии и последующей реконструкции структуры рибосомы показано, что в процессе элонгационного цикла рибосомы L12­выступ подвергается различным конформационным перестройкам .

II. НОМЕНКЛАТУРА РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ

Малая и большая рибосомные субчастицы содержат большое число индивидуальных белков. Практически все они представлены одной копией на рибосоме. Первая попытка систематизировать рибосомные белки была основана на стандартном экспериментальном методе, в качестве которого использовался двумерный электрофорез в геле .

Этот наиболее удобный метод позволил полностью разделить рибо­ сомные белки по заряду и размеру молекул (рис. 1) [5] .

Первоначально рибосомные белки каждого вида организмов имели собственное обозначение, соответствующее их электрофоретическому разделению. В возникшей номенклатуре один и тот же номер мог при­ надлежать негомологичным белкам различных видов. При сравнении аминокислотных последовательностей рибосомных белков была найдена гомология между белками разных видов, а также было обна­ ружено, что большая часть рибосомных белков эволюционно консер­ вативна [6]. Это позволило создать первоначальную номенклатуру для консервативных гомологичных белков бактерий, архей и эукариот .



С появлением полученных методами кристаллографии или криоэлектронной микроскопии моделей бактериальных, архейных и эукариотических рибосом отсутствие единого обозначения рибо­ сомных белков стало затруднять сравнительный анализ структур. Для решения этой проблемы, в 2014 году была создана единая номенкла­ тура рибосомных белков всех доменов жизни (таблица) [7]. В основу новой номенклатуры легло обозначение рибосомных белков E. coli, поскольку впервые рибосомные белки были выделены именно из этого организма, их аминокислотные последовательности стали известны раньше последовательностей других рибосомных белков, Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы Рис. 1. Разделение рибосомных белков 30S (А) и 50S (Б) субчастиц рибосомы Escherichia coli с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и номенклатура этих белков. Первое направление – горизонтальное, второе направление – вертикальное (сверху вниз). Белки малой субчастицы рибосомы обозначены буквой S (от англ. «Small»), а белки большой субчастицы – буквой L (от англ. «Large») (рисунки с небольшими изменениями взяты из работы [5]) .

28 И.В.Митрошин и соавт .

Таблица. Старая и новая номенклатуры рибосомных белков (таблица взята с изменениями из работ [7, 8]) .

–  –  –

а также эти белки были наиболее подробно описаны в литературе .

Белкам, которые обнаружены в рибосомах всех доменов жизни, была присвоена приставка «u» (от английского «univesal») и нумерация белков E. coli. Бактериальные белки, у которых не обнаружено гомо­ логов среди архей и эукариот, были обозначены приставкой «b» (от английского «bacterial»). Архейным рибосомным белкам, которые не имеют гомологов в бактериальной и эукариотической рибосомах, была приписана приставка «а» (от английского «archaeal»). Приставка «e» (от английского «eukaryotic») была добавлена не только для обозначения эукариотических рибосомных белков, для которых не найдены бактериальные и архейные гомологи, но также и для гомоло­ гичных им архейных белков .

В предложенной номенклатуре рибосомные белки L12/P­выс­ тупа приобрели новое обозначение. Бактериальный белок L10 и его архейный и эукариотический гомологи P0 было предложено обоз­ начать как uL10, а бактериальный белок L12 – как bL12. В археях и эукариотах не обнаружено гомологов бактериального белка L12, но имеются его функциональные аналоги, называемые белками eP1/P2 в эукариотах и aP1 в археях. Соответственно, этот боковой выступ у архей и эукариот обозначается теперь как Р­выступ. Бактериальный и архейный белки L11 и их эукариотический аналог, белок L12е, предложено обозначать как uL11 .





Далее в обзоре будет использоваться более подробная номенкла­ тура. Так, чтобы различать «универсальные» белки uL10 и uL11, кроме префикса «u» будут также использоваться префиксы «b», «a»

и «e», которые будут обозначать принадлежность белка к бактериям, археям или эукариотам, соответственно .

III. КОМПОНЕНТЫ L12/Р-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БЕЛКИ bL10, bL11 И bL12 Рибосомные белки bL10, bL11 и bL12 вместе с фрагментом домена II 23S рРНК образуют характерный морфологический выступ бакте­ риальной рибосомы, называемый L12­выступом. Двух­стадийная обработка большой рибосомной субъединицы E. coli 1 M NH4Cl и 50% этанолом при 0°С и 37°С позволяет полностью удалить эти белки из рибосомы [8] .

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 31 Рибосомный белок bL12 Рибосомный белок bL12 является одним из первых белков, выде­ ленных из рибосомы. Это единственный белок большой субчастицы рибосомы, который представлен в нескольких копиях [9]. В рибо­ сомах E. coli присутствует также ацетилированный вариант этого белка, который по первоначальной номнклатуре был обозначен как рибосомный белок L7 [5]. bL7 является точной копией рибосомного белка bL12, единственным отличием является то, что bL7 ацетили­ рован по N­концевому остатку серина [10]. Из­за близкого сход­ ства эти белки ранее в литературе упоминались как белок bL7/L12 .

Соотношение белков bL7 : bL12 в клетке не постоянно и зависит от фазы роста клеток. В ранней логарифмической фазе роста клеток E. coli в рибосомах присутствие белка bL7 минимально. Увеличение его количества наблюдается при переходе из логарифмической фазы роста клеток в стационарную фазу [11, 12] .

