WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

Pages:   || 2 |

«Маркина Елена Александровна ВЛИЯНИЕ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА И МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ МИКРОГРАВИТАЦИИ НА НИШУ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ГРЫЗУНОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Государственный научный центр Российской Федерации –

Институт медико-биологических проблем

Российской академии наук

На правах рукописи

Маркина

Елена Александровна

ВЛИЯНИЕ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА И МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ

МИКРОГРАВИТАЦИИ НА НИШУ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО

МОЗГА ГРЫЗУНОВ

14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна Москва - 2017

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 Костный мозг – депо стволовых клеток 1.1. 9 Ниша стволовых клеток костного мозга 1.2. 11 Понятие ниша стволовой клетки 1.2.1. 11 Клеточный состав ниши прогениторных гемопоэтических клеток 1.2.2 .

костного мозга 13 Негемопоэтический (стромальный) компонент ниши костного мозга 1.2.3. 14 Клетки остеобластического ряда 1.2.3.1. 14 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки 1.2.3.2. 16 Эндотелиальные и периваскулярные клетки 1.2.3.3. 19 Нервные и глиальные клетки 1.2.3.4. 20 Адипоциты 1.2.3.5. 21 Гемопоэтический компонент ниши костного мозга 1.2.4. 21 Остеокласты

–  –  –



ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время основной задачей биологических экспериментов в космических полетах является изучение фундаментальных механизмов адаптации земных организмов к воздействию комплекса факторов (главным образом, невесомости и радиационного облучения) на различных уровнях организации: клеточном, тканевом, органном. Наиболее остро на изменение условий во время полетов реагируют костно-мышечная система, вестибулярный аппарат, нервная, эндокринная и сердечно-сосудистая системы, нарушаются процессы кроветворения (в кн. «Основы космической биологии и медицины» под ред. О.Г. Газенко, М .

Кальвина, 1975; в кн. «Человек в космическом полете» под ред. В.В. Антипова, А.И .

Григорьева, К. Лич Хантун, 1997; Smith S.M., Heer M. et al., 2015) .

Одной из важнейших систем организма, обеспечивающей, в том числе, адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды, является костный мозг, который представляет собой депо стволовых и прогениторных клеток мезенхимального происхождения, относящихся к гемопоэтическому и стромальному дифферону, функционирование которых обеспечивает физиологический гемопоэз и гомеостаз костной ткани. От состояния этого компартмента в значительной мере зависит адаптация организма к неблагоприятному воздействию факторов космического полета и последующему возвращению к условиям нормальной гравитации .

Значительный вклад в понимание процессов, происходящих в костном мозге в условиях невесомости, вносят биологические эксперименты, которые проводятся на беспилотных летательных аппаратах (биоспутниках). Очень важным является тот факт, что в отличие от изучения реакции физиологических систем организма человека в пилотируемых полетах, где активно применяется система профилактики неблагоприятного действия невесомости ионизирующего излучения и др., после полета животных есть возможность оценить реальные эффекты факторов полета .



В ходе предыдущих исследований в рамках программы «Бион» (1973-1997 гг.) » после 7–22 суточных полетов крыс Wistar на биоспутниках «Космос», в экспериментах, проводимых на «Спэйслэб-3», «СЛС-1», «СЛС-2 были получены данные о том, что во время космического полета происходит угнетение эритропоэза в костном мозге и селезенке крыс, в том числе эритроидных предшественников, с одновременным уменьшением числа ретикулоцитов в крови, лимфопоэза при усилении гранулоцитарно-макрофагального ростка на фоне снижения числа костномозговых гемических прогениторов крыс (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977;

Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В.,1981; Vacek A., Tkadlecek L. et al., 1982; Швец В.Н., Вацек А., и др., 1984; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Vacek A., Bueverova E.I. et al., 1990;

Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991; Серова Л.В., Чельная Н.А., Иванова С.Я., 1993; Udden M.M., Driscoll T.B. et al., 1995) .

В отличие от гемопоэтического дифферона данных о влиянии факторов космического полета на стромальные клетки-предшественники, или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) пока немного. Было показано негативное влияние на негемопоэтические прогениторные клетки костного мозга, в том числе уменьшение числа костно-мозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у крыс после полета (Wronski T.J., Morey E.R., 1983; Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Vacek A., Bueverova E.I. et al., 1990) .

Более поздние исследования на борту МКС (НАСА, миссия STS-131, 2010) показали, что в условиях микрогравитации угнетается дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток, что сопровождается увеличением числа малодифференцированных предшественников .

Молекулярно-генетические исследования выявили снижение экспрессии маркерных генов мезенхимальных клеток костного мозга (Blaber E.A., Dvorochkin N. et al., 2013; Blaber E., Sato K., Almeida E. A.C., 2014) .

Несмотря на большой объем накопленных данных, полученных в наземных моделях, имитирующих эффекты космического полета, до сих пор не предоставляется возможным в полной мере объяснить патогенез действия разных факторов (микрогравитация, ионизирующее излучение) на прогениторные клетки костного мозга. Более того, экспериментальные работы по изучению комбинированного действия разных экстремальных факторов на организм только начинаются (Штемберг А.С., 2014; Chowdhury P., Akel N. et al., 2016; Pani G., Verslegers M. et al., 2016) .

Возобновленная программа «Бион» (запуск космического аппарата «Бион-М1» состоялся в 2013 году) позволила провести анализ влияния факторов длительного (до 30 суток) космического полета на физиологические системы организма млекопитающих (мышей), а также оценить процессы восстановления в период реадаптации к земным условиям(Сычев В.Н., Ильин Е.А. и др., 2014). После космического полета установлены существенные патологические морфофункциональные изменения нервной, иммунной, костно-мышечной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, эндокринной, кроветворной и дыхательной систем .





Изменялась работа внутриклеточных ферментативных систем (цитохромов Р450), кроме этого во время космического полета происходило ремоделирование соединительной ткани, прояснена динамика их восстановления (В кн. «Космический научный проект «Бион-М1»», под ред. А.И .

Григорьева, 2016) .

Исследования изменений потенциала малодифференцированных стромальных предшественников и специфика их взаимодействия с гемопоэтическими предшественниками, локализованными в костном мозге, в условиях длительного космического полета и моделировании эффектов основных его факторов, особенно при их комбинированном действии, являются актуальными с точки зрения понимания физиологии регенеративных процессов иммунной системы, эритропоэза и сохранения стромального компонента в условиях длительного космического полета .

Цель работы: Изучение влияния факторов космического полета и моделирования их эффектов на основные морфофункциональные параметры прогениторных клеток костного мозга грызунов .

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Охарактеризовать функциональные и фенотипические особенности стромальных предшественников и гемопоэтических клеток костного мозга мышей после 30суточного полета биоспутника «Бион-М1»;

2. Изучить морфофункциональное состояние стромальных предшественников и гемопоэтических клеток костного мозга крыс после 30-суточного антиортостатического вывешивания;

3. Оценить комбинированное действие факторов опорной разгрузки и ионизирующего излучения на нишу прогениторных клеток костного мозга крыс;

4. Исследовать процессы реадаптации ниши прогениторных клеток костного мозга грызунов после длительного (30-суточного) космического полета и моделирования эффектов микрогравитации и космического облучения .

Научная новизна

Впервые в первичной культуре охарактеризована популяция клеток из костного мозга большеберцовой кости мышей линии C57Bl/6N после 30-суточного космического полета на борту биоспутника «Бион-М1» и 30-суточного отставленного наземного контрольного эксперимента. Анализ in vitro не выявил повреждения пула стромальных предшественников, в то же время были нарушены процессы гранулоцито- и эритропоэза. Установлено, что 7суточного периода реадаптации недостаточно для полного восстановления гемопоэза .

Впервые исследована популяция клеток костного мозга бедренной кости крыс линии после 30-суточного антиортостатического вывешивания и 6-кратного Wistar фракционированного -облучения в суммарной дозе 3 Гр, а также последующего 2-недельного периода восстановления. Для стромальных предшественников в условиях опорной разгрузки и облучения показано изменение иммунофенотипа, способности к формированию колоний, остео- и адипокоммитирования .

Впервые обнаружен интерферирующий эффект действия опорной разгрузки и ионизирующего излучения на клетки ниши костного мозга крыс линии Wistar, проявляющийся в увеличении радиочувствительности стромальных предшественников, и ее снижении у гемопоэтических предшественников .

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов космического полета на нишу прогениторных клеток костного мозга млекопитающих. Установлено, что длительный космический полет не вызывает необратимых негативных изменений морфологии и функциональной активности прогениторных клеток ниши костного мозга. При этом на 7 сутки реадаптации не происходит полного восстановления функциональной активности прогениторных клеток костного мозга после 30-суточного космического полета. Период восстановления прогениторных клеток костного мозга разных дифферонов отличается по продолжительности, что позволяет предположить необходимость изучения нескольких этапов реадаптации, начиная от 1 – 3 суток до 2 – 3 недель .

При моделировании факторов космического полета (микрогравитация и радиационное облучение) был выявлен интерферирующий эффект действия этих факторов. Установлено, что в условиях опорной разгрузки изменяется чувствительность прогениторных клеток костного мозга к действию фракционированного - излучения .

Предложен и успешно апробирован метод комплексного анализа in vitro функциональной активности стволовых и прогениторных клеток из костного мозга млекопитающих после длительного космического полета и моделирования его эффектов, а также процессов реадаптации к нормальным условиям. Полученные результаты могут быть использованы при подготовке курса лекций по космической биологии и медицине для студентов и аспирантов .

–  –  –

После 30-суточного космического полета на биоспутнике «Бион-М1» происходит 1 .

угнетение эритроидного и гранулоцитарного ростков гемопоэза на фоне функциональной сохранности пула мультипотентных стромальных стволовых клеток .

Период 7-дневной реадаптации не обеспечивает полного восстановления пула 2 .

гемопоэтических клеток костного мозга мышей линии C57Bl/6N после длительного космического полета .

Выявлен интерферирующий эффект действия опорной разгрузки и -излучения на 3 .

клетки ниши костного мозга крыс линии Wistar, выраженный в снижении радиорезистентности стромальных предшественников костного мозга повышении радиорезистентности гемопоэтических стволовых клеток. В течение 14-ти суток реадаптации происходит восстановление функциональной активности пула стромальных и гемопоэтических предшественников .

–  –  –

Костный мозг, расположенный интеростально, является центральным органом кроветворения у всех позвоночных, за исключением рыб, у которых этот процесс происходит в почках (Hartenstein V., 2006). Он является одним из самых крупных органов в организме наряду со скелетом, кожей и жировой тканью (Snyder W .

S., Cook M.J. et al., 1975; Steiner R.M., Mitchell D.G. et al.,1993). Морфологически костный мозг разделяют на красный (гемопоэтический) (ККМ) и желтый (жировой) костный мозг (ЖКМ) (Snyder W.S., Cook M.J. et al., 1975; Мяделец О.Д., 2002; Hwang S., Panicek D.M., 2007). 60% клеток ККМ – это клетки гемопоэтического дифферона. 40% – включают в себя стромальные, эндотелиальные, гладкомышечные, глиальные и нервные клетки. При биохимическом анализе ККМ выявлен его состав: 40 – 60% – липиды, 30 – 40% – вода и 10 – 20% – белки. ЖКМ на 95% состоит из жировой ткани, включающей в себя 80% липидов, 15% воды и 5% белков (Snyder W.S., Cook M.J. et al., 1975;

Мяделец О.Д., 2002; Hwang S., Panicek D.M., 2007) .

После рождения костный мозг представлен, в основном, ККМ, но с возрастом ККМ начинает замещаться ЖКМ, оставаясь в отделах костной системы, представленных губчатой костной ткани (череп, грудина, позвонки, ключицы, лопатки, эпифизы длинных трубчатых костей конечностей, кости таза (Hartsock R.J., Smith E.B., Petty C.S., 1965; Мяделец О.Д., 2002) .

В ККМ находится большая часть кроветворных клеток-предшественников, протекают процессы лимфо- и миелопоэза. Несмотря на территориальную разобщенность, костный мозг функционирует как единый орган благодаря клеточным и гуморальным факторам (Мяделец О.Д., 2002). Во взрослом организме возможно обратное перерождение ЖКМ в ККМ, когда для нормального функционального состояния организму требуется усиления гемопоэза, например, при кровопотере, хроническом курении, ожирении, беге на длинные (марафонные) дистанции и т.п. (Shellock F.G., Morris E. et al., 1992; Poulton T.B., Murphy W.D. et al., 1993). Кроме этого, гиперплазию ККМ могут вызывать хронические заболевания, такие как анемия различного генеза, за исключением апластической, гемоглобулинопатии и хронические инфекции (Stabler A., Doma A.B. et al., 2000). Это говорит о том, что в состав ЖКМ, очевидно, входят покоящиеся гемопоэтические предшественники (Wilson A., Oser G.M., Jaworski M., 2008; King K.Y. Goodell M.A., 2011), активизирующиеся при возникновении стресс-реакции, что сопровождается появлением в «желтом» костном мозге очагов кроветворения и превращением его в «красный» .

Таким образом, ККМ и ЖКМ это разное функциональное состояние одного органа .

Клеточные элементы стромы мышечной ткани Рисунок 1. Строение костного мозга .

cb – минерализованный костный матрикс; ob – остеобласты; en – эндотелий; cp – капилляр; sv – венозный синус; rc – ретикулярные клетки; hsc – гемопоэтические стволовые клетки; bp – постмитотические гемопоэтические прогениторы; tc – тромбоциты; mgc – мегакариоциты; lc – лейкоциты; fc – адипоциты. (Greep &Weiss 1973) .

Строение костного мозга схоже с организацией других паренхиматозных органов .

Строма представлена костными балками и ретикулярной тканью. В ретикулярной ткани локализуется множество кровеносных сосудов: артериол, капилляров и венозных синусов, пористая стенка которых образована эндотелиальными клетками, лишенных базальной мембраны. Кроме этого в состав ретикулярной ткани входят макрофаги, остеобласты, образующие эндост – граница между минеральным костным матриксом и паренхимой костного мозга, мультипотентные стромальные мезенхимальные клетки (также называемые ретикулярными), адипоциты (рисунок 1). Эндотелиальные клетки, макрофаги, остеобласты и ретикулярные клетки, пронизывающие пространство между сосудами и эндостом создают трехмерный матрикс, который наряду с жировой тканью костного мозга образуют комплекс, поддерживающий паренхиму костного мозга, состоящей из кроветворных клеток на разной стадии дифференцировки (Fazeli P.K., Horowitz M.C. et al., 2013). В этом комплексе формируется микроокружение, регулирующее кроветворение (Hartenstein V., 2006). После потери контакта с клетками стромы ГСК (гемопоэтические стволовые клетки) начинают свой путь дифференцировки с коммитированных мультипотентных прогениторов, становясь предшественниками лимфоидных клеток, эритроцитов, тромбоцитов, гранулоцитов/моноцитов и гранулоцитов. На этой стадии гемопоэтические предшественники пролиферируют, образуя колонии разных ростков. Зрелые клетки, через поры в стенках венозных синусов попадают в кровоток. Незрелые лимфоидные предшественники покидают костный мозг, с током крови достигают тимуса и других лимфоидных органов, где они проходят последующие стадии дифференцировки (Hartenstein V., 2006). Таким образом, стромальный компартмент создает нишу для ГСК .

Ниша стволовых клеток костного мозга 1.2 .

1.2.1. Понятие ниша стволовой клетки Термин – «Ниша стволовой клетки» был предложен Р. Скофилдом в 1978 г. (Schofield R., 1978). В настоящее время ниша определяется, как ограниченное специализированное микроокружение, которое интегрирует и осуществляет межклеточные сигналы для регуляции и поддержания гомеостаза принадлежащим ей стволовым клеткам. Ниша рассматривается как анатомическая субъединица тканевого компартмента (рисунок 2). По современным представлениям ниша является связующим звеном контроля и регуляции между активностью стволовой клетки и потребностями организма (Voog J., Jones D. L., 2010; Lander A.D., Kimble J .

et al., 2012; Bilder D., O'Brien L. E., 2013; Wang C., Wen P. et al., 2013) .

Рисунок 2. Схема строения ниши стволовых клеток .

* Основными свойствами ниши является обеспечение жизнедеятельности стволовых клеток. Благодаря её анатомическим особенностям становится возможным взаимный контроль * http://pimm.files.wordpress.com/2008/04/nichejonas.png?w=350&h=316 и обмен информацией между клетками, координация их действия (Ema H., Suda T., 2012) .

Межклеточное взаимодействие разных популяций, контакт с компонентами внеклеточного матрикса, положение и хоуминг клеток ниши (Lim J.G.Y., Fuller M.T., 2012;

Brizzi M.F., Tarone G., Defilippi P., 2012) осуществляется за счет секретируемых цитокинов, хемокинов, сигнальных молекул, микроРНК (Laine S.K., Hentunen T., Laitala-Leinonen T., 2012;

Lechman E.R., Gentner B. et al., 2012; Breslin P., Volk A.S.J., Zhang J., 2013). Кроме этого важную роль в организации ниши играют парциальное давление кислорода, рН среды, концентрация ионов (Са2+) (Kaewsuwan S., Song Y.S. et al., 2012) .

Известны и хорошо изучены несколько ниш для разных типов стволовых клеток (таблица 1) .

Таблица 1. Ниши стволовых клеток взрослого организма млекопитающих

–  –  –

1.2.2. Клеточный состав ниши прогениторных гемопоэтических клеток костного мозга Началом исследования ниши костного мозга можно считать период конца XIX начала XX века, когда немецким врачом-гематологом Pappenheim A. в 1896 году было введено понятия гемопоэза (цит. по Pappenheim A. https://www.onkopedia.com). Он предположил, что все зрелые клетки крови связаны между собой общим происхождением от одного общего типа клеток (стволовые клетки). В 1909 г. Maximow A. предположил существование общей стволовой клетки, морфологически напоминающей лимфоцит по (цит. Maximow A .

https://www.onkopedia.com). Таким образом, была сформирована гипотеза кроветворной стволовой клетки. Для фактического подтверждения этой гипотезы потребовалось около пятидесяти лет .

Работы Till J.E. и McCulloch E.A. показали, что одиночные клетки могут давать начало потомкам разных линий гемопоэза без потери мультипотентности клетки-предшественницы (Till J.E, McCulloch E.A. 1961; Siminovitch L., McCulloch E.A., Till J.E. 1963, 1964). Более того, ими был разработан способ исследования гемопоэтических клеток ex vivo, так называемый метод селезеночных колоний. В 70-е годы XX века расхождение данных, полученных методом селезеночных колоний и методом костномозговых колоний (трансплантация костного мозга облученным животным), привело к формированию гипотезы ниши для стволовых клеток (Schofield R., 1978). Ee автор, Schofield R. предположил, что специализированные ниши костного мозга способствовали сохранению свойств трансплантированных стволовых клеток для восстановления гемопоэза у облученных животных (Schofield R., 1978). В это же время исследования другой группы ученых показали, что сокультивирование мезенхимальных стромальных клеток и примитивных гемопоэтических стволовых клеток приводит к усилению функциональной активности последних (Dexter T.M., Allen T.D., Lajha L.G., 1977). Изучение срезов длинных трубчатых костей показало, что ранние предшественники гемопоэза локализуются в области эндоста (Lord B.I., Testa N.G., Hendry J.H., 1975). Последующие исследования in vitro и в моделях на экспериментальных животных (мышах) показали, что клетки стромы (остеобласты, ММСК и др.) влияют на функциональную активность ранних предшественников гемопоэза выработкой специфических цитокинов (Taichman R.S., Emerson S.G., 1994; Calvi L.M., Adams G.B. et al., 2003; Park D., Spencer J.A. et al., 2012) .

До сих пор нет единого мнения о расположении ГСК в костном мозге. Одни исследования, основанные на опытах по трансплантации обогащенной популяции меченых ГСК, показали, что преимущественно место локализации ГСК – это зона эндоста (Zhang J., Niu C. et al., 2003; Wilson A., Murphy M.J. et al., 2004; Xie Y., Yin T. et al., 2009). Другие (Lin-CD150+CD48CD41) демонстрируют, что при иммунофенотипировании in situ большинство ГСК находятся в тесном контакте с эндотелиальными клетками венозных синусов костного мозга (Kiel M.J., Yilmaz O.H. et al., 2005), CXCL12-положительными ретикулярными клетками (CAR-клетки) (Sugiyama T., Kohara H. et al., 2006) и nestin-GFP+-клетками (MendezFerrer S., Michurina T.V. et al., 2010), т.е. располагаются в периваскулярном пространстве. На микрофотографиях длинных трубчатых костей мышей, полученных при микроскопии с трехмерным изображением высокого разрешения, очевидна высокая васкуляризация зоны эндоста (Nombela-Arrieta C., Pivarnik G. et al., 2013) и большинство ГСК, фенотипически относящиеся к периваскулярным, локализуются как в зоне эндоста, так и в отдалении от него (периваскулярно). Это наблюдение объясняет противоречивые данные, полученные ранее .

1.2.3. Негемопоэтический (стромальный) компонент ниши костного мозга

В состав стромы костного мозга взрослого организма млекопитающих входят остеобласты эндоста, располагающиеся на минерализованном матриксе; эндотелиальные клетки, формирующие артериальные капилляры и венозные синусы; ретикулярные клетки;

гладкомышечные клетки; адипоциты; макрофаги; остеокласты; ММСК; нервные клетки. Эти клетки, погруженные в сложно структурированную сеть вязкого межклеточного матрикса, образуют платформу для взаимодействия с ГСК (Klamer S., Voermans C., 2014) .

Клетки остеобластического ряда 1.2.3.1 .

Ранние исследования по локализации ГСК показали, что приоритетным месторасположением этих клеток была зона эндоста (Lord B.I., Testa N.G., Hendry J.H., 1975;

Gong J.K., 1978). Позднее исследования in vivo показали, что долгоживущая культура ГСК (длительно репопулизирующая костный мозг) располагается тонким слоем на костном матриксе губчатой костной ткани (Haylock, D.N., Williams, B. et al., 2007; Wilson A., Oser G.M .

et al., 2007). Исходя из данных о месте локализации ГСК, клетки остеобластического ряда были первым клеточным костномозговым компонентом ниши стволовых кроветворных клеток (Calvi L. M., Link D.C., 2014). Остеобласты могут поддерживать активность ГСК in vitro (Taichman R.S., Emerson S.G., 1994; Taichman R.S., Reilly M.J., Emerson S.G., 1996), кроме этого отсутствие клеток остеобластического ряда приводит к нарушению гемопоэза (Dacic S., Kalajzic et al., 2001; Visnjic D., Kalajzic et al., 2001). Результаты многочисленных исследований показывают, что остеобласты влияют на ГСК посредством выработки множества факторов, включая G-CSF, GM-CSF, IL-6, LIF, TGF, TNF и c-kit лиганд (Marusi A., Kalinowski J.F. et al., 1993; Taichman R.S., Emerson S.G., 1994; Taichman R.S., Reilly M.J., Emerson S.G., 1996; Calvi L.M., Adams G.B .



et al., 2003; Arai F., Hirao A. et al., 2004; Weber J.M., Forsythe S.R., et al., 2006; Qian H., BuzaVidas N., et al., 2007; Yoshihara H., Arai F. et al., 2007; Panaroni C., Tzeng Y., et al., 2014) .