В процессе инициации трансляции белок bL12 необходим для узнавания фактора инициации трансляции 2 (IF2) в комплексе с ГТФ в составе 30S преинициаторного комплекса. Результатом такого взаимодействия является увеличение скорости ассоциации малой и большой рибосомных субчастиц [4] .

Скорость трансляции и уровень ошибок в процессе биосинтеза белка на рибосомах зависят от наличия белка bL12 [13, 14]. Удаление этого рибосомного белка из рибосомы затрудняет связывание факто­ ров элонгации EF1А и EF2 с рибосомой [15] и затрагивает другие фактор­зависимые функции, например, связывание аминоацил­тРНК с А­сайтом рибосомы, транслокацию, и, как следствие, гидролиз ГТФ [16, 17] .

Белок bL12 обладает уникальными свойствами среди бактериаль­ ных рибосомных белков. Помимо того что bL12 является мультико­ пийным белком, его изоэлектрическая точка находится в кислой области (рН 4.8) [18]. В водном растворе изолированный белок bL12 существует только в виде димера [19] или тетрамера [20] .

Рибосомный белок bL12 состоит из двух доменов и длинной гибкой перетяжки [21–23]. С­концевой домен белка bL12 (bL12CTD) ответственен за взаимодействие с факторами трансляции [24, 25], а N­концевой домен белка bL12 (bL12NTD) – за димеризацию и связы­ вание с рибосомным белком bL10 [21]. N­ и C­концевые домены bL12 соединены между собой гибкой перетяжкой, которая обеспечивает подвижность молекулы белка [26]. Длина этой перетяжки влияет не только на подвижность двух доменов друг относительно друга, но 32 И.В.Митрошин и соавт .

и на связывание факторов элонгации, гидролиз ГТФ на рибосоме, скорость и точность трансляции [27, 28]. Удаление этого участка приводит к инактивации белка bL12 [28] .

В 1980 году был закристаллизован C­концевой домен белка bL12 из E. coli и определена его структура с разрешением 2.6 [29]. Это была первая кристаллическая структура рибосомного белка. Значительно позднее появилась пространственная структура полноразмерного белка bL12 из Thermotoga maritima с разрешением 2.0 [30]. bL12NTD содержит две коротких спирали 1 и 2. Длинная шарнирная спираль 3 представляет собой перетяжку, которая отделяет N­концевой домен от глобулярного C­концевого домена. Эта спираль образована 20 аминокислотными остатками, преимущественно гидрофобными .

C­концевой домен белка bL12 имеет плотную упаковку и состоит из трех­тяжевого анитипараллельного ­листа, окруженного с одной стороны тремя ­спиралями [30] .

В 2004 году определена пространственная структура димера белка bL7, N­ацетилированного варианта белка bL12 из E. coli, методом ядерного магнитного резонанса в растворе (ЯМР) [26]. Белок bL7 находится в вытянутой конформации. Данная структура димера белка bL7 сильно отличается от кристаллической структуры белка bL12 из T. maritima в области перетяжки. Гибкая перетяжка в структуре каждого мономера белка bL7 не имеет определенной структурной укладки. Определенная методом ЯМР структура димера белка bL7 позволила определить способ димеризации белка в растворе (рис. 2) .

Димеризация белка bL7 происходит за счет контакта двух антипа­ раллельных V­образных ­­шпилек N­концевого домена, которые образуют симметричный четырех­спиральный узел .

На основании полученных структур белка bL12 из T. maritima и димера белка bL7 из E. coli была предложена модель молекулярного переключения между двумя состояниями белка. Эта модель предпо­ лагает, что участок в области перетяжки белка bL12 может выполнять роль молекулярного переключателя: молекула принимает или «зак­ рытую», компактную конформацию, когда фактор элонгации связан с рибосомой, или «открытую», вытянутую конформацию после гид­ ролиза ГТФ и освобождения фактора элонгации из рибосомы [26] .

Димеры белка bL12 связываются с рибосомным белком bL10, образуя в растворе прочный комплекс рибосомных белков bL10­bL12 .

Термостабильность белков bL10 и bL12 в комплексе повышается по сравнению с индивидуальным состоянием [31]. Комплекс bL10­bL12 из E. coli остается стабильным в присутствии 6 М мочевины при значении рН 4.6. В связи с этим при систематизации рибосомных Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 33 Рис. 2. Структурное сравнение способов димеризации эукариотических белков eP1/P2, архейного белка aP1 и бактериального белка bL12 (рисунок с неболь­ шими изменениями взят из работы [34]) .

белков методом двумерного электрофореза сохранившийся в дена­ турирующих условиях комплекс белков bL10­bL12 был ошибочно принят за индивидуальный белок, которому было присвоено название L8 [32] .

Для комплекса рибосомных белков bL10­bL12 из E. coli было установлено соотношение белков bL10 и bL12 как 1 : 4 методами изотопного разведения [33], равновестного ультрацентрифугирования и количественного анализа пятен белков на электрофореграмме [31]. Поэтому долгое время считалось, что бактериальный комплекс рибосомных белков bL10­bL12 может существовать только в виде пентамера. Появление кристаллической структуры рибосомного комплекса bL10­bL12NTD из T. maritima изменило представление о соотношении белков bL10 и bL12. В данной структуре комплекса шесть молекул N­концевого домена белка bL12 образовали с одной молекулой белка bL10 гептамерный комплекс [34]. В связи с этим было выдвинуто предположение, что разница между соотношением белков в bL10­bL12 комплексах зависит от природы организма, из которого выделены белки, и дополнительная аминокислотная пос­ ледовательность в С­концевом домене белка bL10 термофильных бактерий может быть местом связывания для третьего димера белка bL12 [35]. Результаты, полученные методом масс­спектрометрии, подтвердили это предположение. Было показано, что комплексы bL10­bL12 из мезофильных бактерий являются пентамерными, а из термофильных бактерий – исключительно гептамерными [35, 36] .

34 И.В.Митрошин и соавт .

Рибосомный белок bL10 Рибосомный белок bL10 играет роль моста между димерами белка bL12 и рибосомой. С­концевая часть белка bL10 мезофильных бакте­ рий содержит два независимых сайта связывания для димеров белка bL12, тогда как N­концевой частью белок bL10 взаимодействует с 23S рРНК [22] .

Кристаллическая структура комплекса рибосомного белка bL10 с димерами N­концевого домена белка bL12 из T. maritima была определена с разрешением 2.3 [34]. Белок bL10 состоит из двух доменов: N­концевого РНК­связывающего домена и C­концевого домена, с которым связывается белок bL12. N­концевой домен имеет плотную упаковку и содержит / мотив. C­концевой домен белка bL10 образован длинной и гибкой C­концевой ­спиралью (спираль 8). Спираль 8 изгибается дважды, формируя три сегмента из 10 аминокислотных остатков. Каждый сегмент связывает один димер bL12NTD, поэтому в области контакта белков bL10 и bL12 можно выделить три практически идентичных элемента [34]. Между N­ и С­концевым доменами белка bL10 находится, так называемый, «центр вращения». Благодаря этому «центру вращения» обеспечивается высокая подвижность спирали 8 с димерами bL12NTD относительно РНК­связывающего домена, необходимая для функциональной активности бокового L12­выступа [34] .

Место связывания белка bL10 с рибосомой расположено на поверхности большой субчастицы рибосомы. Методом химического пробинга был определен основной участок связывания белка bL10, который расположен в домене II 23S РНК и включает спирали H42–44 [37]. Чтобы локализовать сайт связывания белка bL10 c 23S рРНК было проведено наложение по консервативному РНК­связывающему домену известной структуры бактериального белка bL10 из T. maritima на структуру двух N­концевых ­спиралей архейного белка aL10, которая определена в составе 50S рибосомной субчастицы из археи Haloarcula marismortui [34, 38]. На основании этих данных обнаружено, что наибольшее количество контактов образуется между спиралями 1 и 2 белка bL10 и спиралью H42 23S рРНК, что хорошо согласуется с данными химического пробинга [34, 37] .

Стоит отметить, что большая часть контактов белка bL10 с 23S рРНК приходится на сахарофосфатный остов рРНК. Вероятно, пространст­ венная укладка рРНК играет ключевую роль в узнавании места связы­ вания белка uL10 в рибосомах всех организмов [34] .

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 35 Гены бактериальных рибосомных белков bL10 и bL12 располо­ жены в одном опероне. Рибосомный белок bL10 в составе комплекса bL10­bL12 является трансляционным репрессором своего оперона и связывается с мРНК выше инициаторного кодона гена белка bL10 [39, 40] .

При анализе рРНК в кристаллической структуре большой суб­ частицы рибосомы из Deinococcus radiodurans в районе ГТФазного центра был выделен консенсусный мотив в спирали H42 23S рРНК, называемый «излом­поворот» (от английского «kink­turn motif»), который, возможно, вносит основной вклад в узнавание рРНК белком bL10 [41, 42]. мРНК гена rplJ из E. coli потенциально может содержать такой же мотив [43]. Предполагается, что мРНК и рРНК взаимодействуют с белком bL10 схожим образом .

Рибосомный белок bL11 связывается с 23S рРНК рядом с сайтом связывания белка bL10. Связывание белков bL10 и bL11 происходит кооперативно [44]. Кооперативный эффект может увеличивать сродство bL10 к рРНК в 100 раз [43]. Возможно, что кооперативное связывание bL10 и bL11 обусловлено конформационными изменениями в структуре рРНК [34]. Несмотря на то, что в экспериментах in vitro мРНК и рРНК связывались с белком bL10 с одинаковым сродством, 100­кратный кооперативный эффект связывания bL10 и bL11 с рРНК гарантирует, что рибосомы будут практически полностью заняты комплексом белков bL10­bL12 [43] .

Рибосомный белок bL11 Рибосомный белок bL11 является необходимым компонентом рибо­ сомной 50S субчастицы и расположен в основании L12­выступа .

Мутантные штаммы клеток Bacillus megaterium, лишенные белка bL11, жизнеспособны, но их рост замедлен более чем в два раза по сравнению с клетками штамма дикого типа [45]. Белок bL11 выпол­ няет схожую с белком bL12 функцию на рибосоме – участвует во взаимодействии рибосомы с факторами элонгации EF1A и EF2, с факторами терминации RF1 и RF2, способствует ассоциации субчас­ тиц рибосомы, а также стимулирует гидролиз ГТФ [46]–[48] .

В настоящее время определены пространственные структуры полноразмерного белка bL11 из T. maritima в свободном состоянии методом ЯМР в растворе [49] и в комплексе с фрагментом 23S рРНК методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.6 [50], а также структура 50S субчастицы рибосомы из Deinococcus radiodurans в комплексе с антибиотиком тиострептоном, в которой визуа­ лизирован белок bL11, с разрешением 3.3 [51] .

36 И.В.Митрошин и соавт .