При активации остеобластов in vivo происходит увеличение активности ГСК, проявляющейся в их функциональной и фенотипической экспансии (Calvi L.M., Adams G.B. et al., 2003; Adams G.B, Martin R.P. et al., 2007; Mendez-Ferrer S., Michurina T.V. et al., 2010;

Bromberg O., Frisch B.J. et al., 2012). В модельных экспериментах на трансгенных мышах с высоким уровнем паратиреоидного гормона, осуществляемого наличием 2,3 kb фрагмента промотора гена коллагена I типа (Calvi L.M., Sims N.A. et al., 2001) было показано, что анаболическое действия гормона на остеобласты, приводит к увеличению числа линейнокоммитированных гемопоэтических прогениторов и предшественников эндотелиальных клеток (Ballen K.K., Shpall E.J. et al., 2007; Brunner S., Theiss H.D. et al., 2007; Ballen, K.K., Mendizabal, A.M. et al., 2012). В другой модели, при инактивации гена рецептора IA костеобразующего белка, увеличение числа остеобластов и костных трабекул, образованных ими, приводило к экспансии ГСК (Zhang J., Niu C. et al., 2003) .

Однако, общее увеличение клеток остеобластического ряда не всегда приводит к усилению гемопоэза (Lymperi S., Horwood N. et al., 2008). Такие же выводы можно сделать исходя из результатов, полученных в исследованиях в модели фиброзной дисплазии на мышах (Schepers K., Hsiao E.C. et al., 2012). Это заболевание характеризуется значительным увеличением трабекулярной части кости, но при этом наблюдается угнетение гемопоэза, сопровождающееся линейно-специфическими дефектами развития предшественников мегакариоцитов, эритроцитов и миелопоэза в целом. Стоит обратить внимание, что негативные изменения остеобластического ряда в модели воспалительного артрита не влекут нарушений кроветворения и угнетения ГСК (Ma Y.D., Park C. et al., 2009). Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что клетки гетерогенной остеобластической популяции влияют на этапы гемопоэза по-разному. Клетки костной ткани в зависимости от степени их коммитированности влияют на различные свойства ГСК. In vitro было показано, что одни клоны остеобластов, в основном, вовлечены в непосредственный контакт с ГСК, т.е. определяют адгезию и «хоуминг»

гемических предшественников, в то время как другие секретируют про-ГСК цитокины (Nakamura Y., Arai F. et al., 2010) .

В настоящее время проводится много исследований, направленных на объяснение того, какие клетки остеобластического дифферона участвуют в формировании ниши ГСК костного мозга. Данные по генетической модификации ранних остеобластных предшественников и зрелых остеоцитов говорят о том, что воздействие на слабо дифференцированные клетки костной ткани приводит к изменению пролиферативной и дифференцировочной активности ГСК. Изменения физиологической активности остеоцитов не влияют на морфофункциональное состояние гемальных предшественников (Morrison S.J., Scadden D.T., 2014). Кроме этого отмечено, что высокая экспрессия Runx2, маркера остеобластов на ранних этапах дифференцировки в культуре костного мозга, сопряжена с усилением взаимодействия их с гемопоэтическими предшественниками (Chitteti B.R., Cheng Y.H. et al., 2010). У остеобластов конечной стадии дифференцировки и остеоцитов функциональная активность в отношении поддержки ГСК снижена. Активация паратиреоидного сигнального пути в этих клетках не приводит к усилению контакта с гемическими прекурсорами, несмотря на увеличение числа клеток костной ткани (Calvi L.M., Bromberg O. et al., 2012). Контакт ГСК с эндостом снижается, что сопровождается их переходом в переваскулярное пространство (Xiao L., Liu P. et al., 2009;

Yoon K.A., Cho H.S. et al., 2012). Таким образом, чем выше уровень коммитированности остеобластов, тем ниже их способность поддерживать гемопоэтические предшественники, т.е .

гетерогенность клеток остеобластического пула в формировании ниши гемопоэтических предшественников определяется уровнем их коммитированности .

Поддержка ГСК остеобластами осуществляется за счет секретируемых факторов, таких как CXCL12,остеопонтин, ангиопоэтин-1, ТРО, и SCF (Klamer S., Voermans C., 2014). Другая функция остеобластов, как компонента ниши, это хоуминг ГСК в костном мозге. Она осуществляется, в том числе, растворимыми компонентами. Например, G-CSF уменьшает число остеобластов и выработки ими CXCL12. В результате, данный процесс приводит к мобилизации ГСК и выходу их костного мозга в кровь (Petit I., Szyper-Kravitz M. et al., 2002;

Semerad C.L., Christopher M.J. et al., 2005; Christopher M.J., Link D.C., 2008) .

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки 1.2.3.2 .

ММСК – это некоммитированные стромальные клетки, которые могут давать начало клеткам тканей мезенхимного происхождения: остеобласты, хондроциты, адипоциты и др .

(Caplan A.I., 1991). ММСК были открыты в лаборатории А.Я. Фридештейна в начале 70-х годов. Они представляли собой популяцию костномозговых негемопоэтических клеток, способных формировать in vitro колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-ф) и играли важную роль в формировании ниши ГСК в костном мозге (Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S., 1970; Friedenstein A.J., Deriglasova U.F. et al., 1974). При совместной трансплантации ММСК и ГСК улучшается приживление гемопоэтических клеток, быстрее наступает период их функциональной активности (Masuda, Ageyama et al. 2009; Ahn, Park et al., 2010) .

ММСК костного мозга человека, располагающиеся периваскулярно, экспрессируют CD146 и Stro-1 и могут формировать очаги эктопического остеосинтеза при трансплантации костного мозга. Все колониеобразующие единицы фибробластов (ММСК) костного мозга человека экспрессируют CD146+ и известны, как субэндотелиальные ретикулярные клетки .

После трансплантации данные клетки способны к самоподдержанию пула и дифференцировке в остеобласты. ММСК костного мозга человека с фенотипом CD146+, CD271+ локализуются около венозных синусов субэндотелиально. ММСК, расположенные ближе к костным образованиям, экспрессируют только CD271 (Panaroni C., Tzeng Y. et al., 2014) .

Периваскулярные ММСК идентифицируются, как NG2, CD146, PDGFR- положительные клетки. Клетки с таким фенотипом обнаруживаются во многих тканях органов эмбриона и взрослого организма человека. Они обладают способностью дифференцироваться в хондроциты, адипоциты и остеобласты in vitro и миоциты in vivo (Crisan M., Yap S. et al., 2008) .

В исследованиях на мышах обнаружено, что стромальные предшественники (PS клетки), расположенные в артериальном периваскулярном пространстве около внутренней поверхности оболочки костного канала, экспрессируют PDGFR и Sca-1(Morikawa S., Mabuchi Y. et al., 2009). Экспрессия обычных мезенхимальных маркеров, таких как CD29, CD49e, CD44 и Sca-1 во всех клетках была одинаковой, в то время как CD90 (Thy1.1) и CD105 сильно варьировала (Morikawa S., Mabuchi Y. et al., 2009). При трансплантации PS клетки могли восстанавливать гемопоэтическую нишу, через усиление синтеза ангиопоэтина 1, рассматриваемый как фактор поддерживающий нишу (Arai F., Yoshihara H. et al., 2009) .

Другой тип ММСК, способных к образованию ниши ГСК, был обнаружен в костной ткани эмбриона мыши (Chan C.K., Chen C.C. et al., 2009). CD105+CD90--клетки из эмбриональной кости мыши при трансплантации под капсулу почки давали начало роста эктопической кости путем эндохондриальной оссификацией с привлечением сосудистых сплетений и обладали способностью к поддержанию ГСК популяции. В отличие от них CD105+CD90+-клетки, способствовали эктопическому остеогенезу, но при этом не могли поддерживать кроветворение в костном мозге. Последующий анализ показал, что CD105+CD90клетки, помимо этого являются 6С3 негативными (ENPEN/Аминопептипдаза А). Из культуры CD105+CD90-6С3--клеток in vitro были получены разные популяции. CD105+CD90-6С3+популяция эффективно поддерживала гемопоэз как in vitro, так и после трансплантации .

CD105+CD90+6С3--клетки, обладали остеогенной активностью, но теряли гемопротективные свойства (Chan C.K., Lindau P. et al., 2013). Более дифференцированные клетки с фенотипом CD105-CD90+6С3- теряли способность поддерживать кроветворение, в особенности Влимфопоэз (Chan C.K., Lindau P. et al., 2013) .

При изучении стромального компартмента костного мозга мышей было обнаружено, что Nestin+- стромальные клетки, образующие нишу ГСК, включают в себя все КОЕ-ф костного мозга и неадгезирующие «мезенсферы», которые восстанавливают этот пул, сохраняя свои свойства после серий трансплантаций (Mendez-Ferrer S., Michurina T.V. et al., 2010). Основная популяция (75%) стромальных клеток костного мозга человека, образующих функциональные «мезенсферы» для поддержания ГСК и экспрессирующих PDGR и CD51 (интегрин ), является Nestin+-клетками с фенотипом CD45-CD31-CD71-CD146+CD105+ (Pinho S., Lacombe J .

et al., 2013). Более того, PDGR+ и CD51+ ММСК костного мозга мыши и человека способствуют экспансии ГСК и поддерживают самобновляющуюся долго культивируемую популяцию ГСК (длительно репопулизирующие костный мозг) in vitro (Pinho S., Lacombe J. et al., 2013; Corselli M., Chin C.J. et al., 2013) .

В последнее время активно ведутся работы по изучению популяций стромальных предшественников костного мозга, секретирующих CXCL12. CXCL12 (SDF-1) – это хемокин, который определяет локализацию, заполнение и фиксацию ГСК в костном мозге (Kawabata K., Ujikawa M. et al., 1999; Peled A., Petit I. et al., 1999; ; Ara T., Tokoyoda K., et al., 2003; Bonig H., Priestley G.V. et al., 2004; Nie Y., Han Y.C., Zou Y.R., 2008; Tzeng Y.S., Li H. et al., 2011) .

Основываясь на экспрессии низкоаффинного рецептора к фактору роста нервов (CD271) и молекулы адгезии клеток меланомы (CD146) можно выделить две субпопуляции стромальных стволовых клеток костного мозга человека, образующих КОЕ-ф (Klamer S., Voermans C., 2014) .

В костном мозге взрослого человека и мыши большинство клеток были с фенотипом CD271+СD146-, в то время как популяция CD271+СD146+ клеток доминировала в детском и фетальном костном мозге (Morrison S.J., Wandycz A.M et al., 1996; Maijenburg M.W., Kleijer M .

et al., 2012). CD271+СD146- клетки, как и покоящиеся ГСК локализуются в эндостально (Tormin A., Li O. et al., 2011). Этот факт может говорить о том, что данная субпопуляция стромальных клеток выполняет функцию поддержки длительной культуры ГСК (длительно репопулизирующие костный мозг). Кроме этого было установлено, что ГСК частично связаны с ретикулярными клетками, обильно экспрессирующие CXCL12 (CAR-клетки) (Omatsu Y., Sugiyama T. et al., 2010) .

Делеция Cxcl12 в остеопрогениторах костного мозга (Osterix+) приводит к усилению выхода ГСК в кровь и селезенку. Тоже воздействие в перицитах венозных синусов (LepR+) также приводит к активному переходу ГСК в кровоток и селезенку, но не влияет на их число в костном мозге (Ding L., Morrison S.J., 2013). Делеция Cxcl12 в широком спектре костномозговых стромальных клеток (Пероксиредоксин 1; PRX1+), включая все Nestin+-клетки и остеопрогениторы, приводит к значительному снижению числа ГСК в костном мозге и активации гемопоэза в селезенке (Greenbaum A., Hsu Y.M. et al., 2013). Таким образом, Nestin+клетки играют определяющую роль в поддержке ГСК и их фиксации в костном мозге .

Эндотелиальные и периваскулярные клетки 1.2.3.3 .

Взаимодействие между ГСК и эндотелием берет начало с эмбрионального периода, когда эндотелиальные структуры стимулируют рост и развитие ГСК в течение эмбрионального развития (Chen M.J., Yokomizo T. et al., 2009). Во взрослом организме, формируя барьер между кровотоком и костным мозгом, они регулируют выход гемопоэтических клеток в кровь (Itkin T., Ludin A. et al., 2012). Фенотип активированных ГСК определяется эндотелиальными клетками по экспрессии маркера сигнальной молекулы активации лимфоцитов (SLAM) (Wright D.E., Wagers A.J. et al., 2001; Kiel M.J., Yilmaz O.H. et al., 2005). Проницаемость барьера регулируется через секрецию цитокинов. Так, введение фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) мышам снижал проницаемость эндотелиального барьера, тормозил хоуминг и миграцию ГСК через ингибирование активности матриксной металлопротеиназы-9 экспрессии (MMP-9), эндотелиально-сосудистого кадхерина и падения уровня оксида азота (NO) (Itkin T., Ludin A. et al., 2012) .

В отличие от зоны эндоста, в которой ГСК, контактируя с остеобластами, находятся в состоянии «покоя», в периваскулярной области контакт гемических предшественников с эндотелиальными клетками усиливает активность и подвижность ГСК и способствует их выходу в кровоток (Ema H., Suda T., 2012). В сосудисто-капиллярной системе костного мозга можно выделить две функциональные зоны: зону циклической активности ГСК, расположенную в районе венозных синусов, и зону покоя около артериол (Kunisaki Y., Bruns I .

Эндотелий артериол окружен перицитами с фенотипом: Нестинet al., 2013) .

хондроитинсульфат протеогликан 4 (CSPG4/NG2)+, гладкомышечный актин +, рецептор лептина (LepR)-. Перициты венозных синусов имеют обратный фенотип. Активность перицитов артериол ниже, чем в венозных синусах, при этом число покоящихся ГСК, больше в области артериол. Кроме этого у ГСК из этой области снижена чувствительность к цитостатикам .

Эндотелий венозных синусов образует нишу для ГСК с циклической активностью. При изменении гомеостаза организма ее заполняют ГСК артериол. Этот эффект наблюдается при введении G-CSF (Kunisaki Y., Bruns I. et al., 2013). Таким образом, динамическое равновесие между покоящимися и активированными ГСК, осуществляется клеточным микроокружением .

Эндотелий необходим для поддержания и восстановления пула ГСК. Было показано, что клетки эндотелия секретируют факторы, которые вызывают экспансию гемопоэтических прогениторов ex vivo. Кроме этого было показано, что для процесса восстановления после миелоабляции необходимы эндотелиальные клетки артериол и венозных синусов костного мозга (Chute J.P., Muramoto G.G. et al., 2006; Butler J.M., Nolan D.J. et al., 2010; Kobayashi H., Butler J.M. et al., 2010). Пролиферативная активность ГСК зависит от непосредственного контакта с эндотелиальными клетками. Например, Е-селектин усиливает пролиферацию гемопоэтических клеток (Winkler I.G., Barbier V. et al., 2012), а делеция гена kit ligand в эндотелиальных клетках приводит к снижению числа ГСК в костном мозге (Ding L., Saunders T.L. et al., 2012) .

Нервные и глиальные клетки 1.2.3.4 .

Нервные и глиальные клетки оказывают влияние на активность ГСК. Было показано, что синтез G-CSF – интерлейкина, отвечающего за мобилизацию гемопоэтических предшественников, регулируется, в том числе, клетками симпатической нервной системы (Katayama Y., Battista M. et al., 2006). Нейроны симпатического отдела нервной системы координируют циркадные изменения числа ГСК в костном мозге и их выход в кровоток, регулируя локальный синтез CXCL12. В экспериментах с блокированием симпатической иннервации наблюдалось нарушение циркадного контроля мобилизации ГСК в периферические кровеносные сосуды и снижение экспрессии CXCL12 (Mendez-Ferrer S., Lucas D. et al., 2008) .

TGF- – цитокин, который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток. Кром этого, он может изменять активность покоящихся ГСК (Yamazaki S., Iwama A., et al., 2009). В то время, как ММСК могут служить ресурсом неактивного TGF-, немиелиновые Швановские клетки являются основными продуцентами активной формы TGF- в костном мозге. Швановские клетки, ассоциированные с гемопоэтическими предшественниками, синтезируют факторы, необходимые для функционирования ниши ГСК в костном мозге (Yamazaki S., Ema H. et al., 2011). Отсутствие популяции этих клеток приводит к снижению числа гемопоэтических предшественников в костном мозге (Barker J.E., 1997) .

Таким образом, компоненты нервной системы, в составе ниши ГСК костного мозга, влияют на численность ГСК и активацию их выхода в кровоток .

Адипоциты 1.2.3.5 .

Адипоциты составляют большую часть взрослого костного мозга. Причем, их число увеличивается с возрастом (Kirkland J.L., Tchkonia T. et al., 2002; Rosen C.J., Ackert-Bicknell C .

et al., 2009), а кроветворная функция костного мозга снижается (Berkahn L., Keating A., 2004) .

До недавнего времени считалось, что жировые клетки костного мозга потенциально могут поддерживать гемопоэз. Например, адипонектин, секретируемый жировыми клетками, усиливает пролиферацию ГСК без потери способности поддержания численности пула (DiMascio L., Voermans C. et al., 2007). Однако, источником адипонектина в костном мозге помимо адипоцитов являются остеобласты (Berner H.S., Lyngstadaas S.P. et al., 2004). При изучении разных анатомических областей скелета, отличающихся содержанием жировых клеток, было показано, что численность гемопоэтических предшественников и адипоцитов носила реципрокный характер (Naveiras O., Nardi V. et al., 2009). Кроме этого, снижение числа адипоцитов (в генетических или фармакологических моделях) приводит к лучшему приживлению трансплантата костного мозга после миелоабляции (Naveiras O., Nardi V. et al., 2009). Таким образом, очевидно негативное влияние адипоцитов на функциональную активность гемопоэтических предшественников и гемопоэз .

–  –  –

Появляется все больше данных о том, что гемопоэтические клетки (остеокласты, макрофаги и др.), влияя на активность стромальных клеток, образующих нишу, изменяют функциональное состояние ГСК .

–  –  –

Остеокласты, в силу их тесной связи с остеобластами и близостью к эндостальной нише, наиболее широко изучаемые гемопоэтические клетки, способные влиять на нишу стволовых клеток .

Генетические и фармакологические изменения активности остеокластов демонстрируют их регулирующие действие на покоящиеся ГСК. Угнетение активности остеокластов при обработке бисфосфонатами приводило к незначительному уменьшению числа ГСК (Flk2линейные Sca+Kit+-клетки). При этом способность самоподдержания пула снижалась (Lymperi S., Ersek A. et al., 2011). Наиболее значимое снижение численности ГСК (Flk2- линейные Sca+Kit+) наблюдалось у мышей ос/ос, гомозиготных по мутации гена Tirg, кодирующего 3 субъединицу комплекса АТФ-азы вакуольного типа. Клинически данная мутация проявляется тяжелым остеопетрозом, вследствие усиленного подкисления и резорбции кости в области взаимодействия остеокластов и костной ткани (Mansour A., Abou-Ezzi G. et al., 2012) .

Механизмы, с помощью которых остеокласты регулируют функциональную активность ГСК, до конца неизвестны. В случае ос/ос мышей, с одной стороны, снижение числа ГСК может происходить из-за уменьшения медуллярного пространства в следствие остеопетроза. С другой, наблюдается увеличение числа стромальных прогениторов (PDGFR+ Sca+ линейные клетки) на фоне уменьшения числа зрелых остеобластов (Mansour A., Abou-Ezzi G. et al., 2012), т.е. изменяя состав ниши стволовых клеток, остеокласты могут косвенно регулировать активность ГСК .

Помимо этого, остеокласты регулируют функциональную активность ГСК путем деградации костного матрикса, в результате которого высвобождаются ионы кальция и секретируются ряд цитокинов, например, TGF, влияющий на ГСК (Adams G.B., Chabner K.T .

et al., 2006; Yamazaki S., Ema H. et al., 2011) .

Ряд исследований был посвящен изучению вклада остеокластов к мобилизации ГСК через синтез гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). Известно, что GCSF индуцирует мобилизацию ГСК, в основном, за счет угнетения активности остеобластов и снижения экспрессии CXCL12 стромальными клетками костного мозга (Petit I., Szyper-Kravitz M. et al., 2002; Semerad C.L., Christopher M .

J. et al., 2005). Активация остеокластов RANKлигандом (RANKL) приводила к умеренной мобилизации ГСК в кровоток (Kollet O., Dar A. et al., 2006). Снижение их активности при нокдауне гена РТР или введение кальцитонина у мышей приводило к снижению чувствительности ГСК к G-CSF (Miyamoto K., Yoshida S. et al., 2012). Увеличение миграционной активности ГСК, возможно, происходило, вследствие синтеза остеокластами протеиназы Катепсин К, которая in vitro разрушает CXCL12. Опыты на трансгенных мышах (CSF-1, c-fos или RANKL нокаут) со сниженной активностью остеокластов показали, что введение G-CSF увеличивает выход ГСК из костного мозга (Miyamoto K., Yoshida S. et al., 2012). Похожие результаты были получены при введении G-CSF после приема бифосфонатов (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010; Miyamoto K., Yoshida S. et al., 2012) .

Таким образом, угнетение активности остеокластов приводит к снижению выхода ГСК из костного мозга, не влияя на G-CSF-опосредованную миграцию ГСК .

Макрофаги 1.2.4.2 .

В костном мозге выявлено несколько популяций макрофагов: F4/80+ макрофаги и макрофаги с высокой экспрессией -гладкомышечного актина (-SMA) .

F4/80+ макрофаги локализуются на эндостальной и периостальной поверхностях. Они тесно связаны с остеобластами, нависая над ними в виде козырька в участках остеогенеза при обновлении костной ткани или после повреждения кости (Chang M.K., Raggatt L.J. et al., 2008;

Alexander K.A., Chang M.K. et al., 2011). Среди F4/80+ выделяют CD169+ фракцию макрофагов .

Эти клетки ассоциированы с Nestin-GFP+ стромальными клетками костного мозга (Chow A., Lucas D. et al., 2011) .

Количество макрофагов с высокой экспрессией -гладкомышечного актина (-SMA) незначительно, не более 0,1% от общего числа клеток костного мозга. Высокий уровень экспрессии циклооксигеназы-2 (SOX2) -SMA макрофагами позволяет им влиять на функциональную активность ГСК за счет локального синтеза простагландина Е2 (Ludin A., Itkin T. et al., 2012), который способствует восстановлению и поддержанию пула ГСК путем ингибирования апоптоза, в том числе и при сублетальном облучении (Porter R.L., Georger M.A .

et al., 2013) .

Исследования, выполненные на разных моделях по изучению роли макрофагов в регуляции деятельности ниши ГСК и их функциональной активности, подтверждают их положительное влияние. Наличие макрофагов в первичной культуре костного мозга приводит к значительному увеличению числа зрелых остеобластов (Chang M.K., Raggatt L.J. et al., 2008) .

Интересные данные были получены в исследованиях на мышах линии MAFIA, экспрессирующих рекомбинантный ген апоптоза, состоящего из связывающего домена гена FK506, цитоплазматического домена гена Fas и промотора гена с-fms. Фармакологоиндуцированная димеризация ДНК индуцирует FAS-опосредованный апоптоз в моноцитах и макрофагах мышей MAFIA, что сопровождается значительным снижением числа остеобластов (Chang M.K., Raggatt L.J. et al., 2008) и выходом ГСК в кровоток (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010). Следует отметить, что в данной модели, абляция макрофагов происходит на фоне системной воспалительной реакции, косвенно приводящей к мобилизации ГСК .