Рибосомный белок bL11 состоит из N­ и C­концевых глобуляр­ ных доменов, которые соединены короткой перетяжкой. Спираль 1 N­концевого домена белка bL11 имеет консервативный остаток про­ лина (Pro22, нумерация по T. maritima), с которым взаимодействуют антибиотики тиазольного класса (например, тиострептон и микро­ кокцин). Перетяжка между доменами bL11 образована консенсусным мотивом из трех аминокислотных остатков (Thr72–Pro73–Pro74) .

Структура С­концевого домена (bL11CTD) имеет характерную осо­ бенность, а именно протяженную неупорядоченную петлю (84–96 а .

о.). Эта петля вовлечена в РНК­белковое взаимодействие и подвер­ жена конформационным изменениям при связывании рРНК [49, 50] .

С помощью C­концевого домена белок bL11 взаимодействует с большой рибосомной РНК. Методом связывания на фильтрах уста­ новлено, что константа диссоциации для белка и рРНК равна 1.210–9 М [52]. C­концевой домен белка bL11 связывается с малым желобком 23S рРНК, образованным спиралями H43–44. РНК­связывающая поверхность белка bL11 образована спиралью 5, N­концевой частью спирали 3, а также петлями 3–4 и 4–5, которые расположены по бокам спирали 5. Спираль 5 расположена вдоль малого желобка 23S рРНК, образуя наибольшее количество контактов. Петли 3–4 и 4–5 при связывании с рРНК приобретают упорядоченную струк­ туру, которая повторяет поверхность малого желобка рРНК [50] .

Больше половины водородных связей комплекса образовано между сахарофосфатным остовом рРНК и основной цепью bL11CTD. Этот факт указывает на то, что пространственная укладка 23S рРНК играет основную роль в узнавании места связывания белком bL11 .

С помощью биофизических экспериментов показано, что белок bL11 стабилизирует третичную структуру рРНК посредством C­концевого домена [53]. N­концевой домен белка bL11 (bL11NTD) участвует во взаимодействии с факторами трансляции .

Рибосомный комплекс белка bL11 с 23S рРНК служит мишенью для тиазольного класса антибиотиков [54]. При связывании с рибо­ сомой тиострептон блокирует, а микрококцин – стимулирует гидро­ лиз ГТФ на EF2 [55]. Основной сайт связывания тиострептона/ микрококцина расположен в щели между спиралью 1 bL11NTD и 1067/1095 участком рРНК. Таким образом, антибиотик тиострептон блокирует функционально важные структурные перестройки bL11 с помощью образования стабильного комплекса bL11–рРНК–тио­ стрептон .

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 37

БЕЛКИ ЭУКАРИОТИЧЕКОГО И АРХЕЙНОГО Р­ВЫСТУПА

Эукариотические и архейные рибосомы содержат боковой P­выступ, структурная организация которого аналогична бактериальному L12­выступу. Эукариотический рибосомный P­выступ образован двумя типами P­белков и белком eL11. Белок eL10 относится к пер­ вому типу P­белков (ранее обозначался как P0) [56]. Второй тип включает небольшие кислые белки eP1/P2 размером около 11 кДа [57] .

P­белки образуют между собой пентамерный комплекс eL10–eP1/ P2, в котором два гетеродимера eP1/P2 связываются с белком eL10 .

Эукариотический P­выступ является необходимым компонентом рибосомы, а белок eL10 жизненно важен для роста клеток [58] .

В археях P­выступ состоит из рибосомных белков aL11, aL10 и aP1 .

Архейные белки aL10 и aP1 по аминокислотной последовательности и размеру намного ближе к эукариотическим белкам eL10 и eP1/P2, чем к бактериальным аналогам [59] .

Архейный P­выступ достаточно стабилен. Белки aL10 и aP1 образуют прочный белковый комплекс aL10­aP1, который, как и бактериальный комплекс bL10­bL12, не разрушается в 6 М мочевине при рН 4.6. При обработке большой субчастицы архейной рибосомы раствором с высокой концентрацией NH4Cl и этанолом белок aL10 не удаляется полностью с рибосомы, поскольку взаимодействует с рРНК с большим сродством, чем белок bL10 [60] .

Рибосомные белки eP1/P2 и aP1 Эукариотические белки eP1/P2 между собой очень похожи, как функционально, так и структурно. В разных видах организмов при­ сутствует разное количество групп и подгрупп белков eP1/P2 [61, 62]. В отличие от бактериального белка bL12 из E. coli, который представлен на рибосоме еще дополнительной N­ацетилированной копией, каждый тип белка eP1/P2 кодируется отдельным геном [61] .

В растворе eP1/P2 белки находятся в виде стабильного гетеродимера [63, 64] .

Архейный белок aP1 кодируется только одним геном в археях и не подвержен модификациям, несмотря на то, что имеет структурное сходство с эукариотическими белками eP1/P2. В растворе, а также на рибосоме, белок aP1 находится в виде димера [60, 65] .

Структурно архейный aP1 и эукариотический eP1/P2 можно разделить на N­ и C­концевой домены и гибкую перетяжку, которая соединяет оба домена (аналогично бактериальному белку bL12). И также как в bL12, N­концевой домен ответственен за димеризацию этих белков и за связывание их с рибосомной субчастицей через белок a/eL10 [66, 67] .

38 И.В.Митрошин и соавт .

В процессе биосинтеза белка архейный белок aP1 выполняет функцию доставки факторов трансляции на рибосому. С­концевая часть белка напрямую взаимодействует с элонгационными факторами aEF2 и aEF1, а также с фактором инициации aIF5B, который явля­ ется гомологом бактериального фактора инициации IF2 [68, 69] .

Методом поверхностного резонанса плазмонов показано, что белок aP1 связывает фактор элонгации aEF2 независимо от того, находится ли фактор в комплексе с ГТФ или ГДФ. Более того, белковый комп­ лекс aL10•(aP1)6 способен связывать несколько молекул aEF2, что способствует увеличению скорости доставки aEF2 в ГТФаза­связы­ вающий центр и высокой скорости гидролиза ГТФ [69] .

Первые десять аминокислотных остатков эукариотического белка eP1/P2 важны для гетеродимеризации и образования пентамерного комплекса [70]. С­концевой домен белка eP1/P2 ответственен за взаимодействие рибосомы с факторами трансляции [71] .



В настоящее время определена пространственная структура полноразмерного гетеродимера eP1/P2 из Homo sapiens методом ЯМР в растворе [72]. N­концевые домены белков eP1 и eP2 состоят их четырех ­спиралей и достаточно компактны (рис. 2). Гетеродимер N­концевых доменов eP1 и eP2 ассиметричен и образован за счет высококонсервативных гидрофобных остатков спиралей 1, 2 и 4 белков eP1 и eP2. Основной контакт расположен между спиралями 1 белков eP1 и eP2. С­концевая часть не имеет определенной структуры .

В результате C­концевой «хвост» димера eP1­eP2 может быть на расстоянии до 125 от N­концевого домена. Благодаря вытянутому C­концевому «хвосту» eP1/P2, факторы элонгации трансляции, по­ви­ димому, могут беспрепятственно быть доставлены в ГТФаза­связы­ вающий центр [72] .

Структура полноразмерного архейного белка aP1 неизвестна, но определены кристаллические структуры димеров N­концевого домена белка aP1 (в комплексе с белком aL10; разрешение 2.1 ) [67] и C­концевого домена белка aP1 (в комплексе с фактором элонгации aEF1; разрешение 2.3 ) из Pyrococcus horicoshii [73]. N­концевой домен архейного белка aP1 образован четырьмя ­спиралями (рис .

2). Димеризация белка aP1 происходит благодаря гидрофобным взаимодействиям между спиралями 1 и 2 двух мономеров. В отличие от компактного C­концевого домена бактериального bL12, С­концевой домен архейного aP1 (aP1CTD) неструктурирован в свободном от фактора элонгации состоянии [74], но при взаимо­ действии с трансляционными факторами aP1CTD структурируется с образованием длинной ­спирали [73] .

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 39 Структуры архейного димера N­концевого домена aP1 и эука­ риотического гетеродимера N­концевых доменов eP1 и eP2 имеют схожую укладку полипептидных цепей в отличие от бактериального димера N­концевого домена белка bL12 (рис. 2). Основные отличия в структурах димера aP1NTD и гетеродимера eP1/P2NTD заключены в спирали 4. Спираль 4 aP1NTD в структуре архейного комп­ лекса aL10•(aP1)6 принимает «открытую» конформацию, которая позволяет связываться с короткой спиралью белка aL10. Спираль 4 в эукариотическом димере eP1/P2NTD принимает «закрытую»

конформацию, но, вполне вероятно, эта спираль может принимать и «открытую» конформацию, и в таком состоянии способствует связы­ ванию гетеродимера eP1/P2 с С­концевой частью эукариотического белка eL10 [66] .

Поверхность спирали 3 эукариотического белка eP1 сильно гидрофобна, тогда как поверхность спирали 3 белка eP2, наоборот, гидрофильна. Обе спирали 3 белков eP1 и eP2 не участвуют в про­ цессе димеризации. Ассиметричность гетеродимера eP1/P2 предпо­ лагает, что гетеродимеры eP1/P2 в пентамерном комплексе распола­ гаются в последовательности eP2–eP1:eP1–eP2 [66] .

В архейных рибосомах белки aL10 и aP1 присутствуют в виде комплекса aL10–aP1 в соотношении 1 : 4 или 1 : 6, как было показано с помощью масс­спектрометрии [36, 59]. Рибосомы гипертермофиль­ ных архей содержат только гептамерный комплекс aL10•(aP1)6, тогда как в мезофильных археях было обнаружено две популяции рибосом, которые содержали либо пентамерный, либо гептамерный комплекс aL10–aP1. Соотношение рибосом с пентамерным и гептамерным комплексом изменяется в процессе жизненного цикла клеток. На начальной стадии роста клеток рибосомы содержат преимущественно пентамерный комплекс aL10•(aP1)4. При переходе клеток в стацио­ нарную фазу роста изменяется соотношение белков aL10 и aP1, и преобладают рибосомы с гептамерным комплексом aL10•(aP1)6 [36] .

Архейные рибосомы, содержащие тримерный комплекс aL10•(aP1)2, имеют активность гидролиза ГТФ и синтеза полифенилаланина на уровне 55% от активности рибосом с гептамерным комплексом .

Активность рибосом с пентамерным комплексом составляет около 95%. Таким образом, пентамерный и гептамерный комплексы aL10­ aP1 не сильно отличаются по доступности для факторов трансля­ ции. Возможно, третий димер архейного белка aP1 необходим для полноценного функционирования архейной рибосомы при темпе­ ратуре близкой к оптимальной температуре роста (например, для P .

horicoshii составляет 95°C) [59] .

40 И.В.Митрошин и соавт .