В другой модели, не сопровождающейся системным воспалением, основанной на введении мышам клодронат-нагруженных липосом, приводящего к снижению числа моноцит/макрофагов костного мозга (80-90%) (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010; Chow A., Lucas D. et al., 2011) наблюдалось уменьшение числа остеобластов, мобилизация ГСК в системный кровоток и угнетение экспрессии в клетках ниши ряда генов, в том числе таких как, CXCL12, Kit-лиганд, ангиопоэтин-1 (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010; Chow A., Lucas D. et al., 2011) .

В опытах на трансгенных мышах показано, что абляция CD169+-макрофагов приводит к усилению выхода кроветворных клеток в периферические сосуды и снижению экспрессии + CXCL12, Kit-лиганда, ангиопоэтина-1 Nestin-GFP стромальными клетками костного мозга (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010; Chow A., Lucas D. et al., 2011). Кроме этого замечено, что CD169+- макрофаги играют ключевую роль в поддержании эритропоэза в костном мозге (Chow A., Huggins M. et al., 2013) .

Делеция АТФ связывающего участка в транспортных молекулах ABCA1 и ABCG1 в макрофагах и/или миелоидных дендритных клетках приводило к элиминации костных и CD169+-макрофагов из костного мозга с умеренным усилением миграции ГСК в кровоток и подавлением экспрессии CXCL12 стромальными клетками (Westerterp M., Gourion-Arsiquaud S .

et al., 2012). На фоне введения G-CSF мышам наблюдается снижение числа моноцитов и костных макрофагов в костном мозге и выход гемопоэтических клеток в кровь (Winkler I.G., Sims N.A. et al., 2010) .

Таким образом, снижение численности моноцит/макрофагальной популяции костного мозга приводит к усилению миграции ГСК в кровоток и снижению экспрессии в стромальных костномозговых клетках генов, обеспечивающих хоуминг и сохранение популяции гемопоэтических прогениторов в костном мозге .

Нейтрофилы 1.2.4.3 .

Известно, что нейтрофилы могут способствовать G-CSF-опосредованной мобилизации ГСК в кровоток, через высвобождение специфических протеиназ, таких как MMP9, катепсин G, эластаза нейтрофилов. Это происходит за счет деградации ключевых молекул ниши ГСК, включая CD106, CXCL12 (Lvesque J.P., Takamatsu Y. et al., 2002) .

Однако, до сих пор нет однозначного мнения о влиянии продуктов нейтрофилов на мобилизацию ГСК, в том числе G-CSF-опосредованной, и изменение молекул адгезии в нише костного мозга. У мышей с нарушением синтеза протеиназ нейтрофилов, G-CSF индуцированный выход ГСК в кровоток не изменялся (Levesque J.P., Liu F. et al., 2004). Кроме того, было показано, что G-CSF, в первую очередь, подавляет транскрипцию CXCL12 (Petit I., Szyper-Kravitz M. et al., 2005) .

С другой стороны, иммунодеплеция нейтрофилов с использованием анти-Lyg антител, приводила к ослаблению G-CSF-индуцированной миграции ГСК и снижению функциональной активности остеобластов (Singh P., Hu P. et al., 2012) .

Исходя из вышеописанных данных, можно сделать вывод, что нейтрофилы способны влиять на состояние ниши ГСК костного мозга и миграцию гемопоэтических предшественников, но, вероятно, их роль в регуляции гемопоэза незначительна .

1.2.5. Внеклеточные компоненты ниши костного мозга

Важную роль в формировании и поддержания гомеостаза ниш костного мозга играют неклеточные компоненты ниши костного мозга. Они выполняют механическую, сигнальную, трофическую, регуляторную функции и определяют локализацию клеточного многообразия костномозгового микроокружения. Наиболее значимыми неклеточными компонентами ниши, определяющим гомеостаз пула кроветворных прогениторных клеток, являются растворимые факторы, молекулы экстрацеллюлярного матрикса, молекулы адгезии, кислород .

Экстрацеллюлярный матрикс. Внеклеточный матрикс костного мозга (ЕСМ) продуцируется клетками костномозговой ниши. Контакт между клетками и матриксом осуществляется матрикс-ассоциированными молекулами, в том числе иммобилизованными секретируемыми протеинами и мембранными белками с крупными внеклеточными доменами (Klamer S., Voermans C., 2014). Основными белками ЕСМ являются фибронектин, коллаген I-XI типов, ламинин, тенасцин, тромбоспондин, эластин (Carter D.H., Sloan P., Aaron J.E., 1991;

Hamilton R., Campbell F.R., 1991; Nilsson S.K., Debatis M.E. et al., 1998). Большое значение для целостности ECM имеют протеогликаны с их большими гликозаминогликансвязывающими боковыми цепями, включая гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматан, гепарансульфат, кератансульфат и гепарин (Rodgers K.D., San Antonio J.D., Jacenko O., 2008). К ЕСМ-ассоциированным молекулам относятся растворенные или мемброносвязанные гликопротеины из группы сиаломуцинов, в том числе CD34, GlyCAM1, CAM1 (Mad-CAM1), CD162 (PSGL1), CD43 (SPN), CD45RA и CD164. Межклеточное взаимодействие и контакт клеток с ЕСМ в костном мозге происходит за счет интегринов и селектинов (Pillozzi S., Becchetti A., 2012; Sahin A.O., Buitenhuis M., 2012). Мембраносвязанные рецепторы (иммуноглобулинового суперсемейства) CD54 (ICAM1), CD106 (VCAM-1) и CD166 также участвуют в формировании ниши костного мозга (Bevilacqua M.P., 1993) .

Протеогликаны, коллаген и фибронектин. Протеогликаны и коллаген необходимы для поддержания нормального функционального состояния ГСК .

Мутации в генах перлекана, широко представленного в костном мозге протеогликана (Schofield K.P., Gallagher J.T., David G., 1999) и коллагена X типа, приводят к нарушению эндохондральных процессов окостенения и угнетению кроветворения, выражающегося в лимфопении и аплазии костного мозга (Rodgers K.D., San Antonio J.D., Jacenko O., 2008;

Sweeney E., Roberts D., Jacenko O., 2011). Мутации глипикана-3 также нарушают остеосинтез и гемопоэз (Viviano B.L., Silverstein L. et al., 2005). Гиалуроновая кислота усиливает гемопоэз в костном мозге после введения 5-фторурацил и является необходимым компонентом для поддержания гемопоэза in vitro (Matrosova V.Y., Orlovskaya I.A. et al., 2004) .

Введение нетоксичной дозы Cis-4-гидроксипролина, специфического ингибитора секреции коллагена в костном мозге, угнетает кроветворение и снижает число гемопоэтических прогениторов (Zuckerman K.S., Rhodes R.K. et al., 1985; Klamer S., Voermans C., 2014) .

Адгезия ГСК к фибронектину снижает их пролиферацию и дифференцировку (Hurley 1995). Тенасцин-C способствует регенерации R.W., McCarthy J.B., Verfaillie C.M., гемопоэтических клеток после миелоабляции (Nakamura-Ishizu A., Okuno Y. et al., 2012) .

Интегрины. Взаимодействие ГСК с клетками ниши и ЕСМ осуществляется за счет трансмембранных гликопротеинов – интегринов. Интегрины – гетеродимерные белки, состоящие из - и -субъединицы (рисунок 3), представленные 16 - и 8 -субъединицами (Klamer S., Voermans C., 2014). ГСК экспрессируют интегрин-41 (VLA4; ITGA4 и ITGB1), VLA5; ITGA5 и ITGB1), -L2 (LFA1; ITGAL и ITGB2) и -M2 (MAC-1; ITGAM и ITGB2). Около 10% костномозговых ГСК экспрессируют интегрин-3 (ITGB3) (Coulombel L., Auffray I. et al., 1997) .

Рисунок 3. Интегрины и сигнальные пути, активирующиеся взаимодействием лигандов с интегринами .

* Связывание интегрина с лигандом индуцирует нисходящие сигнальные пути, которые регулируют дифференцировку гемопоэтических клеток (Klamer S., Voermans C., 2014). В свою очередь, клеточные процессы влияют на интегрин-зависимую адгезию через восходящие сигнальные пути, в том числе кластеризацию и конформационные изменения интегринов, усиливающие сродство к своим лигандам (Klamer S., Voermans C., 2014) .

Введение антител, блокирующих 2-интегрины, снижает адгезию ГСК к стромальным клеткам косного мозга in vitro, не вызывая их выход в кровь in vivo (Teixido J., Hemler M.E., et al., 1992) .

* http://www.nature.com/nrm/journal/v5/n10/images/nrm1490-i1.jpg При этом анти-VLA4 антитела стимулируют выход ГСК в кровоток (Rettig M.P., Ansstas G., DiPersio J.F., 2012). После обработки ГСК человека антителами против ITGB1, не происходило их приживление при трансплантации (Zanjani E.D., Flake A.W. et al., 1999) .

Селектины. Другим семейством белков, играющим ключевую роль в межклеточном взаимодействии и адгезии клеток к матриксу в специфическом микроокружении ниши ГСК костного мозга, являются селектины. Они связываются с сиалированными, фукозилированными или сульфатированными углеводородными остатками гликопротеинов и протеогликанов (рисунок 4) .

Рисунок 4. Внеклеточный матрикс ниши костного мозга и ГСК .

Хоуминг ГСК в костном мозге. Стадия инициации хоуминга и последующее качение ГСК в костном мозге. Эти процессы обеспечиваются Е - и Р-селектинами. После активации интегрина SDF-1 происходит адгезия ГСК к эндотелиальным клеткам. После этого ГСК могут проникать через эндотелиальный слой и базальную мембрану, состоящую из фибронектина, коллагена и ламинина. В процессе трансэндотелиальной миграции участвуют интегрины (CD49d/CD29, CD49e/CD29 и CD49f/CD29). Последующая миграция ГСК к остеобластам происходит по градиенту SDF-1. (Sahin AO, Buitenhuis M., 2012) .

Это трансмембранные белки, состоят из трех доменов: внутриклеточный, трансмембранный и внеклеточный. Первые два домена изменчивы, в то время как внеклеточные домены консервативны. Выделяют три группы селектинов эндотелиальные (E-), лейкоцитарные (L-) и тромбоцитарные (P-) .

Е-селектин представлен исключительно на эндотелиальных клетках, особенно малых венозных синусов костного мозга (Schweitzer K.M., Drger A.M. et al., 1996). Причем количество мРНК Е-селектина в клетках эндостальной области больше чем в клетках центральной части костного мозга. Повышенная экспрессия Е-селектина специфически связана с синтезом CXCL12 эндотелием синусов костного мозга, образуя каким образом зоны локализации (хоуминга) ГСК, в том числе при трансплантации (Sipkins D.A., Wei X. et al., 2005). E-селектин обеспечивает адгезию ГСК к эндотелию и способствует их пролиферации и росту (Zarbock A., Ley K. et al., 2011) .

Нокдаун гена Е-селектина или введение антагонистов Е-селектина мышам приводили к торможению процессов самообновления и пролиферации ГСК, частично опосредованных взаимодействием PSGL-1 и HCELL гемопоэтических клеток и Е-селектина (Winkler I.G., Barbier V. et. al., 2012). Таким образом, активация ГСК в синусоидальной нише осуществляется, в том числе, усилением экспрессии Е-селектина эндотелием. Среди лигандов Е-селектина, экспрессируемых ГСК, хорошо изучены CD34, PSGL-1, Е-/L-селектин лиганд гемопоэтических клеток (ГСК-специфический модифицированный CD44 антиген HCELL), ESL-1 (GLG1) и гликосфинголипиды. Помимо этого к Е-селектинам относят CD43, эндогликан (представитель CD34-семейства) и вазигин (CD147) .

P-селектин обнаруживается во всех сосудах костного мозга, а также на эндотелии крупных сосудов (Sipkins D.A., Wei X. et al., 2005) .

L-селектин экспрессируют лейкоциты, обеспечивая адгезию и миграцию лимфоидных прогениторов в лимфатические узлы, селезенку и другие органы лимфатической системы (Arbons M.L., Ord D.C. et. al., 1994). P- и L-селектины связываются с молекулами ECM, в том числе с хондроитин-сульфатированным версиканом, гепарин-сульфатированным коллагеном-18 и коллаген-15 (Kawashima H., Hirose M. et. al., 2000; Kawashima H., Atarashi K. et. al., 2002) .

Таким образом, E-селектин образует микродомены синусоидальной ниши костного мозга, в которых происходит активация и пролиферация ГСК, а P- и Е-селектины играют ключевую роль в процессе «хоуминга» ГСК в костном мозге .

1.2.6. Физиологическое микроокружение

На клеточные компоненты ниши оказывают влияние различные системы организма через выработку медиаторов, изменяющих физиологическое состояние ниши. Активность клеток ниши могут изменять сигналы симпатической нервной системы (Katayam Y., Battista M., et al., 2006), циркадные ритмы (Mendez-Ferrer S., Lucas D. et al., 2008), гормоны (Calvi L.M., Adams G.B., et al. 2003). Содержание кислорода в микроокружении ГСК тоже играет важную роль в поддержании гомеостаза ниши. Сосудистая сеть костного мозга хорошо развита, расстояние между отдельными капиллярами не превышает нескольких диаметров клетки, поэтому перфузионные показатели разных областей костного мозга должны быть одинаковы (Pinho S., Lacombe J. et al., 2013). Однако, при введении Hoechst (малой флуоресцентной молекулы) была обнаружена неравномерность распределения газов. Более того, долгоживущая популяция ГСК была локализована в зонах со сниженной перфузией (Williams S., Levesque J.P., 2010). Недавно, было показано, что Nestin+-сосуды, расположены ближе к эндосту, и содержание кислорода в них выше, чем Nestin--сосудах (Spencer J.A., Ferraro F. et al., 2014) .

Напряжение кислорода внутри сосуда и внесосудистой области была ниже на участках около центрального синусоида ( 40 мкм от поверхности кости) по сравнению с зонами в пределах 20 мкм костной поверхности (Spencer J.A., Ferraro F. et al., 2014) .

Эти данные несколько расходятся с общепринятой теорией о том, что самобновляющийся пул ГСК (слабокоммитированные предшественники) находится в эндостальной области костного мозга, которая характеризуется низкой перфузией и относительной гипоксией (Lvesque J.P., Winkler I.G. et. al., 2007; Winkler I.G., Barbier V. et. al., 2010). Однако недавние исследования показали, что эндостальная область сильно васкуляризирована (Nombela-Arrieta C., Pivarnik G. et al., 2013). Более того, большинство ГСК в эндостальной области были из периваскулярной субпопуляции, т.е. в эндостальном участке, вероятно, гемопоэтические предшественники находятся в условиях относительно хорошей оксигенации. Возможное объяснение этого несоответствия заключается в том, что ГСК демонстрируют гипоксический профиль (он определялся по уровню пимонидазола и экспрессии HIF-1) независимо от их расположения в костном мозге. Например, некоторые ГСК могут демонстрировать гипоксический профиль даже в сосудистом русле (Nombela-Arrieta C., Pivarnik G. et al., 2013) .

Анализ экспрессии HIF-1 ГСК позволяет оценить метаболическую активность этих клеток. В результате нокаута гена HIF-1 у мышей наблюдалось нарушение клеточного цикла в клетках пула долгоживущей популяции ГСК. Клетки выходили из фазы G0, и происходило истощение пула после повторяющихся циклов миелосупрессии (Takubo K., Goda N. et al., 2010) .

В нормальных физиологических условиях у нокаутных животных не наблюдалось снижение числа гемопоэтических предшественников и угнетение их дифференцировки. В условиях же стресса численность ГСК уменьшалась (Takubo K., Goda N. et al., 2010). Интересно, что нокаут гена HIF-1 негативно сказывался на клетках стромального дифферона костного мозга .

Отсутствие активности этого гена в остеобластах приводило к нарушению формирования костей (Wang Y., Wan C. et al., 2007). Нокаут гена HIF-1 был причиной снижения экспрессии белка Cripto (известного, как тератокарцинома-продуцируемый фактор роста 1/TDGF-1), остеобластами и ММСК костномозговой ниши. Cripto необходим для локализации покоящихся ГСК в эндостальной нише и поддержании самообновления их пула в культуре (Miharada K., Karlsson G. et al., 2011; 2012). Падение уровня Cripto сопровождалось снижением числа ГСК в костном мозге (Miharada K., Karlsson G. et al., 2011; 2012). Стабилизация экспрессии HIF-1 в остеобластах сопровождалась увеличением числа покоящихся ГСК и усилением их связи с компонентами ниши (Wang Y., Wan C. et al., 2007) .

Гипоксическое микроокружение, изменяющее экспрессию HIF-1, влияет не только на ГСК, но и клетки ниши, регулирующие активность гемопоэтических предшественников .

Гипоксический профиль ГСК определяется не только локализацией, но и интенсивностью метаболизма кроветворных клеток, который, в том числе, может зависеть от уровня экспрессии HIF-1 .

Гомеостаз ниши ГСК регулируется, в том числе, белками противосвёртывающей системы плазмы крови, такими как плазмин, плазминоген (неактивная форма плазмина), тромбоцитарный (uPA) активатор плазминогена. У мышей с нокаутными генами плазминогена и uPA наблюдалось снижение активации G-CSF-чувствительных ГСК (Tjwa M., Sidenius N. et .

al., 2009; Gong Y., Fan Y., Hoover-Plow J., 2011). Нокаут гена ингибитора плазмина приводил к мобилизации ГСК (Tjwa M., Janssens S., Carmeliet P., 2008). Увеличение подвижности ГСК происходило за счет расщепления плазмином коллагена, фибрина, ламинина и фибронектина .

Кроме того, он активирует другие протеазы, например, матриксные металлопротеиназы (ММР3/9/12/13), эластазы и катепсин В (Gong Y., Hoover-Plow J., 2012) .

Различные растворимые факторы влияют на способность клеток ниши поддерживать ГСК. Ангиопоэтин и его рецептор Tie2, вырабатываемые эндотелиальными клетками, необходимы для поддержания покоящихся ГСК (Arai F., Hirao A. et. al., 2004). Остеопонтин – гликопротеин, широко представленный в эндостальной нише, влияет на численность ГСК (Nilsson S.K., Johnston H.M. et.al., 2005). Концентрация свободных ионов кальция, образующихся при резорбции кости остеокластами, влияет на количество ГСК, несущих Са 2+чувствительный рецептор, в эндосте (Adams G.B., Chabner K.T. et.al., 2006). SCF и ТРО участвуют в поддержке пула ГСК в сосудистой и костной зоне костномозговой ниши, соответственно (Yoshihara H., Arai F. et.al., 2007; Qian H., Buza-Vidas N. et.al., 2007). TGF-, синтезируемый стромальными клетками костного мозга, подавляет пролиферацию ГСК .

Активная форма TGF- является ингибитором пролиферации мультипотентных ранних гемопоэтических предшественников, при этом усиливает пролиферацию линейно коммитированных ГСК (Ottmann O.G., Pelus LM., 1988; Van Ranst P.C., Snoeck H.W. et.al., 1996;

Veiby O.P., Jacobsen F.W. et.al., 1996; Fortunel N.O., Hatzfeld A., Hatzfeld J.A., 2000), в частности, у лимфоидных прогениторов (Challen G.A., Boles N.C. et.al., 2010; Veiby O.P., Jacobsen F.W .

et.al., 1996) .

Большое число хемокинов и других растворимых факторов обеспечивают взаимодействие между ГСК и клетками ниши. Экспрессируемый остеобластами, Kit-лиганд (SСF) необходим для пролиферации, выживания и функционирования ГСК in vivo. Мыши, у которых отсутствовала экспрессия SСF, умирали в период эмбрионального развития от апластического синдрома (Zhao M., Li L., 2015). SDF-1 участвует в направленной миграции, «хоуминге», ГСК (Zhao M., Li L., 2015; Morrison S.J., Scadden D.T., 2014; Ding L., Morrison S.J., 2013; Sahin A.O., Buitenhuis M., 2012). CXCL10 (IP-10), CCL2 (MCP-1), CCL5 (RANTES), SCF и IL-8 участвуют в трансэндотелиальной миграции ГСК (Sahin A.O., Buitenhuis M., 2012). LTD4 осуществляет регуляцию интегрин-зависимую адгезию ГСК и индуцирует хемотаксис и трансэндотелиальную миграцию ГСК in vitro (Sahin A.O., Buitenhuis M., 2012) .

Таким образом, огромное число факторов, как клеточных, так внеклеточных, в том числе растворенные играют важную роль в обеспечении сохранения пролиферации, самообновлении, миграции, хемотаксисе, «хоуминге» и других важных физиологических процессов ГСК. Без слаженного функционирования всех компонентов ниши костного мозга нормальный гемопоэз невозможен. Повреждения стромального или гемопоэтического компартмента ниши приводят к апластическим процессам в костном мозге, несмотря на интактность пула гемопоэтических предшественников. Исходя из этого, можно сделать вывод, что анализируя изменения гемопоэза, необходимо рассматривать влияния различных факторов не только на ГСК, но и другие компоненты ниши костного мозга .

Гемопоэз 1.3 .

Гемопоэз (кроветворение) представляет собой тонко регулируемый процесс последовательных дифференцировок родоначальных клеток, приводящий к образованию зрелых клеток крови всех линий (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002) .

Впервые в 1896 г. независимо друг от друга Нейман (Newmann E.) и (Bizzozero G.) показали, что кроветворение происходит в костном мозге. В 1898 г. Pappenheim A. описал переходные формы клеток костного мозга. Основываясь на клинической картине протекания лимфоидных и миелоидных лейкозов, Негели (Naegeli O.) сделал вывод о существовании двух разных родоначальных кроветворных клеток, но при изучении окрашенных препаратов костного мозга на тот момент было невозможно проследить происхождение зрелых клеток крови, так как все ранние предшественники выглядели одинаково. Работы Максимова А.А. в начале XX века по изучению развития эмбриональной кроветворной ткани позволили сформировать гипотезу

–  –  –

Гемопоэз у млекопитающих происходит в органах кроветворения. Гематологи разделяют его на миелоидный, протекающий в костном мозге, и лимфоидный, происходящий в тимусе, селезенке, лимфатических узлах и Пейеровых бляшках .

Родоначальные стволовые кроветворные клетки локализуются в костном мозге .

предшественники Т- и В-лимфоцитов также образуются в костном мозге, но их окончательная дифференцировка происходит в тимусе (Т-клетки), селезенке, лимфатических узлах и Пейеровых бляшках (В-клетки) (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002) .

Гемические предшественники способны мигрировать, выходить в кровоток и возвращаться обратно в костный мозг. Этот процесс принято называть «хоуминг». Именно это свойство ГСК обеспечивает обмен кроветворных клеток между разобщенными кроветворными органами .

Современная теория кроветворения состоит в том, что нормальное кроветворение поликлонально, т.е. осуществляется одновременно многими клонами. Постоянная замена клонов объясняется истощением пролиферативного потенциала стволовой кроветворной клетки, поэтому исчезнувшие клоны никогда не появляются вновь. Различные гемопоэтические органы заселены разными клонами. Гемопоэз условно разделен на 5-6 периодов, границы между которыми весьма размыты, а между периодами содержится много переходных, промежуточных форм. В процессе дифференцировки происходит постепенное снижение пролиферативной активности клеток и плюрипотентности клеток-предшественниц .

I период – тотипотентная эмбриональная стволовая клетка (ЭСК), находится на самом верху иерархической лестницы. II период – пул поли- или мультипотентных стволовых кроветворных клеток (ГСК). Эти клетки дают начало все линиям гемопоэза. ГСК закладываются в период эмбриогенеза и расходуются последовательно, образуя, сменяющие друг друга клоны более зрелых кроветворных клеток. 90% клонов являются короткоживущими, только 10% клонов могут функционировать в течение длительного времени. ГСК обладают высоким, но ограниченным пролиферативным потенциалом, их способность к самоподдержанию ограничены, т. е. клетки этого периода «не бессмертны». ГСК могут проделать приблизительно 50 клеточных делений, поддерживают продукцию кроветворных клеток в течение всей жизни человека .

Популяция ГСК гетерогенна, в ней выделяют две субпопуляции предшественников, обладающих различным пролиферативным потенциалом. Основная масса ГСК находится в фазе покоя G0 клеточного цикла, обладает огромным пролиферативным потенциалом. При выходе из покоя ГСК вступает на путь дифференцировки, снижая пролиферативный потенциал и ограничивая набор дифференцировочных потенций. После нескольких циклов деления (1-5) ГСК может вернуться вновь в состояние покоя. Длительное поддержание кроветворения обеспечивается резервными ГСК. Гетерогенность пула ГСК и степень их дифференцировки устанавливается на основе экспрессии ряда дифференцировочных мембранных антигенов .

Среди ГСК человека выделены: примитивные мультипотентные предшественники (CD34+Thyl+), более дифференцированные предшественники, характеризующиеся экспрессией антигена гистосовместимости II класса (HLA-DR), CD38. Ранние ГСК не экспрессируют линейно специфические маркеры и являются предшественниками клеток всех гемопоэтических линий. Количество ГСК в костном мозге - около 0,01%, а вместе с клеткамипредшественниками – 0,05% (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002). У мышей ГСК характеризуются высокой экспрессией c-Kit и Sca-1 антигенов и отсутствием CD34 маркера (Chute J. P., Ross J. R., McDonnell D.P., 2010) .

В III периоде по мере снижения пролиферативного потенциала ГСК дифференцируются в полиолигопотентные коммитированные в направлении 2-5 гемопоэтических клеточных линий клетки-предшественники. Полиолигопотентные коммитированные предшественники КОЕГЭММ (гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоцитарные) дают начало 4 росткам гемопоэза, КОЕ-ГМ – двум росткам. КОЕ-ГЭММ являются общим предшественником миелопоэза. Они экспрессируют CD34, маркер миелоидной линии CD33, детерминанты гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002) .

IV период состоит в том, что монопотентные коммитированные предшественники являются родоначальными для одного ростка гемопоэза: КОЕ-Г для гранулоцитарного, КОЕ-М

– для моноцитарно-макрофагального, КОЕ-Э и БОЕ-Э (бурстобразующая единица) – предшественники эритроидных клеток, КОЕ-Мгкц – предшественники мегакариоцитов. Все коммитированные клетки-предшественники имеют ограниченный жизненный цикл и не могут переходить в фазу клеточного покоя. Монопотентные коммитированные предшественники экспрессируют маркеры соответствующей клеточной линии дифференцировки. В V периоде гемопоэза клетки всех 8 клеточных линий можно морфологически разделить. Каждая линия включает: дифференцирующиеся, созревающие зрелые клетки, начиная с бластов, большинство из которых имеют характерные морфоцитохимические особенности (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002) .

1.3.1. Регуляция гемопоэза

Интенсивность образования новых клеток обеспечивается гемопоэтическими факторами роста. Гемопоэз инициируется ростовыми факторами, цитокинами и непрерывно поддерживается благодаря пулу ГСК. Активность стволовых кроветворных клеток регулируется клетками костномозговой ниши при межклеточном взаимодействии, путем синтеза короткодистантных стимулов (SCF, Il-1, Il-3, LIF, TGF, G-CSF и др.) (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002). По мере дифференцировки клетка начинает реагировать на дальнедействующие гуморальные факторы. Эндогенная регуляция всех этапов гемопоэза осуществляется цитокинами. Основными продуцентами цитокинов являются моноциты, макрофаги, активированные Т -лимфоциты, клетки ниши костного мозга .

Выделяют позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. Позитивные регуляторы необходимы для пролиферации, дифференцировки ГСК и созревания более поздних стадий гемопоэтических клеток. К ингибиторам пролиферативной активности ГСК и всех видов ранних гемопоэтических предшественников относят: трансформирующий ростовой фактор (TGF-), макрофагальный воспалительный белок (MIP-1), фактор некроза опухоли а (TNF-), интерферон- интерферон-, кислые изоферритины, лактоферрин другие факторы (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002). Факторы, влияющие на ранние ГСК: фактор стволовых клеток (SСF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерлейкины (IL-6, IL-11, IL-12), ингибиторы, которые тормозят выход ГСК в клеточный цикл из состояния покоя (MIP-1, TGF-, FNT-, кислые изоферритины и др.). В эту группу также относят линейно-неспецифические факторы: IL-3, IL-4, GM-CSF (для гранулоцитомонопоэза) .

Эта фаза регуляции ГСК не зависит от запросов организма. К позднодействующим линейноспецифическим факторам, поддерживающих пролиферацию и созревание коммитированных предшественников и их потомков, относят эритропоэтин, тромбопоэтин, колониестимулирующие факторы (G-CSF, М-CSF), IL-5. Эффекты, вызываемые действием одного и тоже же ростового фактора в разных клетках-мишенях на различных этапах дифференцировки, могут носить противоположный характер, что обеспечивает взаимозаменяемость молекул, регулирующих гемопоэз .

Кроме того, некоторые транскрипционные факторы, включая HoxB4, -катенин, HES-1 и GFI-1, влияют на программу дифференцировки клеток-предшественников и их функцию самоподдержания (рисунок 6). (Chute J. P., Ross J. R., McDonnell D. P., 2010) .

Рисунок 6. Основные сигнальные пути программ самообновления и сохранения пула ГСК .

BMP – Bone morphogenetic protein; NICD – notch внутриклеточный домен; RBPJ – рекомбинантный сигнал связывающий домен; LEF – белок, связывающий энхансер лимфоцитов, GFI-1 – свободный фактор роста 1, HOX – homeobox-белки (По Chute J. P., Ross J .

R., McDonnell D. P. // Minireview: Nuclear Receptors, Hematopoiesis, and Stem Cells // Mol Endocrinol. 2010 Jan; 24(1): 1–10) .

Показано, что лиганды ядерных рецепторов (гормоны, витамины) (таблица 2) способны влиять на активность ГСК разной степени коммитированности (рисунок 7) .

В регуляции лимфопоэза можно выделить две стадии: антигенезависимая и антигензависимая. На первой стадии из полипотентных предшественников дифференцируются предшественники Т- и В-лимфоцитов. Регуляция этого процесса происходит при контакте в тимусе с эпителиальными клетками, продуцирующими факторы Т-дифференцировки, и в костном мозге (для В-лимфоцитов) за счет IL-2, 4, 6, 7 – 15 (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002). При взаимодействии с антигеном (антигензависимая регуляция), клетка начинает экспрессировать рецептор к ростовым факторам, например IL-2, вследствие чего увеличивается число клеток, участвующих в иммунном ответе на данный антиген (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002) .

Рисунок 7. Регуляция гемопоэза лигандами ядерных рецепторов ГСК .

Зеленым цветом показано активирующее воздействие, красным – ингибирующее воздействие агентов. (По Chute J. P., Ross J. R., McDonnell D. P. // Minireview: Nuclear Receptors, Hematopoiesis, and Stem Cells // Mol Endocrinol. 2010 Jan; 24(1): 1–10.) .

В регуляции эритропоэза решающую роль играет эритропоэтин (ЭПО), без которого БОЕ-Э не пролиферируют, а в эритробластах не синтезируется гемоглобин. ЭПО в основном продуцируется перитубулярными клетками почек, чувствительными к уровню кислорода .

Недавно было показано, что ЭПО синтезируется остеобластами костного мозга (Rankin E.B., Wu C. et. al., 2012). В гипоксических условиях, в них активируется HIF-зависимый сигнальный путь, усиливающий синтез ЭПО (Panaroni C., Tzeng Y. et. al., 2014). Поэтому усиление эритропоэза происходит не только при кровопотерях, но и при снижении содержания кислорода в крови .

Тромбоцитопоэз зависит от числа тромбоцитов. При уменьшении содержания их в крови увеличивается выработка тромбопоэтина клетками печени и остеобластами (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002; Klamer S., Voermans C., 2014). Этот гормон усиливает амплификацию предшественников мегакариоцитов и ускоряет их полиплоидизацию .

Таблица 2. Ядерные рецепторы ГСК и их влияние на гемопоэз

–  –  –

Регуляция гранулоцито- и моноцитопоэза начинается на уровне общего предшественника, активируемого действием ряда факторов, основным из которых является GM-CSF. Увеличение продукции гранулоцитов и макрофагов происходит под влиянием многих локально продуцируемых факторов, оказывающих строго согласованные по времени каскадные эффекты (Воробьев А.И., Абрамов М.Г., Бриллиант М.Д., 2002; Klamer S., Voermans C., 2014) .

Увеличение концентрации провопалительных цитокинов (TNF, MIP и др.) приводит к усилению синтеза IL-1, который в свою очередь стимулирует выработку других цитокинов клетками микроокружения. Поздняя дифференцировка определяется G-CSF и M-CSF факторами, соответственно (Yang F.C., Watanabe S. et. al., 1998). При дифференцировке КОЕГМ прослеживается саморегуляция этого процесса. Нейтрофилы вырабатывают M-CSF, увеличивающего число макрофагов, а макрофаги синтезируют, в том числе G-CSF, ускоряющих дифференцировку гранулоцитов .

Мезенхимопоэз 1.4 .

В отличие от гемопоэза, имеющего четкую иерархическую схему дифференцировки и развития ГСК, наличие общего предшественника и клеток разных стадий развития для ММСК пока не известны. Отсутствие специфических маркеров и морфологических признаков возможных предшественников разных стадий дифференцировки делает эту задачу чрезвычайно сложной .

Первоначально, ММСК были обнаружены в костном мозге (Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S., 1970; Friedenstein A.J., Deriglasova U.F. et. al., 1974), позднее ММСКподобные клетки были найдены в других органах. Показано, что они способны к циркуляции (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973). ММСК являются примордиальными клетками мезодермального происхождения, которые могут дифференцироваться в клетки соединительной и мышечной тканей, экспрессируют основные маркеры стромальных клеток, проявляют некоторые антигены стволовости, не несут антигены гистосовместимости и гемопоэтические маркеры и обладают высокой паракринной активностью. Главными функциями ММСК костного мозга являются: формирование гемопоэзиндуцирующего и стромального микроокружения (образование ниши ГСК и, возможно, ММСК);

самоподдержание и восстановление пула ММСК, участие в процессах репарации, регенерации и адаптации системы мезенхимальных клеток (Шахов В.П., Попов С.В., 2004). Большинство ММСК находятся в состоянии покоя (G0/G1 фазы клеточного цикла), только около 10% клеток участвуют в процессах пролиферации (Шахов В.П., Попов С.В., 2004) .

Рисунок 8. Иерархическая модель мезинхимопоэза (по Arnold I .

Caplan, James E. Dennis 2006) .

В свою очередь, было установлено, что покоящиеся клетки представляют собой неоднородную популяцию. Часть из них оказалась прекоммитирована в определенном направлении, другая – некомментированный пул (МСКн). МСКн – малые, агранулярные клетки с низкой клоногенной активностью, не экспрессирующие маркеры остеогенных и/или адипогенных предшественников. Они не реагируют на Ki-67 антиген клеточного цикла, чем отличаются от других покоящихся ММСК костного мозга. Число МСКн не превышает 1% от общего числа клеток культуры (Шахов В.П., Попов С.В., 2004). Несмотря на то, что доказательства существования МСКн получены при изучении культуры костного мозга in vitro, их можно рассматривать как низкодифференцированные клетки, обеспечивающие самоподдержания пула стромальных предшественников. Помимо медленно пролиферирующих некоммитированных ММСК в культуре присутствовали клетки обладающие высоким пролиферативным потенциалом, способные дифференцироваться в остео-, адипо, хондро- и миогенном направлении. Причем степень коммитированности (от поли- до унипотентности) клеток этой популяции была разной. Наличие клеток разной степени коммитированности, начиная от некоммитированных покоящихся клеток базового звена, и наличие клетокпредшественников с постепенным снижением пролиферативного и дифференцировочного потенциала, позволила предположить наличие иерархической структуры мезинхимопоэза .

Впервые, в 1995 г. Caplan A. выдвинул гипотезу «мезенгенного процесса». Впоследствии, были предложены модели мезенхимопоэза, предполагавшие наличие иерархии клетокпредшественников (рисунок 8). Отсутствие маркерных генов разных популяций ММСК, их пластичность и способность изменять фенотип в зависимости от внешнего окружения, а также невозможность проследить последовательную дифференцировку потомков исходной клетки не позволяет с высокой степенью вероятности сделать вывод об истинном процессе мезинхимопоэза .

История медико-биологических исследований в космосе 1.5 .

В середине 50-х годов возникшая в то время новая дисциплина - космическая медицина должна была решить две основные задачи для достижения цели пребывания человека в космосе. Первой задачей было определение критических значений факторов космического полета для жизнедеятельности живых объектов и разработка систем жизнеобеспечения в космическом полете. По мере увеличения длительности полетов возникла необходимость в детальном изучении механизмов влияния факторов космического полета на структуру и метаболизм тканей, клеток и, в последующем, изменения на молекулярно-генетическом уровне .

Эта задача реализовывалась путем многочисленных медико-биологических исследований в разных научных программах. Основные данные были получены в исследованиях на аппаратах «Бион», «Фотон-М» и в космических модулях «Skylab», «Spacelab», «SPACEHAB» .

Разработанная в конце 60-х годов XX века в СССР научная программа автономных биологических спутников «Бион» позволила понять многие ключевые механизмы физиологических процессов, возникающих в космическом пространстве. Были заложены основы понимания причин изменений в костной-мышечной системе, гемодинамики, гемопоэза, нейровестибулярной и сенсомоторной систем .

С 1973 по 1997 гг. в космос было запущено 11 биоспутников. Длительность полетов была разной и составила от 5 до 22,5 суток. Исследования проводились на представителях разных таксономических групп млекопитающих, земноводных, пресмыкающихся, рыб, членистоногих, моллюсков, растений и микроорганизмов (Григорьев А.И., Ильин Е.А., 2007) .

Изучалось влияние факторов космического полета на клеточные культуры. В этот период были реализованы уникальные космические программы: проведены эксперименты по изучению эффектов искусственной силы тяжести величиной 1 g в условиях космического полета («Космос-782», «Космос-936», «Космос-1229», «Бион-11»), космический радиобиологический эксперимент на борту спутника «Космос-690», который продолжался 20,5 суток, а также ряд эмбриологических экспериментов («Космос-1129», «Космос-1514»). С 1997 года программа «Бион» была приостановлена, и только через 16 лет в 2013 году состоялся запуск первого биоспутника «Бион-М1» возрожденной программы .

Благодаря современным методам исследований на новом этапе стало возможным более глубокое и точное понимание процессов, изучавшихся ранее, уже на молекулярнобиологическом и молекулярно-генетическом уровнях. Длительность полета «Бион-М1»

составляла 30 суток на высоте 575 км, это максимальные продолжительность полета и высота орбиты биоспутника на настоящий момент. Научная программа «Бион-М1» была очень разнообразной и состояла из 4 основных частей. Первая часть посвящена экспериментальным исследованиям по гравитационной физиологии на животных. Вторая часть посвящена исследованиям влияния факторов космического полета и открытого космического пространства на биологию микроорганизмов и растений, а также их сообществ. Третья часть включала биотехнологические эксперименты. Четвертая часть представляла собой комплекс радиобиологических и дозиметрических экспериментов, необходимых для решения задач обеспечения радиационной безопасности новых космических пилотируемых аппаратов (Сычев В.Н., Ильин Е.А. и др., 2014) .

Влияние факторов космического полета на костный мозг 1.6 .

Костный мозг тесно связан с костной и сердечно-сосудистой системами, которые, как известно, наиболее остро реагируют на изменения величины силы тяжести, сопровождающих космический полет. Помимо этого, являясь депо прогениторов разных клеточных дифферонов, костный мозг подвержен воздействию ионизирующей радиации, уровень которой на орбитальных высотах отличается от нормальных земных значений. Поэтому, влияние факторов космического полета на костный мозг изучалось с момента запуска первого космического аппарата «Бион-1»/ Космос-605 (таблица 3) .

Таблица 3. Основные результаты по изучению влияния факторов космического полета на костный мозг грызунов

–  –  –

Причиной обнаруженных изменений в системах костной и гемопоэтической тканей может являться воздействие факторов космического полета на стволовые и прогениторные клетки костного мозга (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977; Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Wronski T.J., Morey E.R., 1983; Jee W.S., Wronski T.J. et. al., 1983; Швец В.Н., Вацек А. и др., 1984; Vacek A., Serova L.V. et al., 1985; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987;

Ильин Е.А., Капланский А.С., Савина Е.А, 1989; Vacek A., Michurina T.V. et. al., 1991; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et al., 1996; Allebban Z., Gibson L.A. et. al., 1996; Domaratskaya E.I., Michurina T.V. et. al., 2002) .

Обобщение результатов, полученных после 7-22 суточных полетов крыс Вистар на биоспутниках «Космос»/«Бион», позволило сделать вывод, что в результате полетов происходит снижение числа прогениторных гемопоэтических клеток в костном мозге (Wronski T.J., Morey E.R., 1983; Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Vacek A., Tkadlecek L .

et al., 1982; Vacek A. et al., 1991). При сохранении клеточности и общей митотической активности кариоцитов костного мозга на уровне контроля (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977;

Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et al., 1996), было выявлено угнетение эритроидного ростка, который был представлен небольшими по численности и редко расположенными группами клеток, и лимфоидного ростка при усилении гранулоцитопоэза в костном мозге, с одновременным уменьшением числа ретикулоцитов в крови (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977, Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Vacek A., Tkadlecek L. et. al., 1982; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987;

Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991; Domaratskaya E.I., Michurina T.V. et al., 2002). Не было выявлено существенных изменений состава костного мозга – большое число клеток костного мозга составляли зрелые нейтрофилы, среди них встречались группы незрелых клеток типа миелобластов и промиелоцитов. Встречались отклонения в строении отдельных типов клеток, в основном у мегакариоцитов (Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Vacek A., Tkadlecek L. et. al., 1982; Швец В.Н., Вацек А. и др., 1984; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991) .

Способность дифференцировки стволовых клеток в клетки эритроидного и миелоидного рядов не нарушались. Наблюдалось небольшое процентное преобладание гранулоцитарных элементов и их ранних предшественников в миелограмме у крыс полетной группы, сопровождающееся увеличением числа лейкоцитов и нейтрофилов в крови, что указывает на усиление гранулоцитопоэза в условиях космического полета. Активный гранулоцитопоэз, возможно, был обусловлен снижением резистентности организма к инфекциям. Эти изменения проходили на фоне снижения физиологической регенерации гемопоэза у крыс после полета (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977). Содержание Т- и В-лимфоцитов в селезенке существенно не менялось, тогда как количество Т-лимфоцитов в костном мозге увеличивалось при снижении их пролиферативной активности. Также снижалась цитотоксическая активность NK-клеток .

Наблюдалась инволюция лимфоидной ткани в тимусе (Швец В.Н., Вацек А. и др., 1984). После космического полета ответ кариоцитов костного мозга на действие GM-CSF был слабее, чем в контрольных группах, более того увеличилась экспрессия пан-Т-клеточного, Т-хелперного, Тсупрессорного маркеров и рецептора к IL-2 в костном мозге и селезенке (Ronca A.E., Souza K.A., Mains R.C., 2015). Похожие результаты были получены у обезьян после полета на биоспутнике «Космос 2229». У животных снижалась чувствительность клеток костного мозга к GM-CSF. Также было обнаружено уменьшение числа клеток, несущих лейкоцитарный антиген, как в костном мозге, так и в периферической крови. Т-клетки оказались более чувствительны к действию факторов космического полета, чем В-лимфоциты .

Исследования КОЕ методом селезеночных колоний показали существенное (в 20 раз) снижение числа КОЕ в костном мозге и нулевую пролиферативную активность клеток .

Эритроидная дифференцировка оставшихся КОЕ была существенно заторможена, а гранулоцитарная, напротив, усилена. Эти результаты хорошо согласуются с наблюдениями, описанными для костного мозга in situ (Швец В.Н., Вацек А. и др., 1984; Vacek A., Serova L.V .

et al., 1985) .

Результаты, полученные в ходе космического радиобиологического эксперимента, где животные были облучены в суммарной дозе 8 Гр (800 рад) в течении 24 суток, в целом не отличались от данных после полетов других биоспутников. Наблюдалось снижение числа миелокариоцитов, КОЕ, угнетение эритропоэза, уменьшение массы селезенки и тимуса .

Однако, был отмечен более активный миелопоэз у облученных животных, выражавшийся в высоком уровне лейкоцитов, нейтрофилов и молодых форм гранулоцитов (Григорьев Ю.Г., Дружинин Ю.П. и др., 1977). Морфологический анализ селезеночных колоний, показал отсутствие существенных нарушений потенции к дифференцировке ГСК. Способность к формированию колоний эритроидного и миелоидного типов не менялась (Григорьев Ю.Г., Дружинин Ю.П. и др., 1977). Стоит отметить, что в данном исследовании была группа крыс т.н .

модельного эксперимента, в котором воспроизводились все условия полета биоспутника «Космос-690», за исключением микрогравитации. Данные, модельного эксперимента, коррелировали с результатами, полученными после космического полета, но восстановление гемопоэтической ткани в полетном эксперименте происходило более медленными темпами по сравнению с регенерацией гемопоэза в модельном эксперименте и к 27 суткам реадаптации было не полным (Швец В.Н., 1979) .

Таким образом, анализ гемопоэза у грызунов продемонстрировал наличие угнетающего действия факторов космического полета, которое носило обратимый характер и полностью компенсировалось через 25-27 дней реадаптации. Факторы космического полета не затрагивали потенции стволовых клеток, ответственных за воспроизводство клеточного состава костного мозга, и выявленные изменения касались, в основном, зрелых и созревающих клеток .

(Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981;Vacek A., Serova L.V. et al., 1985). Кроме этого, был выявлен эффект неоднозначного влияния микрогравитации и ионизирующего излучения на прогениторные гемопоэтические клетки костного мозга (Григорьев Ю.Г., Дружинин Ю.П. и др., 1977). Возможно, это связано, с более выраженным эффектом облучения на радиорезистентные клетки на борту биоспутника «Космос-690» (Григорьев Ю.Г., Дружинин Ю.П. и др., 1977), к которым можно отнести компоненты ниши костного мозга. Кроме этого, неполное восстановление гемопоэтического дифферона костного мозга в этом эксперименте, возможно связано со значительным повреждением клеточного компонента ГИМ .