Рибосомные белки a/eL10 Эукариотический белок eL10 содержит два структурных элемента, с которыми связываются два eP1­eP2 гетеродимера [75]. С помощью удаления C­концевых аминокислотных остатков было показано, что первый сайт связывания гетеродимера eP1­eP2 расположен в районе 205–230 а. о., а второй сайт – 240–255 а. о. (нумерация по Bombyx mori) [75, 76] .

Архейный и эукариотический рибосомные белки a/eL10 подобно бактериальному белку bL10 являются посредниками между архейным aP1, эукариотическим eP1/P2 и рибосомой. Архейный и эукарио­ тический белки a/eL10 состоят из трех доменов (рис. 3). Консерва­ тивный среди всех доменов жизни N­концевой домен 1 белка a/eL10 является РНК­связывающим доменом, который ответственен за прикрепление рибосомного комплекса aL10–aP1 или eL10–eP1/P2 к большой субчастице рибосомы. Второй (специфичный домен) обна­ ружен только в составе белков a/eL10 архей и эукариот и отсутствует в бактериальном аналоге [77, 78]. С­концевой спиральный домен служит местом посадки для двух гетеродимеров eP1–eP2 в случае эукариотического P­выступа и двух или трех гомодимеров aP1 в случае архейного P­выступа .

В 2010 году были определены кристаллические структуры архей­ ного рибосомного комплекса белка aL10 с димерами N­концевого домена белка aP1 из P. horicoshii (разрешение 2.1 ) [67] и двухдо­ менного N­концевого фрагмента архейного рибосомного белка aL10 (aL10NTF) из Methanococcus jannaschii (разрешение 1.6 ) [77] .

N­концевой домен 1 архейного белка aL10 состоит из двух частей, которые соответствуют аминокислотным остаткам 1–111 и 192–206 (нумерация по M. jannaschii) [67, 77] .

Второй домен белка aL10 является вставкой в первый и содержит аминокислотные остатки 115–188. Оба домена соединены перетяжкой, которая состоит из двух противоположно направленных ­тяжей. Домен 2 может смещаться относительно домена 1 на 13 [77]. С­концевой домен белка aL10 в два раза длиннее (рис. 3) бактериального bL10CTD и отличается от него по структуре. Он содержит три независимые ­спирали, соеди­ ненные короткой перетяжкой из 6 а. о. С каждой спиралью С­конце­ вого домена белка aL10 связывается один димер белка аP1 [67] .

Пространственная структура изолированного эукариотического белка eL10 не определена. На основании высокой гомологии архей­ ного и эукариотического белков a/eL10 и кристаллической структуры архейного белка aL10 в комплексе с димерами N­концевых доменов Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 41 Рис. 3. Схема последовательностей полипептидных цепей рибосомных белков uL10 .

Черным цветом окрашен N­концевой домен 1, светло­серым – домен 2, серым – С­концевой домен. Белым прямоугольником со сплошной линией обоз­ начена дополнительная аминокислотная последовательность термофильных бактериальных белков bL10 .

белка aP1 была предсказана модель структуры эукариотического белка eL10 в комплексе с N­концевыми доменами гетеродимера eP1–eP2 [79]. В данной модели была предсказана структура только N­концевого домена 1 и С­концевого домена белка eL10, поэтому определение структуры его домена 2 до сих пор остается актуальным .

Участок архейного и эукариотического белков a/eL10, соответст­ вующий домену 2, обеспечивает специфичность взаимодействия рибосомы с эукариотическими или архейными факторами транс­ ляции, но не с бактериальными. Удаление этого домена приводит к снижению до 40% фактор­зависимого гидролиза ГТФ и уровня синтеза полифенилаланина гибридными рибосомами E. coli с эука­ риотическими и архейными факторами трансляции [67] .

N­концевой домен 1 архейного белка aL10 взаимодействует со спиралью H42 домена II 23S рРНК подобно связыванию бактериаль­ ного белка bL10 с 23S рРНК, причем основной контакт между архей­ ным белком aL10 и рРНК также приходится на сахаро­фосфатный остов РНК (мотив «излом–поворот») [34] .

Первые 20 аминокислотных остатков эукариотического белка eL10 необходимы для связывания с 26/28S рРНК [76]. Между 40 и 70 а. о. располагается аргинин­богатый участок, который обеспечивает дополнительный контакт с рРНК [80]. В комплексе с белками eP1/P2 повышается сродство белка eL10 к рРНК [81]. Наиболее вероятно, что eP1/P2 выполняют дополнительную функцию модулятора при связывании белка eL10 с рибосомой .

42 И.В.Митрошин и соавт .

Рибосомные белки a/eL11 Эукариотический рибосомный белок eL11 является функциональным аналогом архейного и бактериального белков a/bL11. С помощью химического сшивания соседних молекул показано, что эукариоти­ ческий белок eL11 взаимодействует с эукариотическими факторами элонгации eEF1 и eEF2 [82]. Белок eL11 связывается с 26/28S рРНК в участке, эквивалентном участку связывания архейного/бактериаль­ ного белков a/bL11 на 23S рРНК .

Стоит заметить, что на данный момент пространственная струк­ тура изолированного эукариотического белка eL11 не определена .

Известна только модель eL11 в составе дрожжевой рибосомы в виде полиаланиновой цепи [83] .

Архейный белок aL11 гомологичен бактериальному белку bL11 [65]. В настоящее время пространственная структура архейного белка aL11 частично визуализирована только в составе 50S субчастицы рибосомы из H. marismortui [84]. Белок aL11 состоит из двух доменов, соединенных короткой перетяжкой. Из­за плохого качества электрон­ ной плотности в районе N­концевого домена детали структуры этого домена плохо различимы [84] .