Результаты, полученные в эксперименте на СЛС-1 и СЛС-2 с крысами линии СпрейгДоули после 9 – 15 суточного пребывания в условиях невесомости на МКС, в целом, соответствуют более ранним результатам экспериментов серии «Космос». Анализ костного мозга полетных крыс свидетельствует о торможении эритропоэза и лимфопоэза, снижением числа циркулирующих эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, усилении гранулоцитопоэза, сопровождающиеся снижением появления недифференцированных клеток, снижении содержания В-клеток, Т-хелперов и Т-супрессоров и активности иммунных клеток при сохранении митотической активности клеток костного мозга (Allebban Z., Gibson L.A. et .

al., 1996; Ichiki A.T., Gibson L.A. et. al., 1996; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et. al., 1996; Ronca A.E., Souza K.A., Mains R.C., 2015). Число КОЕ-Г, КОЕ-ГМ, КОЕ-М, БОЕ-Э было меньше по сравнению с контролем. Кроме этого, было снижено общее число лейкоцитов и абсолютное число лимфоцитов и моноцитов за исключением нейтрофилов, число циркулирующих эритроцитов по сравнению с контролем. Число CD4, CD8, CD2, CD3 и В-клеток в периферической крови также было снижено. Отличий среди резидентных лимфоцитов селезенки не было обнаружено (Ichiki A.T., Gibson L.A. et. al., 1996), но была снижена активность Т-лимфоцитов .

Пролиферация клеток костного мозга после полета не изменилась, и увеличивалась после двух недель реадаптации. Пролиферативная активность ГСК селезенки снижалась после полета и восстанавливалась до уровня контрольных значений после 14-суточной реадаптации .

Активность NK-клеток костного мозга не изменялась достоверно по сравнению с контролем. В общем, активность иммунных клеток в полете снижалась и увеличивалась через 14 суток реадаптации (Allebban Z., Gibson L.A. et. al., 1996; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et. al., 1996) .

Влияние микрогравитации на потенциал гемопоэтических клеток был изучен in vitro .

+ CD34 клетки после экспозиции в течение 8-10 суток на космических кораблях STS-63, 69 и 126 культивировали в жидкой среде на стромальном подслое. Было выявлено снижение пролиферации, кроме этого, число эритроидных и миелоидных колоний, было достоверно меньше по сравнению с контрольной группой. Клетки после экспозиции на МКС быстрее вступали в макрофагальную дифференцировку, чем клетки в наземном контроле (Davis T.A., Wiesmann W. et. al., 1996; Ronca A.E., Souza K.A., Mains R.C., 2015) .

К сожалению, исследования компартмента стромальных предшественников, вовлеченных в ремоделирование костной ткани, которые сейчас принято называть мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК), при проведении экспериментов на биоспутниках пока немногочисленны. Эксперименты в рамках программы «Бион» выявили уменьшение массы минерализованной ткани кости, увеличение жировой ткани в костном мозге, снижение количества остеобластов при сохранении числа остеокластов, угнетение периостального ремоделирования в трубчатых костях (Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Wronski T.J., Morey E.R., 1983). Кроме того, было продемонстрировано и уменьшение числа костномозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у полетных животных (Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987) .

Эксперименты на биоспутниках «Космос» также показали снижение минерализации костей, особенно длинных трубчатых, уменьшение количества остеобластов и их активности при сохранении или увеличении числа остеокластов и появлении ранних предшественников остеокластов (В кн. под ред. А.М. Генина; Рогачева И.В., Ступаков Г.Н. и др., 1984; Ильин Е.А., Капланский А.С., Савина Е.А., 1989; Дурнова Г.Н., Капланский А.С. и др., 1990). Происходило снижение скорости образования кости как в области периоста, так и части эндоста (В кн. под ред. А.М. Генина). Изменялась активность клеток костной ткани. У крыс под влиянием невесомости происходило угнетение активности щелочной фосфатазы и повышение активности кислой фосфатазы в костях (в кн. под ред. А.М. Генина, 1979; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987). Отмечено снижение содержания коллагена I типа в костной ткани и появление коллагена III типа, типичного для эмбриональных тканей, кожи и сосудов, а также ранних стадий воспаления и заживления, который в норме продуцируется клетками гладких мышц, фибробластами, ретикулярными клетками, но не остеобластами (Поспишилова И., Поспишил М., Серова Л.В., 1989). Число костно-мозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у полетных животных после 14 дней полета снижалось по сравнению с контрольными значениями (Vacek A., Bueverova E.I. et al., 1990) .

В эксперименте с моделированием эктопической кости в условиях невесомости на борту спутника «Космос-936» было показано, что факторы космического полета не влияют на развитие кости вне скелета. При этом костный мозг в эктопической кости, в основном, был представлен жировой тканью (Швец В.Н., 1979). Результаты, полученные в эксперименте на СЛС-1, СЛС-2, показали, что после 9 – 14 суточного пребывания в условиях невесомости, имелись начальные признаки развития остеопении большеберцовой кости и торможения роста кости в длину. Зафиксировано наличие мононуклеарных клеток-предшественников остеокластов (Воробьева Г.Н., 1994; Дурнова Г.Н. и др., 1996). Молекулярно-генетический анализ выявил снижение уровня экспрессии мРНК остеонектина, остеокальцина, коллагена I типа в клетках костной ткани бедренной кости (Evans G.L., Morey-Holton E., Turner R.T., 1998) .

Моделирование факторов космического полета в наземных условиях 1.7 .

Наземные модели, которые имитируют факторы космического полета, важны по многим причинам. В отличие от космических полетов, модельные эксперименты можно планировать, независимо от времени экипажа (если эксперименты проходят на борту МКС), по ходу эксперимента может быть проведена коррекция без изменения стоимости проекта, эксперимент можно разделить на несколько временных периодов, отставленных друг от друга и т.д. Кроме того, все манипуляции могут выполняться без строгих мер биологической и химической безопасности, обязательных для экспериментов в космическом полете. Эксперименты для набора статистически значимых результатов могут повторяться и расширяться. Ткани могут быть взяты у анестезированных животных в любое время во время эксперимента. Все эти процедуры, которые в лабораторных условиях являются рутинными, до сих пор считаются труднодостижимыми в условиях космического полета. Неотъемлемый вклад наземного моделирования в прогнозировании результатов экспериментов в космосе трудно переоценить .

Помимо этого, наземные модели позволяют изучить влияние конкретного фактора, в то время как в условиях космического полета мы имеем дело с совокупностью действия многих факторов, включая перегрузки и вибрацию на старте и спуске, транспортировку с посадочной площадки, время между посадкой спускаемого аппарата и забором образцов .

При разработке моделей, в том числе для изучения эффектов микрогравитации, основного фактора космического полета необходимо следовать строгому алгоритму. Этот процесс включает в себя: 1) анализ факторов космического полета, которые необходимо воспроизвести в модели; 2) определение физиологических реакций на исследуемый фактор, который воспроизводит модель; 3) проектирование и разработка систем для изучения этих аспектов; 4) сбор и анализ данных при моделировании; 5) сравнение данных с результатами после космического полета; и 6) определение ограничений модели. К примеру, первичные физиологические реакции позвоночных на действие факторов космического полета включают перераспределение жидкости, смещение некоторых органов, разгрузку скелетно-мышечной системы и отсутствие афферентной инервации вестибулярной системы (Morey-Holton E.R, Globus R.K, 2002) .

Моделирование основных факторов космического полета (микрогравитация, ионизирующее излучение, вибрация, перегрузка), несмотря на некоторые ограничения каждой модели, с достаточной точностью воспроизводят эффекты, возникающие во время космического полета. Кратковременное действие невесомости на период до 30 – 40 секунд изучают во время параболических полетов самолетов (в кн. «Человек в космическом полете»

под редакцией В.В. Антипова, А.И. Григорьева, К. Лич Хантун, 1997) .

По объектам исследования экспериментальные модели можно разделить на три группы:

1 – моделирование, где в качестве испытуемого выступает человек, 2 – модели с использованием лабораторных животных (собаки, обезьяны и мелкие грызуны), 3 – моделирование факторов космического полета на клеточных культурах .

Общепризнанными моделями для изучения влияния эффектов микрогравитации на организм человека является гипокинезия, антиортостатическая гипокинезия и метод «сухой»

иммерсии (Козловская И.Б., 2008). Помимо этого очень важным в космическом полете является психологическое состояние членов экипажа. Особенности их поведенческих реакций изучаются в изоляционных экспериментах (HUBES, ЭКОПСИ – 95, SFINCSS-99, Марс-500, Луна 2015) (http://www.imbp.ru/WebPages/win1251/Science/Science.HTML; http://mars500.imbp.ru/;

http://www.imbp.ru/WebPages/win1251/News/2015/Moon2015-03.html) .

Для моделирования условий микрогравитации в клеточных культурах и растениях используют 2D и 3D ротационные клиностаты, тубы свободного падения и диамагнитную левитацию в высоком градиенте магнитного поля (Таирбеков М.Г., 2000; Буравкова Л.Б., Гершович П.М. и др., 2010; Xianyuan Y., Zhe W. et al., 2014). Эффекты облучения создают специальными установками с источником ионизирующего излучения (Seed T.M. et al., 2002;

Штемберг А.С., Лебедева-Георгиевская К.Б. и др., 2014) .

В данной работе изучалось влияние факторов космического полета и моделирования его эффектов на организм грызунов, поэтому на описании моделей, касающихся их, остановимся более подробно .

1.7.1. Гипокинезия

Известно, что в условиях космического полета происходит снижение двигательной активности. Поэтому, одной из первых моделей для лабораторных животных была гипокинезия .

Для ее создания животных помещали в тесные клетки или клетки-пеналы, таким образом, уменьшая число активных локомоций. Преимущество данного способа было в том, что условия, воссоздаваемые в ней, были практически идентичны, условиям, получаемым при гипокинезии человека (Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н., 1980), за исключением одного важного аспекта, животные, находясь в ограниченном объеме, испытывали опорную нагрузку на дистальные отделы конечностей. Используя данную модель, исследователи описали изменения всех физиологических систем грызунов (Португалов В.В., Капланский А.С., Дурнова Г.Н., 1971;

Капланский А.С., Дурнова Г.Н., Маилян Э.С., 1980; Дурнова Г.Н., Капланский А.С., Глаголева Е.В., 1983; Дурнова Г.Н., Капланский А.С., 1983; Капланский А.С., Дурнова Г.Н., ИльинаКакуева Е.И., 1983; Капланский А.С., Кабицкая О.Е. и др., 1984; Капланский А.С., Воротникова Е.В., 1985; Капланский А.С., Дурнова Г.Н. и др., 1987; Дурнова Г.Н., Воротникова Е.В., Продан Н.Г., 1987) .

В условиях гипокинезии во время резкого перехода от обычной двигательной активности к существенному ее ограничению наблюдаются изменения системы крови .

Неспецифические изменения, обусловленные сопутствующей стресс-реакцией, развиваются в первые две недели эксперимента. После трех недель ограничения подвижности повышение уровня сывороточных глюкокортикоидных гормонов отсутствовало (Gaignier F., Schenten V et al., 2014). Специфические изменения, характерные для гипокинезии, являлись результатом детренированости систем организма и возникают на более поздних сроках (Швец В.Н., 1979) .

При длительной гипокинезии в костном мозге мышей на 3 день наблюдалось увеличение числа миелоцитов, с последующей стабильностью клеточности и состава костного мозга до 45 дня включительно. При этом лимфоидные органы, реагировали более остро. Время полуопустошения тимуса составило 1 – 3 дня, селезенки и лимфатических узлов 5 и 4 дня соответственно. Трехнедельное ограничение подвижности приводило к уменьшению количества ядросодержащих клеток в селезенке и общего числа лимфоцитов (Gaignier F., Schenten V. et al., 2014). Уменьшалось число В-лимфоцитов, а общее количество Т-лимфоцитов увеличивалось. Гиподинамия негативно сказывалась на активации Т-лимфоцитов in vitro, в особенности CD4+-Т-клеток (Gaignier F., Schenten V. et al., 2014). В периферической крови данные изменения сопровождались снижением числа лимфоцитов и увеличением числа зрелых нейтрофилов (Ракова И.А., Швец В.Н., 1978; Швец В.Н., 1979, Бурковская Т.Е., Ворожцова С.В., 1988). Схожая картина наблюдалась при введении облученным мышам-реципиентам, суспензии клеток костного мозга мышей, после гипокинезии .

В работах Швеца В.Н. показано, что увеличение клеточности костного мозга мышей может быть связано с перераспределением Т-лимфоцитов и преимущественным их расположением в костном мозге. (Швец В.Н., 1979, Бурковская Т.Е., Ворожцова С.В., 1988) .

Анализ клеточного состава костного мозга выявил снижение числа гранулоцитарных клеток в костном мозге и увеличение числа эритроидных и лимфоподобных клеток (Бурковская Т.Е., Ворожцова С.В., 1988). Причем, наличие последних приводило к усилению эритропоэза (Швец В.Н., 1979). Изменения кроветворения у крыс при длительной гипокинезии несколько отличались от данных полученных на мышах. На фоне активации в начальный период гранулоцитопоэза, происходило увеличение количества, как молодых, так и зрелых форм, число лимфоцитов в костном мозге постепенно убывало. Число эритроидных клеток оставалось в пределах нормы, при этом, численность популяции ранних предшественников изменялась значительно (Ракова И.А., Швец В.Н., 1978). К 15 дню гипокинезии их число увеличивалось вдвое, и только после 30 суток ограничения двигательной активности начиналось незначительное снижение их количества (Швец В.Н., 1979). Данное увеличение коррелировало с подъемом уровня ретикулоцитов в периферической крови. На второй неделе ограничения подвижности в костном мозге крыс обнаруживались патологически изменённые мегакариоциты с гиперхромным ядром и оксифильной цитоплазмой, при этом, число тромбоцитов в крови было стабильно больше нормы (Ракова И.А., Швец В.Н., 1978) .

В условиях гипокинезии в органах кроветворения грызунов происходит ряд специфических изменений: усиление эритропоэза, угнетение и нарушение лимфо- и миелопоэза, появление атипичных мегакариоцитов. Данный феномен, а в особенности реакция красного ростка костного мозга, является специфической реакцией кроветворной системы грызунов на ограничение подвижности .

1.7.2. Антиортостатическое вывешивание

В середине 1970-х годов в Институте медико-биологических проблем рабочей группой под руководством Е.А. Ильина была разработана модель разгрузки задних крыс для моделирования невесомости. Параллельно с советскими учеными в Национальном исследовательском центре США по исследованиям в области аэронавтики и космонавтики (НАСА) была предложена аналогичная модель, отличающаяся незначительными техническими аспектами (Ильин Е.А., Новиков В.Е., 1980; Ильин Е.А., Капланский А.С., 1998; Morey-Holton E.R., Globus R.K, 2002). С момента своего создания эта модель не потеряла своей актуальности и стала наиболее часто применяемой в большинстве лабораторий, изучающих различные аспекты влияния микрогравитации на скелетно-мышечную систему и организм в целом (рисунок 9) .

В данной модели, для создания антиортостаза, приводящего к перераспределению жидкости в краниальном направлении и снятию статической опорной нагрузки с задних конечностей, животных подвешивают за основание хвоста или пояс задних конечностей под углом 30°. При этом животные крепятся так, чтобы они могли свободно передвигаться в пределах клетки и не имели затруднений к подходу к кормушке и поилке .

Рисунок 9

Рисунок 9. Схематичное изображение вывешивания (Adelton Andrade Barbosa, Ricardo Junqueira Del Carlo, Simone Rezende Galvo, Marcelo Jos Vilela, Mrio Jefferson Quirino Louzada, Ana Flora Sousa Brito, Antonio Jos Natali; Rev .

Ceres, Viosa, v. 58, n.4, p. 407-412, jul/ago, 2011; http://dx.doi.org/10.1590/S0034-737X2011000400001) Преимущества этой модели состоят в том, что вывешивание возможно сочетать с другими воздействиями, таких как, радиация, введение патогенов или лекарственных препаратов; для некоторых систем органов существует большой объем данных по реакции на вывешивание; отсутствие ограничения на использование генетически модифицированных линий животных; можно анализировать восстановление после вывешивания (Globus R.K., Morey-Holton E., 2016). К ограничениям можно отнести несоответствие результатов по изучению стрессовых реакций в разных экспериментах, весовую загрузку передних конечностей и неоднозначное влияние антиортостатического вывешивания на позвоночник (Globus R.K., Morey-Holton E., 2016) .

Использование этой модели дает возможность проводить активные исследования в таких важных областях как регенерация тканей, стволовые клетки, распознавание патогенных агентов, состояние желудочно-кишечного тракта (микрофлора и проходимость) .

1.7.3. Влияние антиортостатического вывешивания на организм Модель антиортостатического вывешивания грызунов вначале использовалась для изучения реакции костно-мышечного аппарата и сердечно-сосудистой системы при моделировании эффектов микрогравитации. Кроме этого, модель вывешивания широко используется для изучения иммунной и нервной систем, процессов регенерации тканей в условиях космического полета и восстановления после него. При моделировании эффектов микрогравитации получаемые данные могут варьировать и зависят от многих параметров:

возраст, вес, пол, вид, линия, длительность экспозиции. В коротких экспериментах наблюдается острая фаза ответа организма, в то время как в длительных – мы имеем дело с адаптацией к опорной разгрузке. На основе результатов, полученных в этих экспериментах можно делать долгосрочные прогнозы для членов экипажей МКС (Globus R.K., Morey-Holton E., 2016) .

Эксперименты с использованием этой модели внесли большой вклад в понимание причин и патогенеза изменений, возникающих в костной и мышечной тканях во время космических полетов. Накоплен большой объем данных по изменению морфофункциональных параметров мышечной ткани в условиях опорной разгрузки (Baldwin K.M, Herrick R.E, McCue S.A., 1993; Litvinova K.S., Vikhlyantsev I.M, et al., 2005; Stein T.P, Wade C.E., 2005; Таракин П.П., Гасникова Н.М. и др., 2006; Литвинова К.С., Таракин П.М. и др., 2007; Baldwin K.M., Haddad F. et al., 2013; Bodine S.C., 2013; Kwon O.S, Tanner R.E. et al., 2015; Globus R.K., MoreyHolton E., 2016) .

Неоспорим вклад этой модели в изучении гемодинамики в сосудах задних конечностей при функциональной разгрузке и гендерного различия реактивности сосудов головного мозга .

Кроме этого она может быть полезной при отработке контрмер против ортостатической неустойчивости (Platts S.H., Bairey Merz C.N. et al., 2014; Hackney K.J., Scott J.M. et al., 2015;

Norsk P., Asmar A. et al., 2015) .

Результаты экспериментов с грызунами в космосе демонстрируют специфические изменения сердечно-сосудистой системы (Globus R.K., Morey-Holton E., 2016; Sofronova S.I., Tarasova O.S. et al., 2015). Во время антиортостатического вывешивания грызунов вследствие перераспределения жидкости и физической детренированости частично воспроизводятся эффекты в сердечно-сосудистой системе, развивающиеся во время космического полета человека (Overton J.M., Woodman C.R., Tipton C.M., 1989; Brizzee B.L., Walker B.R., 1990;

Woodman C.R., Sebastian L.A., Tipton C.M., 1995; Maurel D., Ixart G. et al., 1996; Colleran P.N., Wilkerson M.K. et al., 2000; Powers J., Bernstein D., 2004; Wilkerson M.K., Lesniewski L.A. et al., 2005; Moffitt J.A., Henry M.K. et al., 2013). У крыс развивались региональные изменения гемодинамики схожие с таковыми в космическом полете (Ray C.A., Vasques M. et al., 2001;

Wilkerson M.K., Colleran P.N., Delp M.D., 2002), причем у самок этот процесс более выражен по сравнению с самцами (Colleran P.N., Wilkerson M.K. et al., 2000). Интересно, что у мышей эффекты, развивающиеся при антиортостатическом вывешивании (Taylor C.R., Hanna M. et al., не в полной мере повторяют реакции сердечно-сосудистой системы в условиях 2013), космического полета (Ogneva I.V., Maximova M.V. et al., 2015) .

При изучении стресс-реакции, в патогенезе которой лежит активация гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси и симпатического отдела нервной системы, во время космического полета наблюдали повышение уровня кортикостероидных гормонов надпочечников, гормона роста, адреналина или норадреналина, снижение массы тела или отсутствие роста, атрофию лимфоидных органов или увеличение массы надпочечников (Globus R.K., Morey-Holton E., 2016). Однако, до сих пор до конца не ясно, развиваются ли эти изменения во время космического полета, или они возникают во время посадки и взятия биоматериала, так как уровень этих гормонов в крови меняется очень быстро в зависимости от условий. Кроме того, атрофия лимфоидных органов и уменьшение массы тела не являются специфическими признаками стресс-реакции. Использование модели антиортостатического вывешивания, также не позволило прояснить ситуацию .

Выявленные изменения варьировали в широком диапазоне и зависели от многих факторов: пол, возраст, вид и линия экспериментальных животных, диета, продолжительность эксперимента, способ вывешивания (Tou J.C., Arnaud S.B. et al., 2005), и выделить действие стресса в такой ситуации, крайне тяжелая задача. Уровень стресса у членов экипажей определяют по концентрации кортизола в биологических жидкостях организма. Было показано значительное индивидуальное отклонение в содержании кортизола, причем изменения носили транзиторный характер (Stowe R.P., Sams C.F, Pierson D.L., 2011). Все вышесказанное говорит, что оценка уровня стресса является весьма трудной задачей. В экспериментах с животными мы получаем важные данные, но в их интерпретации необходимо учитывать многие факторы, особенно, когда они экстраполируются на человека .

В условиях космического полета и при моделировании эффектов микрогравитации в костях грызунов также отмечались негативные изменения. Происходила резорбция губчатой костной ткани и замедление обновления компактной (кортикальной) ткани. В основном, повреждения происходили в тех областях скелета, которые подвергаются механическим нагрузкам при ходьбе и статических позах (Giangregorio L, Blimkie C.J., 2002; Morey-Holton E, Globus R.K. et al., 2005). Интересно отметить, что у крыс во время космического полета снижение костной массы происходит, в основном, из-за снижения скорости роста организма (крысы – это животные, которые растут на протяжении всей жизни), а не деградации костной ткани. В то время, как у мышей наблюдается постоянное усиление резорбции костей, т.е .

непосредственное влияние на физиологические процессы в костной ткани (Smith S.M, Heer M .

Возможно поэтому, мыши стали использоваться чаще в качестве et al., 2015) .

экспериментальных животных в опытах, в условиях реального космического полета или моделирования его факторов (микрогравитации), по изучению процессов, вызывающих деградацию костной ткани, для разработки профилактических мероприятий в экипажах МКС и, в перспективе, межпланетарных экспедиций .

1.7.4. Влияние антиортостатического вывешивания на костный мозг Косный мозг и костная ткань тесно связаны с друг другом. Их морфофункциональные показатели находятся в динамическом равновесии. Преобразования одной системы влекут изменения в другой. В зоне эндоста находится ниша гемопоэтических стволовых клеток .

Повреждение архитектоники костной ткани приводит к изменению гемопоэза в костном мозге, выражающееся, в том числе, в нарушении иммунитета и состава периферической крови .

Во время вывешивания происходило снижение костной массы задних конечностей мышей. При этом на ранних сроках в костном мозге, число стромальных предшественников (ММСК) с остеогенными потенциями снижалось, а остеокластов и адипоцитов увеличивалось .

После двух недель вывешивания их численность не отличалась от таковых в контроле (Hamrick M., Shi X. et al., 2007; Shahnazari M., Kurimoto P. et al., 2012). Было отмечено, что при неизменном числе КОЕ-ф костного мозга крыс после вывешивания, количество КОЕ-ф, экспрессирующих щелочную фосфатазу значительно снижалось. Уменьшалась и их пролиферативная активность. При этом наблюдалось уменьшение костной массы и остеобластов (Basso N., Jia Y. et al., 2005). На третьей неделе вывешивания мышей в костномозговых стромальных предшественниках снижалось количество мРНК следующих белков: остеокальцин (ОС), костный сиалопротеин (BSP), белки семейства АР, костный морфогенетический белок 1 (BMP1), энханцер проколлаген С-эндопептидазы 1,2 (PCOLCE1,2), фактор стромальных клеток SDF-1/CXCL12. В тоже время экспрессия мРНК металл-протеиназ (MT1-MMP, MMP9), рецептора к SDF-1 (CXCR4) и белка стромальных клеток (Stro1) увеличивалась (Visigalli D., Strangio A. et al., 2010). Эти белки участвуют в поддержании гомеостаза костной ткани и регулировании гемопоэза. Изменения экспрессии этих генов свидетельствует о нарушении данных процессов во время вывешивания. При антиортостатическом вывешивании в скелете мышей показаны отрицательный баланс кальция и уменьшение плотности костной ткани, наблюдаемые у космонавтов. При этом, экспрессия маркеров костеобразующих элементов оставалась неизменной (Smith S.M, Heer M. et al., 2015) .

Негативные изменения в костной ткани происходили на фоне резкого уменьшения кровоснабжения костей задних конечностей, причем этот процесс усугубляется со временем (Colleran P.N., Wilkerson M.K. et al., 2000). В результате сосудистой перестройки, повреждения эндотелий-зависимого механизма вазодилятации и изменений костной структуры нарушается кровоснабжение костного мозга (Stabley J.N., Prisby R.D. et al., 2013; Prisby R.D., Behnke B.J. et al., 2015) .

Несмотря на существующие различия данных полученных, во время космического полета и моделирования эффектов микрогравитации, установлено влияние стресса на иммунную систему, как у членов экипажей, так и у экспериментальных животных (Lawler J.M., Song W., Demaree S.R., 2003; Chowdhury P., Soulsby M.E., Scott J.L., 2009; Stowe R.P., Sams C.F., Pierson D.L., 2011; Crucian B., Simpson R.J. et al., 2014). В экспериментах с грызунами было показано, что космический полет может влиять как на врожденный, так и приобретенный иммунитет. Происходит истощение пула лимфоцитов и перераспределение B- и T-клеток, изменение экспрессии генов и синтеза цитокинов, снижение массы лимфоидных органов (Pecaut M.J., Simske S.J., Fleshner M., 2000; Gueguinou N., Huin-Schohn C. et al., 2009). На фоне усиления экспрессии генов антиоксидантной системы и ослабления провоспалительных реакций нарушается антигенспецифическая толерантность, что приводит к усилению экспрессии провоспалительных цитокинов (Baqai F.P., Gridley D.S. et al., 2009; Chang T.T., Spurlock S.M. et al., 2015). Анализ экспрессии генов системы апоптоза, показал активацию этого процесса в лимфоцитах, в том числе за счет белков теплового шока (Novoselova E.G., Lunin S.M. et al., 2015). В костном мозге наблюдается увеличение числа зрелых гранулоцитов (Ortega M.T., Pecaut M.J. et al., 2009). Усиление перекисного окисления липидов мембран эритроцитов мышей во время 90 суточного полета на МКС (Rizzo A.M., Corsetto P.A. et al., 2012) даже после увеличения экспрессии генов антиоксидантной системы свидетельствует о недостаточности компенсаторных механизмов и развивающейся системной воспалительной реакции. Стоит обратить внимание, что патогенез изменения реактивности иммунитета разных стадий космического полета может отличаться, но результат при этом, остается неизменным – дисфункция иммунной системы (Моруков Б.В., Рыкова М.П. и др. 2010; Рыкова М.П., 2013) .

После антиортостатического вывешивания у крыс было обнаружено умеренное снижение общей клеточности костного мозга и численности основных ростков кроветворения, в особенности гранулоцитарного (Зубхая Т.М., Ефимов В.И., 1995), при этом при антиортостатическом вывешивании у грызунов отмечен кратковременный период активации иммунитета, в основном врожденного, возможно, вследствие нарушения работы желудочнокишечного тракта. Воспаление и повреждение его слизистых оболочек приводит к транслокации бактерий из просвета кишечника в кровоток и развитию эндопортальной токсемии у крыс и мышей (Rivera C.A., Tcharmtchi M.H. et al., 2003). В дальнейшем развивается системная воспалительная реакция, выражающаяся в измененной сосудистой реактивности, нарушении экспрессии toll-like и инсулиновых рецепторов в мышечной ткани, повышении экспрессии маркеров окислительного стресса в разных тканях (Lawler J.M., Song W., Demaree S.R., 2003; Chowdhury P., Soulsby M.E., Scott J.L., 2009; Zhang R., Bai Y.G. et al., 2009; Kwon O.S., Tanner R.E. et al., 2015). Уменьшалось число ядросодержащих клеток в селезенке, развивалась лимфоцитопения (Gaignier F., Schenten V. et al., 2014). Снижалось число Влимфоцитов, при этом количество Т-лимфоцитов увеличивалось. При стимуляции Тлимфоцитов in vitro липополисахаридом, число активированных клеток было ниже по сравнению с контролем, в особенности CD4 положительных (Gaignier F., Schenten V. et al., 2014). В костном мозге происходит нарушение B-клеточного лимфопоэза и функциональной активности CD4+-лимфоцитов, в том числе лимфоцитов памяти (Nash P.V., Konstantinova I.V. et al., 1992; Miller E.S, Sonnenfeld G., 1994; Pecaut M.J., Simske S.J., Fleshner M., 2000; Lescale C., Schenten V. et al., 2015). В конечном итоге изменения, возникающие при вывешивании, приводят к увеличению смертности, уменьшению продолжительности жизни и снижению бактериальной резистентности (Aviles H., Belay T. et al., 2003) .

Результаты, полученные в экспериментах на животных, в принципе, коррелируют с данными полученных у космонавтов. Космический полет влияет как на врожденный, так и приобретенный иммунитет, происходят аналогичные изменения в формуле периферической крови (Stowe R.P., Sams C.F., Pierson D.L., 2011; Рыкова М.П., 2013) .

Несмотря на некоторые различия в специфике иммунных нарушений, возникающих при вывешивании животных и космическом полете у членов экипажа (Gueguinou N., Huin-Schohn C .

et al., 2009; Crucian B., Simpson R.J. et al., 2014), модель антиортостатической разгрузки задних конечностей грызунов позволяет анализировать изменение устойчивости к патогенам, так и возможные контрмеры в условиях микрогравитации (Armstrong J.W., Balch S., Chapes S.K., 1994; Aviles H., Belay T. et al., 2004; Li M., Holmes V. et al., 2015) .

1.7.5. Влияние ионизирующего излучения на костный мозг

Помимо микрогравитации ионизирующее излучение является основным фактором космического пространства (полета), влияющее на живой организм. Радиационные условия внутри отсеков космических аппаратов формируются совокупностью полей заряженных (солнечные и галактические космические лучи, радиационные поля Земли) и нейтральных частиц в широком энергетическом диапазоне (Хулапко С.В., Лягушин В.И. и др., 2014). Состав галактических космических лучей представлен в основном ядерной компонентой (93%), из них 6.5% - это ядра гелия и 1% – более тяжелых ядер. Число электронов не превышает 1% от числа ядер, а позитронов 10% от числа электронов. Антиадроны составляют менее 1%. В состав солнечных космических лучей входят протоны, более тяжёлые ядра и электроны. Внутренний радиационный пояс Земли на высоте 4000 км, состоит преимущественно из протонов с энергией в десятки МэВ, внешний радиационный пояс на высоте 17 000 км, состоит преимущественно из электронов с энергией в десятки кэВ. Кроме этого экипаж подвергается воздействию электромагнитного излучения широкого диапазона длин волн, в частности, коротковолнового компонента (рентгеновское и -излучение) .

Понятие радиочувствительности было введено для сравнительной характеристики доли инактивированных клеток различных тканей или погибших животных после облучения в разных дозах (Шафиркин А.В., 2008). Оно характеризует приращение относительного числа биообъектов на единицу дозы. Согласно закону Бергонье и Трибондо показано, что радиочувствительность делящихся клеток в размножающихся клеточных популяциях тем выше, чем выше скорость их пролиферации. К радиочувствительным тканям и органам относят кроветворные органы, в частности, костный мозг, эпителий слизистой оболочки тонкого кишечника, эпидермис. Наряду с радиочувствительными тканями выделяют ряд радиорезистентных: мышечная, костная, нервная, сосудистый эпителий (Шафиркин А.В., 2008) .

Наиболее чувствительная к действию ионизирующего излучения кроветворная ткань поражается в диапазоне доз 2,0 – 3,0 Гр (Шафиркин А.В., 2008) .

В последнее время все больше внимания обращает на себя изучение формы кривой дозаэффект в области малых доз до 1 Гр. Этот диапазон наиболее интересен т.к. при радиационном воздействии космических излучений на космонавтов характерны подобные значения доз (Шафиркин А.В., 2008). Доза легкого компонента космического излучения во время эксперимента «Бион-М1» в отсеках, где размещались отсеки с мышами, составила 31,7±3,0 мГр (Иноземцев К.О., Кушин В.В., 2015). Обнаружено, что кривая доза-эффект для некоторых клеточных линий, в том числе и радиорезистентных, на начальном участке с ростом дозы снижается относительно быстро, после чего выходит на плато и затем принимает обычный вид (Шафиркин А.В., 2008). Таким образом, в этом диапазоне доз практически все типы клеток становятся радиочувствительными. Кроме того, быстроделящиеся клетки, быстрее восстанавливают поврежденный пул, уменьшая радиационное поражение ткани (Аклеев А.В., 2009). В тканях с низким пролиферативным потенциалом возможность компенсаторной пролиферации снижена. Однако реакции тканей на облучение определяются не только мощностью и дозой облучения, т.к. на их действие могут влиять различные биологические факторы – модификаторы, например, антиоксиданты, простагландины, белки теплового шока и др. (Аклеев А.В., 2009) .

Среди радиомодификаторов значительный интерес представляют ММСК. В эксперименте на животных показано, что трансплантация человеческих ММСК уменьшала радиационное поражение пула прогениторных клеток кожи, костного мозга, кишечника. При этом уменьшался срок их репарации (Smont A., Franois S. et al., 2006; Chapel A., Bertho J.M., et al., 2003). Эндостальные компоненты костномозговой ниши формируют микроокружение, которое в 2 – 3 раза снижают радиочувствительность ГСК (Richardson R.B., 2011). Важная роль в регуляции активности полипотентных кроветворных клеток принадлежит клеткам костномозговой ниши. Они поддерживают постоянство числа ГСК в физиологических условиях и обеспечивают его восстановление при повреждении. При облучении паренхима костного мозга может постепенно замещаться фиброзной тканью, приводя в итоге к клеточному дефициту как гемопоэтического, так и стромального компонентов костного мозга .

Исследования влияния радиации на костный мозг выявили относительную радиорезистентность ММСК. Это может объясняться более выраженной устойчивостью к оксидативному стрессу по сравнению с другими клеточными типами (Chen M.F., Lin C.T. et al., 2006). Было показано, что ММСК из большеберцовой и бедренной кости мышей наиболее чувствительны к действию ионизирующего облучения в дозах 3 – 5 Гр. При облучении в этом диапазоне снижается пролиферативная активность, остеодифференцировка (ослабление окраски по Ван Косса) и адиподифференцировка, выражающаяся в снижении экспрессии PPAR-2 и выраженностью окраски Изменяется функционирование Oil Red .

апоптоз/антиапоптозной систем. Имело место дозозависимое увеличение количества РНК антиапоптозного белка Mcl-1. При этом усиливалась экспрессия компонентов каспазного и митохондриального путей апоптоза (FasL, Bax, NOXA, PUMA, Csp-3). TUNEL-проба показала увеличение апоптозной ДНК в клетках. При дозах около 12 Гр наблюдалось преобладание двухнитевых разрывов ДНК (Mussano F., Lee K.J. et al., 2010). В других исследованиях во время 10-дневного облучения -излучения, в суммарной дозе 1,5 – 2 Гр и 10-дневного облучения нейтронами (суммарная доза – 0,82*10-3 сГр, плотность потока 1,3*105/см2) было показано увеличение числа КОЕ-ф, образованных in vitro (Domaratskaya E.I., Tsetlin V.V. et al., 2005) .

Хотя адиподифференцировка ММСК костного мозга in vitro снижалась, после облучения число адипоцитов увеличивалась (Green D.E., Adler B.J. et al., 2013) .

Снижение костной массы (остеопороз), в особенности уменьшение числа костных балок (место локализации ГСК), в результате повышения активности остеокластов при облучении (Kondo H., Searby N.D. et al., 2009), приводит к заметному уменьшению числа ГСК, в особенности, ранних предшественников Lin-Sca1+C-kit+; SPLSK (Green D.E., Rubin C.T., 2014) .

Репарация разных ростков кроветворения при повреждении их ионизирующим излучением в дозе до 2 Гр, обусловлена тем, что тотальное облучение не вызывает критических изменений в функциональной активности гемоиндуцирующего микроокружения (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 2006). В этот период усиливается взаимосвязь между стромальными клетками костного мозга, в том числе, и ММСК, с гемопоэтическими предшественниками, происходит количественное накопление покоящихся предшественников. Повышение пролиферативной активности ГСК наблюдается после усиления секреции гемопоэтических ростовых факторов Т-клетками в результате увеличения их числа в гемпродуцирующей нише и взаимодействия с ММСК (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 2006). Интересно отметить, что данный механизм начинает работать и при воздействии других неблагоприятных факторах, например цитостатиков (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 2006). Введение продигиозана облученным мышам, приводило к активации и увеличению числа стромальных клеток костного мозга, сопровождающееся увеличением секреции GM-SGF, IL-1, TNF-, TGFЭто приводило к усилению радиорезистентности кроветворного ростка костного мозга, выражающающееся в большем числе КОЕ-ГМ, образованных in vitro, и более быстром восстановлении показателей кроветворения (Лебедев В.Г., Мороз Б.Б. и др., 2004) .

При длительном облучении происходит перестройка системы гемопоэза .

Восстановление клеточного состава костного мозга происходит на фоне сокращения клеточного цикла, времени созревания и усилении репарации сублетальных повреждений гемопоэтических предшественников (Аклеев А.В., 2009). Критичным для восстановления гемопоэза является число и качество оставшихся ГСК. Спонтанное восстановление гемопоэза возможно при 5% сохранившихся стволовых клетках (Fliedner T.M., Graessle D. et al., 2002) .

Основным фактором, стимулирующим пролиферацию покоящихся ГСК является уменьшение числа пролиферирующих предшественников. Несмотря на то, что гемопоэз хорошо адаптируется к действию ионизирующего излучения, в том числе при хроническом облучении, восстановление клеточного состава крови происходит в течение нескольких десятков лет (Пестерникова В. С., Окладникова Н.Д., 2003) .

Усиление пролиферативной активности кроветворных стволовых клеток наблюдается при облучении в дозах 0,2 – 0,3 Гр (Аклеев А.В., 2009). Было показано, что мощность дозы, определяющая величину повреждения стволового пула, значительно влияет на скорость и полноту его восстановления. Регенерация происходила быстрее при облучении в больших мощностях, по сравнению с менее интенсивным воздействием, при сопоставимых уровнях суммарной дозы. Возможно, этот эффект связан с высвобождением большего количества биологически активных веществ, стимулирующих гемопоэз (эритропоэтина, лейкопоэтина, тромбопоэтина) при большем числе погибших клеток (Аклеев А.В., 2009). Другой компенсаторный механизм восстановления гемопоэза при хроническом обучении – усиление экстрамедуллярного кроветворения, которое связано с миграцией ГСК из костного мозга в периферические органы кроветворения (селезенка, печень, лимфоузлы) (Fliedner T.M., Graessle D. et al., 2002). Внутреннее облучение костного мозга Sr показало относительную радиорезистентность эритроидного ростка по сравнению с другими гемопоэтическими предшественниками (Аклеев А.В., 2009). Облучение в низких дозах порядка 2 сГр активирует иммунитет (Pandey R., Shanсar B.S. et al., 2005) .

При более интенсивном воздействии происходит его угнетение (Кириллова Е.Н., Муксинова К.Н., Скуковская Т.Л., 1988). Но при длительном облучении даже в малых дозах происходит изменение субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток и их функциональной активности (Fliedner T.M., Graessle D. et al., 2002). В-лимфоциты, более радиочувствительны по сравнению с Т-лимфоцитами при облучении в дозах до 1 Гр. Снижение активности В-клеток у мышей С57Bl/6 при длительном -облучении в дозе 10 сГр/год проявлялось в снижении уровня сывороточных IgG1, IgG2a и IgG2b. Непрерывное продолжительное облучение в дозе около 10 сГр/сут вызывает выраженное снижение числа и угнетение активности В-клеток у крыс Wistar и мышей линии СВА (Аклеев В.А., 2009) .

Наиболее радиорезистентными лимфоцитами являются естественные киллеры (NK-клетки), снижение цитотоксической активности NK-клеток происходит при облучении в дозе 14 Гр (Кириллова Е.Н., Ревина В.С., Соколова С.Н., 1991) .

Эксперименты на мышах C57Bl/6 показали отсутствие негативного влияния на Тклеточный иммунитет при хроническом -облучении в дозе 10 с Гр/год (Courtade M., Caratero A., et al., 2001); при облучении мощностью 0,31сГр/мин в течение 5 суток в популяции CD8лимфоцитов происходило усиление экспрессии сопровождающееся усилением CD69, пролиферации при их стимуляции конкавалином А (Fliedner T.M., Graessle D. et al., 2002). При исследовании эффектов длительного действия радиации (дозы 0,024 и 0,168 Гр) в зоне ЧАЭС на мышей выявило зависимое от дозы усиление пролиферации Т-клеток (Малыжев В.А., Пелевина И.И. и др., 1993). Исследования на крысах Wistar при длительном облучении показали, что в диапазоне доз 1 – 10 Гр отмечается угнетение активности Т-лимфоцитов, причем это происходило волнообразно, что связано с цикличностью восстановления пула Т-клеток (Новоселова Е. Г., Сафонова М. В. и др., 2002) .

Ионизирующее излучение оказывает негативное влияние на гемопоэз, причем максимальное повреждение ГСК происходит в двух интервалах: 3 – 5 Гр и выше 12 Гр. При действии малых доз активируется апоптозная система, при более высоких дозах клеточная гибель происходит в основном за счет некроза. При этом развивается каскад клеточных реакций (усиление взаимодействия ГСК и ММСК, увеличение числа Т-клеток и макрофагов, усиление секреции гемпродуцирующих цитокинов Т-клетками), позволяющий сохранять морфофункциональную активность гемопоэтического пула на достаточно длительный срок .

Данный механизм, возможно, является универсальным, т.к. схожие процессы наблюдаются при различных негативных воздействиях. Более выраженная устойчивость стромального компонента по сравнению с гемопоэтическими клетками костного мозга обеспечивает функционирование и восстановление кроветворной ткани в экстремальных условиях .

Костный мозг, будучи центральным органом кроветворения, иммунной системы и источником ММСК, участвующих в процессах обновления, самоподдержания и репарации тканей мезенхимного происхождения, обеспечивает благополучие организма в целом и его адаптацию при изменении условий окружающей среды. Условия космического полета для организмов, филогенетическое развитие которых проходило в условиях земной гравитации, вследствие чего сила тяжести - это неотъемлемый фактор для нормальной физиологической активности всех систем, являются «чуждыми». Это приводит к изменению всех систем, в том числе и костного мозга. Также необходимо учитывать негативное действие ионизирующего излучения на организм. Поэтому, изучение морфофункционального состояния клеточных компартментов костного мозга при действии экстремальных факторов, в том числе космического полета, особенно в преддверии длительных межпланетных экспедиций, позволяет разрабатывать комплекс профилактических мероприятий и контрмер. К сожалению, работ по исследованию морфофункционального состояния костного мозга в условиях космического полета и моделирования его эффектов немного. Очень важно оценивать реакцию не «чистых» линий клеток, а анатомофизиологически связанные клеток, так называемые ниши .

Необходимо также отметить, что при воздействии нескольких факторов наблюдается интерферирующий эффект, т.е. действие одного фактора изменяет чувствительность клеток к другому. Поэтому наиболее точную оценку реакции костного мозга в условиях космического полета может дать комплексный анализ действия факторов микрогравитации и ионизирующего излечения на нишу костного мозга .

–  –  –

При выполнении работы использовались следующие химические реагенты: глютамин (ПанЭко, Россия); 0,25% раствор Трипсин/ЭДТА (Gibco, Великобритания); лиофизированная смесь антибиотиков пенициллин (10 000 ед/мл)/стрептомицин (10 000мкг/мл) (ПанЭко, Россия);

диметилсульфоксид (ДМСО) (INC,США); бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США); фосфатно-солевой буфер (ФБ) (Sigma, США); среда для культивирования клеток МЕМ (Gibco, Великобритания); полужидкая среда Mouse MethoCult Medium GF M3434 (STEMCELL Technologies, Канада); полужидкая среда Rat MethoCult Medium GF R3774 (STEMCELL Technologies, Канада); эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (HyClone, США);

метанол (Merck, Германия); параформальдегид (Merck, Германия); гидроксид натрия (Sigma, США); глицерин (Реахим, Россия); среда для заключения препаратов Poly-Mount (Polyscience Inc., США); Краситель Гимзе (AppliChem, Германия); индометацин в концентрации 200 М (Sigma, США); 0,5 мМ изобутилметилксантин (IBMX) (Sigma, США); 10-8 М дексаметазон (Sigma, США); раствор инсулина (NovoNordick, Дания); 10мМ глицерол-2-фосфат (Sigma, США); 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновая кислота (Fluca, Германия); Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США); краситель Oil Red О (Sigma, США); трипановый синий (Sigma, США);

этанол; моноклональные антитела (anti-mouse), конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) против CD34, CD45.1, CD90.2 антигенов (Biolegend, США); изотипический контроль (antimouse) (IgG2A), конъюгированный с РЕ (Biolegend, США); моноклональные антитела (anti-rat), конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) против CD73 (Chemicon, США), CD90 антигенов (BD Biosciences, США); моноклональные антитела (anti-rat), конъюгированные с FITC CD45 (BD Biosciences, США), CD11b (Chemicon, США); изотипические контроли (anti-rat) (IgG2A), конъюгированные с РЕ и FITC (Biolegend, США); изопропанол (Millipore, США); среда для заключения препаратов Fluoroshield (Sigma, США); глицерин (Sigma, США); желатин (Sigma, США); азид натрия (Sigma, США); пируват натрия (Gibco, США); кристаллвиолет (Sigma, США); OptiLyse C (BD, США) .