Архейный aL11 посредством C­концевого домена связывается со спиралями H43–44 домена II 23S рРНК. Сайты связывания архейных aL10 и aL11 расположены на рРНК рядом. Важно отметить, что архей­ ный белок aL11 стимулирует связывание архейного aL10 с рРНК только при высоких температурах (70°С), тогда как при низких темпе­ ратурах (37°С) стимулирования не наблюдается [85]. РНК­связы­ вающая поверхность белка aL11 образована спиралью 5 и петлями 3­4 и 4­5, которые расположены по бокам спирали 5. Спираль 5 С­концевого домена образует протяженную сеть взаимодействий с 23S рРНК, располагаясь вдоль малого желобка рРНК [84] .

N­концевой домен архейного aL11 способствует доставке факто­ ров элонгации и терминации трансляции в ГТФаза­связывающий центр архейной рибосомы. Было показано, что архейная рибосома восприимчива к пептидным антибиотикам тиострептону и микрокок­ цину. Наиболее вероятно, что архейный белок aL11 может быть мишенью для данного класса антибиотиков [86] .

Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 43

IV. ВЗАИМОЗАМЕНЯЕМОСТЬ БОКОВОГО ВЫСТУПА

БАКТЕРИЙ, АРХЕЙ И ЭУКАРИОТ

После того, как было показано, что L12/P­выступ является функцио­ нально важным морфологическим элементом рибосом бактерий, архей и эукариот, были предприняты первые попытки создать гиб­ ридную рибосому в условиях in vitro. В 1981 году была впервые реконструирована первая эукариотическая гибридная рибосома .

После удаления белков eL10, eL11 и eP1/P2 с эукариотической рибо­ сомы экстракцией смесью NH4Cl/этанол к «вакантной» рибосоме были добавлены соответствующие бактериальные белки. Однако полученная гибридная рибосома оказалась неактивна [87]. Также бел­ ковый комплекс aL10–aP1 архейной рибосомы был заменен на бакте­ риальный комплекс bL10–bL12, и, наоборот, комплекс bL10–bL12 бак­ териальной рибосомы на архейный комплекс aL10­aP1. С помощью электронной микроскопии было продемонстрировано наличие L12/P­ выступа в гибридных рибосомах, который образован bL10–bL12 или aL10–aP1 комплексами, но функциональная активность таких рибосом не проверялась [88] .

Впервые активную гибридную бактериальную рибосому из E. coli с эукариотическим P­выступом рибосомы крысы удалось получить в лаборатории Hachimori [89]. Данная замена изменяет специфичность связывания бактериального EF2 на связывание эукариотического eEF2 и стимулирует ГТФазную активность последнего. Уровень гид­ ролиза ГТФ на eEF2 в гибридной рибосоме сопоставим с уровнем гидролиза ГТФ на eEF2 в эукариотической 80S рибосоме [68]. При этом активность гибридной рибосомы при синтезе полифенилала­ нина в присутствии эукариотических факторов элонгации eEF1 и eEF2 находится на том же уровне, как для эукариотической рибосомы [68, 76] .

Архейные белки P­выступа, как и их эукариотические гомологи, способны замещать бактериальные белки L12­выступа [68]. Такая замена приводит к тому, что реконструированная гибридная рибосома становится доступной как для архейных факторов элонгации, так и для эукариотических, но не для бактериальных факторов элонгации .

Активность гидролиза ГТФ и синтеза полифенилаланина гибрид­ ной рибосомы, содержащей архейные белки бокового выступа, в присутствии эукариотических факторов элонгации сопоставима с таковыми для гибридной рибосомы, в которой бактериальный L12­выступ заменен на эукариотический аналог. Стоит отметить, что синтез полифенилаланина и ГТФазная активность гибридной 44 И.В.Митрошин и соавт .

рибосомы с архейным P­выступом одинаковы с эукариотическими и архейными факторами элонгации [68] .

Белки L12­выступа митохондрий человека имеют высокую степень гомологии с соответствующими бактериальными белками .

L12­выступ митохондрий способен заменить аналогичный выступ на рибосоме E. coli с образованием функционально активной гибрид­ ной рибосомы [90]. Получившаяся гибридная рибосома с митохонд­ риальным L12­выступом имеет высокую активность синтеза поли­ фенилаланина в присутствии бактериальных или митохондриальных факторов элонгации .

Таким образом, с помощью этих экспериментов была продемонст­ рирована ключевая роль белков L12/P­выступа в специфическом узна­ вании трансляционных факторов. uL10–L12­подобный комплекс, но не белки uL11, ответственен за специфичность взаимодействия между рибосомой и факторами трансляции. Важно отметить, что изменение в специфичном узнавании факторов элонгации, вызванное замещением белков бокового выступа на их гомологи (или аналоги) на рибосоме, сопровождается изменениями в структуре участков 23S/28S рРНК в области сарцин­рициновой петли и спиралей H43–44 [91] .

V. КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

L12/P-ВЫСТУПА В СОСТАВЕ РИБОСОМ Использование рентгеноструктурного анализа открыло возможность определения не только важных морфологических деталей рибосомы, но и внутренней структуры рибосомы, третичных структур рибо­ сомных РНК в составе рибосомы, расположения и структур рибо­ сомных белков. Первые кристаллы рибосом, пригодные для рентге­ ноструктурного анализа, были получены еще в конце 1980­х годов .