Для выделения, культивирования, пассирования, криоконсервации клеток, смены среды, при гистохимической идентификации продуктов дифференцировки использовались чашки Петри диаметром 35мм, 60 мм, 100мм (Corning, США); серологические пипетки объемом 2 мл, 5 мл, 10 мл (Corning,США); центрифужные пробирки объемом 15 и 50 мл (Corning, США);

наконечники к автоматическим пипеткам переменного объема (Eppendorf, Германия); шприцы для инъекций объемом 2 мл, 5 мл (Б.Браун Медикал, Германия); иглы для шприцов 23G и 19G (Б.Браун Медикал, Германия); пенициллиновые пузырьки (Россия); криопробирки (Corning, США); пинцет с прямыми концами; пинцет с изогнутыми концами; ножницы прямые; ножницы изогнутые; скальпель .

При проведении цитофлуориметрического анализа использовались пробирки, рекомендуемые производителем прибора (Beckman Coulter, США) .

Для морфологических исследований использовались покровные и предметные стекла MEZEL-GLSER (Gerhard Menzel GmbH, Германия) .

2.1.2. Оборудование

Работа проводилась с использованием следующего оборудования: ламинарный шкаф ВЛ22, (Сампо, Россия); СО2-инкубатор (Sanyo, Япония); световой фазово-контрастный микроскоп Leica DM IL (Leica, Германия); флуоресцентный фазово-контрастный микроскоп Nicon Eclipse TiU (Nicon, Япония), оснащенный системой анализа изображения NIS-elements (Nikon, Япония); конфокальный микроскоп LSM 780 (Carl Zeiss, Германия), оснащенный системой анализа изображения Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss, Германия), вортекс (Elmi, Латвия); центрифуга Eppendorf 5204 R (Eppendorf, Германия); водяная баня (BioSan, Латвия);

проточный цитофлюориметр Coulter Epics XL (Becman Coulter, США) с системой для создания и анализа гистограмм Sistem II (Becman Coulter, США); автоматические пипетки переменного объема (0,5 – 10 л, 50 – 200 л, 100 – 1000 л) (Eppendorf, Германия); дозатор пипеточный электронный (BioHit, Финляндия), дозатор пипеточный электронный (Drummond Scientific, США); камера Небауэра (Marienfeld, Германия); сосуды Дьюара для жидкого азота (НПО ГелийМаш, Россия); холодильник (Indesit, Россия); низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония); программа для анализа изображений Sigma Skan Pro 5 (Systat Software Inc., США) .

–  –  –

Исследования проводились на самцах мышей линии C57Bl/6N, 19 – 20-недельного возраста, массой 25 – 30 г, из программы научного космического эксперимента «Бион-М1» .

Животные были получены из филиала Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова – питомника лабораторных животных «Пущино». Все животные были СПФ-статуса. При работе с животными соблюдались меры, предотвращающие их контаминацию (Сычев В.Н. Ильин Е.А. и др., 2014). В рамках программы животные были разделены на несколько групп. Полетный эксперимент на борту биоспутника «Бион-М1»

(разработчик и изготовитель ГНПРКЦ «ЦСКБ-Прогресс») был проведен в период с 19 апреля по 19 мая 2013 года (30 суток) .

Строение, технические характеристики, логистика описаны в статье Сычева В.Н., Ильина Е.А. и др. (Сычев В.Н. Ильин Е.А. и др., 2014). На борту спутника животные содержались в блоках «БИОС-МЛЖ» (рисунок 10). Состав газо-воздушной смеси, влажностнотемпературный режим, режим освещённости, радиационная обстановка, состав корма и другие параметры жизнеобеспечения блока описаны в статьях Сычева В.Н., Ильина Е.А. и др. и Иноземцева К.О., Кушина В.В.и др. (Сычев В.Н. Ильин Е.А. и др., 2014; Иноземцев К.О., Кушин В.В. и др., 2015) .

Рисунок 10. Блоки "БИОС-МЛЖ". Фото Сергеева С. (НОВОСТИ КОСМОНАВТИКИ. 2013. Том23. №06 (365))

Животные, находившиеся в условиях космического полета, были выделены в группу (П) (n=5). Отставленный наземный контрольный (синхронный) эксперимент, в котором были воспроизведены условия содержания и среды обитания на биоспутнике, проходил в период с 26 июля по 26 августа 2013. В отставленном наземном контрольном эксперименте животные содержались в блоках «БИОС-МЛЖ», использовавшиеся на биоспутнике. Блоки с животными были установлены в климатической камере, в которой воспроизводились температура, влажность и газовый состав атмосферы полетного эксперимента. Животные этого эксперимента выделялись в группу (С) (n=7). Животные после 7-суточного периода реадаптации после космического полета и окончания контрольного наземного эксперимента выделялись в группу (П-в) (n=5) и (С-в) (n=8), соответственно. Кроме этого, были использованы группы животных виварного контроля, которые содержались в стандартных условиях вивария одновременно с полетным и наземным контрольным экспериментом и животными 7-суточной реадаптации для учета различий нормальных физиологических показателей (ВК) (n=8), (СВК) (n=9),(ВК-в) (n=6) и (СВК-в) (n=4). Животные из групп виварного контроля к полетному и наземному контрольному экспериментам были объединены с животными, контрольных групп 7-суточной реадаптации после полетного и наземного контрольного экспериментов соответственно .

Биоэтическая экспертиза протокола исследований проводилась Комиссией по биоэтике НИИ митоинженерии МГУ (протокол № 35 от 1 ноября 2012г.) и Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ – РФ ИМБП РАН (протокол № 319 от 4 апреля 2013 г.) (Иноземцев К.О., Кушин В.В. и др., 2015) .

Комбинированное действие длительного фракционированного -облучения и 2.1.3.2 .

антиортостатического вывешивания Эксперименты проведены на базе ГНЦ РФ – ИМБП РАН в лаборатории «Радиационной и экстремальной нейрофизиологии» под руководством д.б.н. проф. А.С. Штемберга .

Для исследования были взяты 26 самцов крыс линии Wistar 10 – 12-месячного возраста, массой 250 – 300 г, которых содержали на стандартном пищевом рационе с двух недельным карантином в условиях вивария. Животные были получены из вивария Института медикобиологических проблем РАН – филиал «Планерная». Подопытные животные были случайным образом разделены на 4 экспериментальные группы: 1. Виварный контроль - «К» (n=4), 2 .

Вывешивание – «В» (n=4), 3. Группа облучения, животные, которые были подвержены воздействию ионизирующего излучения в суммарной дозе 3 Гр – «О» (n=4), 4. Животные, подвергшиеся синхронному комбинированному воздействию длительного фракционированного

-облучения и вывешивания – «ОВ» (n=4). Программа эксперимента и все процедуры с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ — Института медико-биологических проблем РАН. После периода 2-недельной реадаптации исследования проводились в следующих группах: виварный контроль после восстановления – «ВК» (n=3), восстановление после воздействия вывешивания – «ВВ» (n=3), восстановление после облучения

– «ВО» восстановление после комбинированного действия вывешивания и (n=3), ионизирующего облучения – «ВОВ» (n=3) (Штемберг А.С., Лебедева-Георгиевская К.Б. и др., 2014). Выделение костного мозга проводили из двух бедренных костей каждого животного .

Экспериментальные животные были подвергнуты воздействию 30-суточного антиортостатическому вывешиванию (Штемберг А.С., 1992; 1997; Morey-Holton E.R., Globus R.K., 2002; Morey-Holton E.R., Globus R.K., et al., 2005). Для опорной разгрузки животных вывешивали за основание хвоста под углом 30 – 40о. При этом крыс крепили с помощью специальных карабинов, надевающихся на металлический стержень, что позволяло животным свободно передвигаться по клетке. Таким путем создавался антиортостаз, при котором происходит перераспределение жидкостей в организме и снятие опорной нагрузки с задних конечностей. Моделирование проводили в индивидуальных секциях из оргстекла размером 42*42*40 см, соединенные в 2 стеллажа по 15 секций каждый (Штемберг А.С., ЛебедеваГеоргиевская К.Б. и др., 2014) .

Для облучения животных использовали установку ГОБО-60 с источником Cs (172 гэкв. Ra). Мощность дозы составила 2,34 сГр/ч. В течение 30 суток было проведено 6 суточных сеансов облучения с интервалами от 3 до 5 суток .

Стеллажи с вывешенными животными размещались в помещении для облучения:

стеллаж с крысами, подвергшихся комбинированному воздействию располагался в зоне облучения на расстоянии 3,3 м от источника излучения так, чтобы облучение всех животных этой группы было равномерным. Стеллаж с вывешенными животными был в том же помещении, но вне зоны облучения. Крысы, которые подвергались воздействию только ионизирующего излучения, находились в домашних клетках на стеллаже в зоне облучения .

Животные виварного контроля помещались в обычные домашние клетки (Штемберг А.С., Лебедева-Георгиевская К.Б. и др., 2014) .

–  –  –

В состав полной среды входили: культуральная среда -МЕМ, ЭТС, доля которой составляла 20%, антибиотики пенициллин/стрептомицин, конечная концентрация которых составила 100 ед/мл и 100 мг/мл, соответственно, 2мМ L-глютамин .

–  –  –

В состав полной среды входили: культуральная среда -МЕМ, ЭТС, доля которой составляла 10%, антибиотики пенициллин/стрептомицин, конечная концентрация которых составила 100 ед/мл и 100 мг/мл, соответственно, 2мМ L-глютамин, 1мМ пируват натрия .

–  –  –

2.3.1. Выделение клеток костного мозга большеберцовой кости мышей линии C57Bl/6N Выделение культуры клеток костного мозга проводилось по общепринятой методике (Meirelles, Lda.S., Nardi, N.B., 2003; Procop D.J., Phinney D.G., Bunnell B.A., 2008) в нашей модификации. Эвтаназию животных проводили путем цервикальной дислокации. После этого помещали тушку животного в емкость с 70% раствором этилового спирта на несколько секунд для обеззараживания кожи и меха (вышеуказанные манипуляции можно проводить в нестерильных условиях). Далее делали разрез на коже в нижней трети живота по средней линии, аккуратно, чтобы не повредить брюшину, продолжая разрез по средней линии бедра вниз до стопы. Для аккуратного отделения кожи от нижележащих тканей, делался круговой надрез в области таза, после чего отделяли кожу, оттянув ее в направлении таз-стопа, наподобие чулка. Для выделения комплекса задних конечностей в области вертлужной впадины делался надрез, таким образом, чтобы тазобедренный сустав оставался интактным. В середине стопы делался круговой надрез, что позволяло отделить кожный лоскут. При этом голеностопный сустав оставался целый. После выделения комплекс костей нижних конечностей переносили в чашку Петри диаметром 60 мм. Аккуратно, используя ножницы и пинцет, отделяли мышцы от костей. После этого скелет лапы промывали несколько раз в стерильном растворе ФБ, содержащего антибиотики пенициллин/стрептомицин, конечная концентрация которых составила 100 ед/мл и 100 мг/мл, соответственно (далее по тексту ФБ с антибиотиками). Бедренную и большеберцовую кость разделяли, делая разрез по коленному суставу, не повредив эпифизы костей. Промывали кость в стерильном растворе ФБ с антибиотиками .

Для получения суспензии мононуклеаров костного мозга в пенициллиновый пузырек добавляли 10 мл культуральной среды -МЕМ (4 -10оС). После чего из него отбирали шприцом, объемом 5 мл, 2 – 5 мл среды. Аккуратно срезали эпифизы с костей, по возможности минимально, т.к. в них находиться наибольшее количество клеток. Вставляли иглу, диаметром 23G, в костномозговой канал, но не глубоко и очень осторожно, чтобы не сломать кость. Слегка подтягивали поршень шприца немного вверх, чтобы создать вакуум внутри канала для более легкого выделение клеток. После этого над пенициллиновым пузырьком начинали медленно промывать костномозговой канал с двух сторон до полного удаления клеток из канала (при этом кость становилась белой и слегка прозрачной). Гомогенизировали суспензию клеток пипетированием механической пипеткой объемом 1 мл. После гомогенизации клеточную суспензию переносили в 50 мл центрифужные пробирки. Центрифугировали при скорости 500 G в течение 5 минут. После центрифугирования удаляли супернатант и добавляли 20 мл МЕМ. Число жизнеспособных клеток определяли путем окрашивания трипановым синим, для этого 45 л клеточной суспензии смешивали с 5 л трипанового синего. Для лизиса эритроцитов к клеточной суспензии добавляли лизирующий буфер OptiLyse C в соотношении 1:10, инкубировали 15 минут. Подсчет проводили в камере Небауэра .

2.3.2. Выделение клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar Эвтаназию животных проводили путем декапитации на гильотине. Выделение бедренной кости и культуры клеток костного мозга проводили по методике, описанной в предыдущем пункте, за исключением того, что в работе использовали шприц объемом 10 мл и иглу 18G .

–  –  –

После выделения клетки переносились в чашки Петри диаметром 35 мм .

Культивирование клеток проводили в полной культуральной среде при 370С в атмосфере 5% СО2, в условиях 100% влажности в СО2-инкубаторе. Объем среды, вносимый в чашку Петри, составлял 2 мл. Каждые 3 дня проводили смену среды путем отбора половины объема старой среды и внесением эквивалентного количества новой .

Для определения числа колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-ф) клетки в 3 плотностях: 4*104 кл/см2, 12*104 кл/см2, 36*104 кл/см2 .

костного мозга высаживали Рекомендуемая плотность посадки клеток костного мозга мышей для определения числа КОЕф, составляет 3 – 5*104 кл/см2 (Meirelles, Lda.S., Nardi, N.B., 2003). Посадка клеток с 3- и 9кратным увеличением плотности была сделана из-за риска значительного уменьшения числа стромальных предшественников во время космического полета и во избежание потери возможности анализа данного важного параметра функционального состояния этих клеток .

Для определения спонтанных остео- и адипопотенциала стромальных предшественников клетки костного мозга мышей были высеяны в плотности 22*105/см2 .

2.3.4. Культивирование клеток костного мозга большеберцовой кости крыс линии Wistar

Полученную после выделения, суспензию клеток костного мозга помещали в чашки Петри диаметром 35 мм. Культивирование клеток проводили в полной культуральной среде при 370С в атмосфере 5% СО2, в условиях 100% влажности в СО2-инкубаторе. Объем среды вносимый в чашку Петри составлял 2 мл. Каждые 3 дня проводили смену среды путем отборы половины объема старой среды и внесением эквивалентного количества новой .

Пассирование клеток проводили при достижении 80 – 90% монослоя в областях высокой плотности клеток первичной культуры. Для этого удаляли среду и 2 – 3 раза промывали раствором ФБ. Затем к клеткам добавляли 0,25% раствор трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 1-3 минуты при температуре 37°С в инкубаторе (до отделения клеток от подложки) .

Контроль над откреплением клеток проводили с помощью фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL. После отделения клеток добавляли 1 мл полной среды, тщательно промывали поверхность чашки 3 – 4 раза, собирая суспензию в 15 мл пробирку для центрифугирования .

Центрифугировали при скорости 500 G в течение 5 минут. Супернатант удаляли. К клеточному осадку добавляли 10 мл полной среды, ресуспендировали. Затем проводили подсчет клеток в камере Небауэра с трипановым синим (45 л клеточной суспензии + 5 л трипанового синего) .

Плотность посадки клеток при субкультивировании составляла около 2*103 кл/см2 в расчете на жизнеспособные клетки. Смену среды проводили каждые 3 дня .

2.3.5. Криоконсервация клеток костного мозга грызунов

Для отсроченного анализа гемопоэтического дифферона костного мозга грызунов клетки были подвергнуты криоконсервации, для этого суспензию, содержащую 2 млн. клеток переносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугировали в течение 5 минут при 600 g. После чего супернатант удаляли, а к клеточному осадку добавляли 1 мл среды для криоконсервации. Осторожно ресуспендировали и переносили в пробирки для криоконсервации. Далее постепенно снижали температуру, выдерживая пробирки в течение 1 ч при -24оС, затем в течение 24 ч при -80оС. Длительное хранение осуществлялось в сосудах Дьюара с жидким азотом. Для последующей работы размораживание клеток проходило на водяной бане при температуре 37оС. Далее клетки отмывали от криопротектора, помещая суспензию клеток в большой объем культуральной среды, центрифугировали в течение 5 минут при 600 g. Супернатант удаляли. К осадку добавляли 0,5 мл среды -МЕМ, содержащей 2% ЭТС осторожно суспендировали и проводили подсчет в камере Небауэра с трипановым синим (45 л клеточной суспензии + 5 л трипанового синего). Из расчёта на живые клетки разводили суспензию таким образом, что в 300 л суспензии содержалось100 тыс. клеток. После чего клетки вносили в полужидкую среду MethoCult .

2.3.6. Культивирование гемопоэтических клеток костного мозга грызунов в полужидкой среде MethoCult GF M3434/GF R 3774 300 л суспензии, содержащей 100 тыс. клеток вносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащей 3 мл полужидкой среды MethoCult GF M3434/GF R 3774. Далее пробирку интенсивно встряхивали на вортексе. Пробирку с хорошо перемешанной суспензией клеток с приоткрытой крышкой оставляли в ламинарном шкафу на 20 минут до исчезновения крупных пузырьков воздуха. Содержимое пробирки распределяли между двумя чашками Петри диаметром 35 мм поровну. Чашки с клетками ставили в чашку Петри диаметром 100мм, куда помещали чашку Петри без крышки, наполненную дистиллированной водой. Культивирование проводили при 37оС в атмосфере 5% СО2, в условиях 100% влажности в СО2-инкубаторе. Число и состав колоний оценивали на 14 сутки .

–  –  –

Клетки анализировали при помощи микроскопа Nikon Eclipse TiU, оснащенного оборудованием для фазово-контрастной микроскопии и цифровой фото/видео камерой для захвата и оцифровки изображения. Для гистологических исследований, оценки морфологии и количественной оценки первичной культуры клеток костного мозга грызунов, выраженность дифференцировки стромальных предшественников и гемопоэтических колоний использовали проходящий свет и фазово-контрастную микроскопию. Для морфологического анализа гемопоэтических колоний в полужидкой среде использовали метод микроскопии в темное поле .

Выявление клеточных антигенов при иммуноцитохимическом окрашивании с использованием моноклональных антител проводилось на конфокальном микроскопе LSM 780 Carl Zeiss совместно с д.м.н. С.В. Буравковым (ФФМ МГУ) .

Подсчет клеток в камере Небауэра проводился на микроскопе Leica DM IL .

2.4.2. Проточная цитофлюориметрия и цитофлюометрический анализ клеток костного мозга грызунов (мышей линии C57Bl/6N и крыс линии Wistar) В основе метода лежит однопоточное прохождение клеток через луч лазера .

Светорассеяние на поверхности клеток улавливается одним или несколькими фотоумножителями после чего регистрируется. При обработке флюоресцентным красителем или антителами, меченными флуорохромами флюоресценция, регистрируемая фотоуможителем, возбуждается лазером. Информация обрабатывается и выводится на монитор в виде двухмерного или трехмерного графика. В работе при иммунофенотипировании клеток использовали проточный цитофлюориметр Coulter Epics XL .

Иммунофенотипирование клеток костного мозга мышей проводили непосредственно после выделения. В работе использовали антитела к следующим антигенам: CD90.2 (Thy-1);

CD34; CD45 .

Культуру клеток костного мозга крыс анализировали после первого пассажа. В работе использовали антитела к следующим антигенам: CD90 (Thy-1); CD11b; CD73; CD45. Для анализа клетки снимали с культурального пластика раствором трипсин-ЭДТА, после чего фермент ингибировали культуральной средой, содержащей 10% сыворотки .

Подсчёт клеток проводили в камере Небауэра. Далее суспензию клеток центрифугировали при 600 g в течение 5 минут. Затем супернатант удаляли. К осадку добавляли ФБ в таком количестве, чтобы в 100 л суспензии содержалось 105 клеток, в расчете на одну пробу. В полученные пробы добавляли по 1 л раствора антиген-специфичных моноклональных антител, конъюгированных с FITC или PE, встряхивали на вортексе и инкубировали при +4С в течение 20 минут. После чего в пробу добавляли 400 л ФБ и анализировали на проточном цитофлюориметре. В качестве изотипического контроля использовали IgG, конъюгированные с FITC или PE, того же подкласса, что и антиген-специфические антитела .

2.4.3. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

Для иммуноцитохимического выявления маркеров (CD90.2 (Thy-1); CD34; CD45) клетки первичной культуры костного мозга мышей рассаживали на покровные стекла, помещенные в чашки Петри диаметром 35 мм. Клетки дважды промывали средой -МЕМ без ЭТС, после чего клетки промывали ФБ, содержащим 1% БСА, далее наносили антиген-специфические антитела, конъюгированные с РЕ, и инкубировали в термостате при 37 оС в течение 40 минут. После чего клетки дважды отмывали ФБ и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут .

Далее клетки отмывали ФБ дважды. Для заключения препаратов использовали специальную среду Fluoroshield, содержащую флуоресцентный краситель ядерной ДНК, DAPI. В качестве негативного контроля использовали IgG, конъюгированные с PE, того же подкласса, что и антиген-специфические антитела. Препараты изучали на конфокальном микроскопе LSM 780 Carl Zeiss, оснащенного программой анализа изображений .

–  –  –

Стекла с клетками фиксировали ледяным метанолом в течение 5 минут и окрашивали по Гимзе согласно инструкции производителя. После окрашивания и высыхания стекла заключали в среду Poly-Mount. Препараты изучали с помощью микроскопа Nikon Eclipse TiU .

2.4.5. Выявление гемопоэтических колониеобразующих единиц Наличие гемопоэтических колониеобразующих единиц (КОЕ) в костном мозге грызунов определяли по способности образовывать колонии в полужидкой среде MethoCult GF M3434 (при анализе клеток костного мозга мышей) и MethoCult GF R 3774 (при анализе клеток костного мозга крыс) в соответствии с инструкцией производителя. Колонии определяли на 14 день культивирования. Анализируемую чашку Петри для более точного подсчета помещали в чашку Петри диаметром 60 мм с нанесенной сеткой, площадь квадрата которой составлял 0,014 мм2. Количество гемопоэтических КОЕ считали, отступая на 1 – 2 квадрата от края, в каждом квадрате по периметру чашки, кроме этого, подсчет проводился по двум перпендикулярным диаметрам. Полученное число колоний пересчитывалось на площадь чашки диаметром 35 мм .

Определение типов колоний проводилось в проходящем свете при суженой диафрагме при увеличении микроскопа 40X с использованием атласа гемопоэтических колоний (STEMCELL Technologies, Канада) .

Колонии бурстообразующих единиц эритроцитов (БОЕ-Э) представляли собой многочисленные кластеры, состоящих из 30 или более клеток-предшественников (рисунок 11А). Цвет колоний мог меняться от бурого до красного .

Колонии колониеобразующих единиц гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ) состояли из более чем 30 клеток (рисунок 11Г; рисунок 12В). Колонии чаще всего были округлой формы .

В основном, клетки в колониях располагались по градиенту плотности, уменьшающимся к периферии колонии. Также встречались колонии с равномерным распределением клеток. При наблюдении за колонией можно было различить отдельно расположенные как небольшие округлые клетки, так и более крупные клетки округлой и неправильной формы .

Колонии колониеобразующих единиц гранулоцитов (КОЕ-Г) состояли минимум из 30 предшественников гранулоцитов, расположенных неравномерно в пределах колонии. В центре они образовывали плотное ядро, вокруг которого распределялись остальные клетки (рисунок 11Б; рисунок 12А) .