Но только в 2000 году была впервые определена кристаллическая структура 50S субчастицы рибосомы из археи H. marismortui с высо­ ким разрешением [38]. Эта структура содержала 2711 из 2923 нуклео­ тидных остатков 23S рРНК, полностью 5S рРНК и структуры для 27 из 31 рибосомных белков. Электронная плотность для белков aL1, aL10, aL11 и aP1 отсутствовала, хотя ранее они были локализованы в составе этой рибосомной субчастицы с помощью электронной микроскопии и дифракционных данных низкого разрешения [92] .

В 2009 году в составе 70S бактериальной рибосомы в комплексе с EF2 из T. thermophilus была определена структура L12­выступа [93]. Фактор элонгации EF2 напрямую взаимодействует с bL11 и C­концевым доменом bL12. Из­за низкого качества электронной Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 45 плотности в районе бокового выступа структура белкового комплекса bL10­bL12 была определена в виде полиаланиновой цепи. Спираль 8 белка bL10 изгибается по сравнению с ее положением в структуре изолированного комплекса bL10­bL12NTD, позволяя C­концевому домену bL12CTD взаимодействовать и с N­концевым доменом bL11, и с G'­доменом EF2. В свою очередь, N­концевой домен bL11 вместе с нуклеотидными остатками 1067 и 1095 23S рРНК взаимодействует с доменом V фактора элонгации EF2 [93] .

В составе 80S эукариотической рибосомы из S. cerevisiae P­выступ был частично визуализирован [83]. Белки этого выступа удалось вписать в карту электронной плотности только в виде полиалани­ новых цепей. Исключение составил консервативный N­концевой РНК­связывающий домен 1 белка eL10, структура которого была определена полностью. Общая укладка eL10NTD совпадает с уклад­ ками N­концевых доменов бактериального bL10 и архейного aL10 .

Наиболее полную структуру архейного P­выступа удалось опре­ делить при переуточнении структуры 50S субчастицы рибосомы из археи H. marismortui в 2013 году [84]. В результате переуточнения был визуализирован не только P­выступ, но и некоторые рибосомные компоненты, структура которых не была известна (например, спе­ цифический для архей белок LX). Уточнение структуры большой субчастицы позволило интерпретировать электронную плотность для приблизительно 2/3 белка aL10 (C­концевой домен в виде поли­ аланиновой цепи) и одного димера N­концевого домена aP1 (как полиаланиновая цепь), а также дополнить структуру белка aL11 .

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Боковой L12/P­выступ играет ключевую роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции. Структурная организация этого выступа подобна среди доменов жизни, несмотря на то, что входящие в его состав рибосомные белки отличаются: белки бактериального L12­выступа имеют низкую гомологию и по последовательности и по структуре с соответствующими белками, формирующими Р­выступ в археях и эукариотах .

За последнее десятилетие произошел огромный прорыв в опреде­ лении пространственных структур рибосомы и изолированных белков данного бокового выступа, но до сих пор остаются пробелы в понима­ нии взаимодействия этих белков между собой и с высокомолекуляр­ ной рРНК. В данном обзоре рассматриваются работы последних лет, посвященные данной теме .

46 И.В.Митрошин и соавт .

–  –  –






Похожие работы:

«МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (МГС) INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION . METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC) ГОСТ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ ISO 1 0 7 1 8 СТАНДАРТ ПРОБКИ КОРКОВЫЕ Подсчет коло...»

«УДК 550.47 М.А. Солодухина ОСОБЕННОСТИ ПОГЛОЩЕНИЯ МЫШЬЯКА РАСТЕНИЯМИ НА ТЕРРИТОРИИ ПРИРОДНОЙ ГЕОХИМИЧЕСКОЙ АНОМАЛИИ ЧИТИНСКОЙ ОБЛАСТИ Рассмотрены некоторые особенности поглощения мышьяка орг...»

«Никитина Лариса Валерьевна ВКЛАД НЕОДНОРОДНОСТИ БЕЛКОВ САРКОМЕРА В СОКРАТИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ МИОКАРДА И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЮ 03.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург 2014 Работа выполнена в лабор...»

«КОНТРОЛЬНО-КАССОВАЯ ТЕХНИКА УМКА-01-ФА Исполнение STANDART РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ Содержание 1. Общие указания 1.1.Взаимодействие с ФНС через ОФД 2. Основные сведения о ККТ 3. Описание ККТ 4. Маркировка ККТ 5. Комплек...»

«Оценочный лист пояснительной записки творческого проекта lllрифТ _ Класс ~~ш ~ lZВ#fft? Тема проекта 9Шптza~.~4шJ ~ 11 k Кол-во По факту Критерии оценки проекта баллов I Общее оформление Качество исследования (актуальность; обоснование.3 проблемы; формулир...»

«ЛОГВИНОВА Дарья Сергеевна РОЛЬ "СУЩЕСТВЕННЫХ" ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА В ПРОЦЕССЕ РАБОТЫ МИОЗИНОВОЙ ГОЛОВКИ 03.01.04 Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2018 Работа выполнена в лаборатории структурной биохимии белка...»

«Т.И.Ульянкина ГУМАНИТАРНЫЙ ФОНД Б.А.БАХМЕТЕВА (США) Ульянкина Татьяна Ивановна — доктор биологических наук, главный научный сотрудник ИИЕТ РАН. Интеллектуальное наследие послеоктябрьской российской эмиграции помимо культурного и научног...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.