Рисунок 11. Гемопоэтические колонии, образованные клетками костного мозга мышей .

Микроскопия в темном поле. Увеличение 40Х А – бурстообразующая единица эритроцитов (БОЕ-Э), Б – колониеобразующая единица гранулоцитов (КОЕ-Г), В – колониеобразующая единица макрофагов (КОЕ-М), Г – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ), Д – колониеобразующая единица гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов (КОЕ-ГЭММ) .

Смешанные колонии, в состав которых входили предшественники гранулоцитов макрофагов/моноцитов и эритроцитов (КОЕ-ГЭММ) – самые крупные из всех исследованных в этой работе типов гемопоэтических колоний. Их определяли при наличии не менее 30 клеток разного размера и обязательном наличии эритроидного компонента (рисунок 11Д) .

Эритроидные предшественники в этих колониях обычно располагались ближе к центру колоний поверх остальных клеток .

Рисунок 12. Гемопоэтические колонии, образованные клетками костного мозга крыс .

Микроскопия в темном поле. Увеличение 40Х А – колониеобразующая единица гранулоцитов (КОЕ-Г), Б – колониеобразующая единица макрофагов (КОЕ-М), В – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ) .

Колонии моноцитарно-макрофагальных предшественников, состоящие из более, чем 30 крупных клеток, которые располагались рыхло, чаще имели неправильную форму. Кроме этого встречались округлые колонии с плотным центром и редким расположением клеток по краю (рисунок 11В, рисунок 12Б) .

2.4.6. Выявление колониеобразующих единиц фибробластов костного мозга грызунов .

Определение площади колоний Для определения числа колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-ф) суспензию мононуклеаров костного мозга мышей высевали в плотности 4*104 кл/см2, крыс 5*105 кл/см2 в чашки Петри диаметром 35 мм. Число колоний подсчитывали на 14 день культивирования после окраски 0,5% раствором кристалл виолета в метаноле в течение 5 минут (Friedenstein, A.J., Chailakhjan, R.K., Lalykina, K.S., 1970). После сушки препаратов делали подсчет колоний видимых глазом. Для определения площади колоний, проводилась фотосъемка всей культуральной поверхности чашки Петри, после чего изображение анализировалось при помощи программы Sigma Scan Pro 5 .

–  –  –

Пролиферативная активность клеток первичной культуры костного мозга характеризовалась числом удвоений популяций клеток (PD), рассчитываемым по формуле = log 2, где N и N – начальное и конечное количество клеток (Wolfrom C., Raynaud N., Maigne J., 1994) .

Для оценки пролиферативной активности мононуклеаров костного мозга мышей были высеяны с плотностью 12*104 кл/см2 в чашки Петри диаметром 35, плотность посадки костномозговых кариоцитов крыс составила 10*105 кл/см2 в чашки Петри диаметром 35 мм .

Подсчет количества клеток проводился в фиксированных полях зрения с использованием фазово-контрастного микроскопа Nikon Eclipse TiU. Проводили динамическое наблюдение за выбранными участками в течение девяти дней с фотофиксацией изображения .

Оценка прироста клеток костного мозга крыс проводилась на основе данных, полученных на 3 и 9 дни культивирования. При анализе пролиферативной активности клеток костного мозга мышей использовались данные 3 и 14 дней культивирования. При подсчете клеток была использована компьютерная программа Sigma Scan Pro 5 .

2.4.8. Оценка потенциала дифференцировки стромальных предшественников костного мозга грызунов Дифференцировочный потенциал стромальных предшественников костного мозга грызунов оценивали по их способности коммитироваться в остеогенном и адипогенном направлении в ответ на действия индукторов дифференцировки (индуцированная дифференцировка) или без них (спонтанная дифференцировка) .

2.4.8.1. Остеопотенциал стромальных предшественников костного мозга грызунов

Для оценки спонтанного остеопотенциала стромальных клеток-предшественников костного мозга мышей клетки высевали в плотности 22*105 кл/см2 в 35 мм чашку Петри .

Культивирование проводилось в полной среде для клеток костного мозга мышей .

Для оценки остеопотенциала (спонтанного и индуцированного) стромальных предшественников костного мозга крыс использовали клетки первичной культуры костного мозга. Клетки высевали в плотности 10*105 кл/см2 в 35 мм чашку Петри .

При достижении 30 – 40% монослоя индукцию дифференцировки осуществляли добавлением в среду культивирования остеогенных стимулов: 10 -8М дексаметазона, 10мМ глицерол-2-фосфата и 0,2мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты. В качестве контроля использовали клетки, высеянные в той же плотности, культивируемые в среде без добавления стимулов дифференцировки. В этих клетках оценивали уровень спонтанного остеопотенциала .

На 7 день культивирования клетки фиксировались 4% параформальдегидом и гистохимически выявляли активность щелочной фосфатазы – раннего маркера остеодифференцировки, используя набор Alkaline Phosphatase Kit согласно инструкции производителя. После высыхания окрашенные препараты заключали раствором глицеринжелатина (7 г желатина растворяли в 40 мл дистиллированной воды, добавляли к смеси 50 мл глицерина и 0,1 азида натрия) .

Наличие положительной окраски клеток определяли при помощи фазово-контрастного микроскопа Nikon Eclipse TiU в проходящем свете. Последующую обработку цифровых изображений проводили при помощи компьютерной программы Sigma Scan Pro 5. Щелочная фосфатаза окрашивалась в разные оттенки синего цвета и интенсивность окраски отражала активность фермента. Для количественной оценки интенсивности окраски, по сути активности фермента, при обработке изображений в программе Sigma Scan Pro 5, 32-битный формат цветной фотографии переводили в 8-ми битный и разделяли интенсивность синего цвета на 256 каналов серого цвета от черного – нет цвета до белого – максимальная интенсивность синего цвета (рисунок 13) .

Рисунок 13. Микрофотографии клеток костного мозга окрашенных на наличие щелочной фосфатазы, при помощи набора Alkaline Phosphatase Kit. Увеличение 40Х .

А – до обработки в программе Sigma Scan Pro 5 Б – после обработки в программе Sigma Scan Pro 5 (стрелками указаны окрашенные клетки) На основе этих данных программой строилась диаграмма распределения интенсивности окраски по площади (рисунок 14) .

Рисунок 14. Диаграмма распределения интенсивности окраски .

Таким образом, количественно оценивали эффективность остеодифференцировки стромальных предшественников костного мозга грызунов .

Адипопотенциал стромальных предшественников костного мозга грызунов 2.4.8.2 .

Для исследования спонтанных адипогенных потенций клетки костного мозга мышей высевали в плотности 22*105 кл/см2 в 35 мм чашку Петри. Культивирование проводили в полной среде для клеток костного мозга мышей. Адипогенный спонтанный потенциал оценивали на 7 день культивирования .

При изучении адипопотенциала стромальных предшественников костного мозга крыс, кариоциты были высеяны с плотностью 10*105 кл/см2 в 35 мм чашку Петри, для анализа как спонтанного, так и индуцированного адипогенеза. Для индукции адиподифференцировки при достижении 80 – 90% монослоя в среду культивирования добавляли адипогенные стимулы (0,5мМ изобутилметилксантина, 1М дексаметазона, 10г/мл инсулина). В качестве контроля (спонтанный адипопотенциал) использовали клетки, культивируемые в среде без индукторов адипогенеза. На 10 день культивирования гистохимически выявляли признаки адиподифференцировки стромальных клеток костного мозга .

Коммитирование клеток в адипонаправлении определяли, выявляя наличие липидных включений в цитоплазме, после окраски Oil Red О. Для этого удаляли среду и дважды промывали чашки ФБ. Далее фиксировали клетки 4% параформальдегидом в течение 15 минут .

После чего дважды промывали ФБ. Для лучшего окрашивания препаратов их промывали 1 раз 70% изопропанола и вносили краситель (концентрация Oil Red O – 0,3% в 70% изопропаноле) .

Инкубировали в течение 10 минут. Удаляли краситель и промывали чашки сначала 70% изопропанолом, а затем дистиллированной водой. После высыхания окрашенные препараты заключали раствором глицерин-желатина .

Наличие липидных капель в цитоплазме клеток определяли при помощи фазовоконтрастного микроскопа Nikon Eclipse TiU в проходящем свете .

2.4.9. Статистическая обработка результатов

В качестве характеристик полученных данных использовали среднее и стандартную ошибку среднего. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (для малых и средних выборок, n30), при выбранном уровне значимости p=0,05. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Statistica 7.0» для WinXP и пакета программ «Microsoft Excel 2010» .

Глава 3 . РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение свойств кариоцитов костного мозга большеберцовой кости мышей линии 3.1 .

C57Bl/6N после космического полета на биоспутнике «Бион-М1»

Исследования проводились на самцах мышей линии C57Bl/6N, из программы научного космического эксперимента «Бион-М1» (рисунок 15) .

Животные, находившиеся в условиях космического полета, были выделены в группу (П) Животные отставленного наземного контрольного эксперимента – в группу (С); животные после 7-суточного периода реадаптации после космического полета и окончания контрольного наземного эксперимента выделялись в группу (П-в) (n=5) и (С-в), соответственно; животные виварного контроля к полетному и наземному эксперименту – в группы (ВК) и (СВК) .

После выделения клеток костного мозга были определены клеточность и иммунофенотип. В последующем процессировании in vitro исследовались морфология и функциональная активность стромальных и гемопоэтических прогениторных клеток костного мозга (рисунок 15) .

Рисунок 15. Схема эксперимента по оценке морфофункционального состояния клеток костного мозга мышей линии C57Bl/6N в рамках научной программы биоспутника"Бион-М1" .

–  –  –

При определении числа мононуклеаров костного мозга в пределах каждой группы количество выделенных из одной кости клеток существенно варьировало (от 14 до 32 млн.) В полетном эксперименте не было выявлено достоверных отличий в количестве выделенных мононуклеаров между группами, но наблюдалась тенденция к уменьшению числа клеток в группах П и П-в. В наземном контрольном эксперименте в группе виварного контроля среднее значение количества кариоцитов было достоверно больше, чем в экспериментальной группе (С). Количество клеток в группах восстановления после наземного контрольного эксперимента и виварного контроля достоверно не отличалось из-за большого разброса значений в группе восстановления, но была видна четкая тенденция снижения числа выделенных клеток в этой группе по сравнению с контролем (таблица 4) .

Таблица 4. Количество кариоцитов, выделенных из костного мозга большеберцовой кости мышей С56/Bl/6N

–  –  –

3.1.2. Цитофлуориметрический анализ и иммунофенотип клеток костного мозга большеберцовой кости мышей линии C57Bl/6N Цитофлуориметрический анализ позволил выявить неоднородность кариоцитов, по размеру можно было выделить две субпопуляции клеток (рисунок 16) .

Из-за того, что клетки в двух описанных субпопуляциях отличались по размеру и исходной автофлюоресценции, иммунофенотипирование проводили отдельно в гейте 1 (мелкие кариоциты) и гейте 2 (крупные клетки). Кариоциты костного мозга были окрашены антителами против CD45, CD90 и CD34 и проанализированы на проточном цитофлюориметре Epics XL. На рисунке приведены репрезентативные гистограммы распределения клеток, экспрессирующих определяемые антигены в гейтах 1 и 2 .

Рисунок 16. Распределение кариоцитов костного мозга мышей С57Bl/6N по размеру и структуре. Репрезентативная гистограмма .

Иммунофенотип кариоцитов, попавших в разные гейты, отличался. Среди мелких клеток гейта 1 в группах П и ВК доля СD45+ максимально составила 55-70%, а в группе П-в не превышала 40%. В этом же гейте во всех группах было около 10% кариоцитов, несущих антиген CD90. В группе П доля CD90+ клеток была несколько выше по сравнению с другими группами. Очень небольшая часть (0,5-1,5%) клеток была положительна по CD34 .

В гейте 2 практически все кариоциты (90-96%) были положительны по СD45, а клеток, экспрессирующих другие анализируемые антигены, было очень мало (1-2% - CD90+ и 0,7-1,3%

- CD34+, соответственно) (рисунок 18) .

В наземном контрольном эксперименте среди клеток гейта 1 доля CD45+ клеток варьировала в пределах 55 – 63% во всех группах и различия не были статистически значимыми. Доля СD90+ в группах СВК и С-в составила 13 – 15%, в то время, как в группе С не превышала 10%. В группах СВК и С CD34% клеток было менее 1%, при этом в группе С-в их доля была более 3% .

–  –  –

Рисунок 17. Репрезентативные гистограммы распределения кариоцитов из костного мозга мышей С57Bl/6N, несущих различные антигены .

а,б – негативный контроль;

в,г – СD45;

д,е – СD34;

ж,з- СD90.2 РЕ- антитела мечены фикоэритрином .

В гейте 2 большая часть клеток (80 – 90%) была CD45 положительной. В группе СВК доля клеток, экспрессирующих CD90 и CD34, не превышала 1%. В группе С доля СD90+ клеток составляла 5%, а в группе С-в доля CD34+ клеток была около 2,5%, в остальных случаях значения не отличались от контрольных (рисунок 18) .

CD45 – общий лейкоцитарный антиген, который имеют все гемопоэтические клетки кроме эритроцитов и тромбоцитов (Taube C., Tertilt C. et al., 2011; Sen A., Rothenberg M.E. et al., 2012). Соответственно, согласно полученным нами данным, подавляющее большинство крупных кариоцитов, попавших при цитофлюориметрическом анализе в гейт 2 – это миелоидные и лимфоидные клетки разной степени коммитированности. Оказалось, что у животных после полета доля таких клеток больше, чем у мышей наземных контрольных групп .

Среди мелких клеток гейта 1 только часть кариоцитов была CD45 +. По-видимому, в популяцию мелких попадают гемопоэтические клетки, не несущие CD45 маркер, и негематогенные клетки костного мозга, такие как эндотелий, клетки стромы и др .

Доля СD90+ клеток была существенно выше в гейте 1, чем в гейте 2. В настоящее время, CD90/(Thy1) рассматривается как конститутивный маркер, используемый для идентификации МСК и других малодифференцированных стромальных клеток (Dominici M., Le Blanc K. et al., 2006). Как известно, CD90 маркер в костном мозге может быть экспрессирован на предшественниках Т-клеток, гемопоэтических стволовых клетках, мезенхимальных стромальных клетках, фибробластах, миофибробластах (Juniantito V., Izawa T. et al., 2013). Из всех перечисленных клеточных типов, которые в костном мозге могут иметь этот антиген, наиболее многочисленную популяцию составляют клетки стромального дифферона. Поэтому логично предположить, что именно эти клетки были выявлены нами как CD90+ среди мелких клеток гейта 1 .

антиген экспрессируется, в основном, ранними гемопоэтическими CD34 предшественниками, эндотелием капилляров, стромальными клетками костного мозга, тучными клетками и представляет молекулу межклеточной адгезии (мукозиалин), играющую роль на ранних этапах гемопоэза, опосредуя связывание гемопоэтических клеток с внеклеточным матриксом костного мозга или напрямую со стромальными клетками .

Гемопоэтические предшественники, положительные по CD34, составляли незначительную долю в популяциях крупных и мелких кариоцитов, которая соответствовала имеющимся литературным данным о содержании CD34+ клеток в костном мозге мышей (Morel F., Szilvassy S.J. et al., 1996) .

Рисунок 18. Иммунофенотип кариоцитов, выделенных из костного мозга большеберцовой кости мышей С57Bl/6N .

Данные представлены как M±m, p0,05 ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента Таким образом, анализ кариоцитов костного мозга из большеберцовой кости мышей линии С57Bl/6N после космического полета показал увеличение доли крупных кариоцитов с фенотипом CD45+ и клеток, несущих стромальный маркер CD90. После 7 суток восстановления повышенное число CD45+ крупных клеток сохранялось. В наземном эксперименте наблюдалось увеличение доли крупных CD45+ в экспериментальных группах. В группе С происходило увеличение доли крупных CD90+клеток на фоне снижения числа мелких клеток, несущих CD90 антиген. В группах П-в и С-в происходило увеличение доли CD34+ в двух гейтах, что может говорить об активации регенеративных процессов в костном мозге .

3.1.3. Культивирование клеток из костного мозга

В состав костного мозга входят клетки разных морфологических типов. Причем их соотношение в культуре костного мозга in vitro динамически меняется при культивировании. В связи с этим для морфологического анализа клетки костного мозга мышей были покрашены по Романовскому-Гимзе на 3, 7, 10 и 14 сутки культивирования. На 3 день культура, в основном, была представлена мелкими клетками с одним ядром (10 -30 мкм), практически лишенными цитоплазмы (рисунок 19а). На 7 и последующие дни можно было четко выделить 2 группы клеток: первая – клетки, фенотипически схожие с клетками гемопоэтического ряда – малые (20мкм), с одним компактным ядром, низким ядерно-плазменным соотношением и одним или двумя отростками (рисунок 19б); вторая – типичные представители стромального дифферона – клетки с отростками, имеющие большое ядро с ядрышками, характеризующиеся высоким ядерно-плазменным соотношением. Среди стромальной популяции можно было выделить клетки средних размеров (50-150 мкм) с одним, реже двумя ядрами, в которых четко визуализировались от 3 и более ядрышек, хорошо выраженной цитоплазмой и разным числом коротких отростков (рисунок 19в); крупные клетки (500-700 мкм) с одним или двумя ядрами, гетерогенными по оптической плотности, с длинными, хорошо структурированными отростками (рисунок 19г). Кроме того, были выявлены клеточные ассоциации (350-500 мкм), состоящие из большой центральной клетки с одним или двумя ядрами, которая несет на себе разное число (от 5 до 30) мелких клеток с одним очень плотным ядром, практически без цитоплазмы, так называемые «клетки–няньки» (рисунок 19д) (Шахов В.П., Попов С.В., 2004) .

Рисунок 19. Типы клеток в первичной культуре костного мозга мышей линии C57/Bl/6N .

Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 400 .

А), Б) – гемопоэтические клетки; В), Г), Д) клетки стромального дифферона

А) стрелками указаны клетки 10 -30 мкм;

Б) стрелками указаны клетки 20-50 мкм;

В) стрелками указаны клетки размером 50-150 мкм с одним, реже двумя ядрами (пунктирные стрелки), в которых четко визуализировались от 3 и более ядрышек (сплошные стрелки)

Г) стрелками указаны крупные клетки (500-700 мкм)

Д) клеточные ассоциации (350-500 мкм). Большая центральная клетка (пунктирная стрелка), которая несет на себе разное число (от 5 до 30) мелких клеток с одним очень плотным ядром, практически без цитоплазмы (сплошные стрелки) .

Характерной особенностью популяции клеток костного мозга мышей является то, что при культивировании в течение нескольких пассажей не удается получить достаточно гомогенную культуру ММСК из-за присутствия примеси гемопоэтических клеток, образующих прочные контакты с клетками стромы (Phinney D.G., Kopen G. et al., 1999; Peister A., Melland J.A. et al., 2004). Поэтому для более точного морфологического анализа культуры после двух недель культивирования для уточнения принадлежности к гемальным или стромальным предшественникам клетки костного мозга были покрашены антителами против CD45, CD34 и CD90.2 антигенов, после чего проанализированы при помощи конфокального микроскопа на базе лаборатории С.В. Буравкова (ФФМ МГУ). Мелкие клетки с низким ядерно-плазменным соотношением были CD45-положительны. В клеточных ассоциациях CD45 маркер был обнаружен на мелких клетках и отсутствовал на поверхности крупной клетки. Таким образом, «клетки-няньки» представляют собой аналог ниши (Bessis M.C., 1963), образованной стромальными клетками для гемопоэтических клеток в костном мозге (Dexter T.M., Allen T.D., Lajha L.G., 1977). СD90.2 антиген был выявлен на клетках стромального фенотипа с большим ядром с ядрышками, высоким ядерно-плазменным соотношением и разным числом отростков (рисунок 20) .

Рисунок 20. Иммуноцитохимическая идентификация клеток в первичной культуре клеток из костного мозга мышей линии C57Bl/57N. Конфокальная микроскопия .

А) Клетки, экспрессирующие панлейкоцитарный антиген (CD45);

Б) Клетки, экспрессирующие молекулу межклеточной адгезии (мукозиалин), маркер малодифференцированных прогениторных клеток (CD34);

В) Клетки, экспрессирующие конститутивный маркер малодифференцированных стромальных клеток (СD90) клетки;

Г) стрелками указаны CD45+ клетки на поверхности крупной стромальной клетки .

В группе П к 10 суткам культивирования наблюдалось превалирование стромальных клеток среднего размера, небольшое количество крупных стромальных клеток и практическое отсутствие гемопоэтических клеток, а также «клеток-нянек» (рисунок 21Б) по сравнению с контрольной группой, в которой на данном сроке было достаточно много «клеток-нянек» и клеток гемопоэтического ряда (рисунок 21А). В группе П-в морфологическая картина была схожа с контролем (рисунок 21В). Клеточный состав контрольных групп полетного и наземного экспериментов был одинаков (рисунок 21А, 21Г). В группах наземного эксперимента клеточные популяции экспериментальных групп: С, С-в, морфологически не отличались от клеток контрольной группы СВК (рисунок 21Г, 21Д, 21Е) .

Таким образом, клеточный состав костного мозга мышей претерпевает изменения после длительного космического полета. Уменьшалось количество клеток гемопоэтического ряда, вследствие чего снижалось число клеточных ассоциаций. В период 7-суточной реадаптации происходило восстановление клеточного состава костного мозга до контрольных параметров. В наземном контрольном эксперименте изменения клеточного представительства костного мозга отсутствовали, из чего можно сделать вывод, что именно факторы космического полета являются причиной выявленных изменений .

Б В А Г Д Е Рисунок 21. Клетки из костного мозга мышей линии C57/Bl/6N на 10 сутки в первичной культуре. Фазовый контраст, ув. 400 .

А) ВК, Б) П, В) П-в, Г)СВК, Д) С, Е) С-в .

Стрелками указаны:

клетки стромы, гемопоэтические клетки, «клетки-няньки»

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента

3.1.4. Клоногенная активность стромальных предшественников костного мозга

Основным свойством стромальных предшественников костного мозга является способность образовывать отдельные колонии (КОЕ-ф) in vitro при низкой плотности посадки (Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S., 1970). Поэтому было решено рассмотреть этот параметр как одну из характеристик функционального состояния пула стромальных предшественников костного мозга. Для определения числа КОЕ-ф клетки были посажены с плотностью 4*104 кл/см2, как описано (Meirelles Lda.S., Nardi N.B., 2003). Число КОЕ-ф после космического полета и наземного контрольного экспериментов не отличалось от значений соответствующих контрольных групп. В группе С-в число КОЕ-ф было достоверно больше по сравнению с контрольной группой (таблица 5) .

Таблица 5. Число КОЕ-ф среди кариоцитов костного мозга мышей линии С57Bl/6N

–  –  –

Число 7±2 6±1 7±2 5±1 7±2 8±0* КОЕ-ф Данные представлены как M±m, p0,05, * Достоверное отличие от контроля наземного эксперимента .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента При посадке с плотностью в 3 и 9 раз, превышающей обычно используемую (4*10 4 кл/см2), выявлено дозозависимое увеличение числа КОЕ-ф, что свидетельствует о моноклональности формируемых колоний (рисунок 22) .

Б А

–  –  –

Сформированные колонии были гетерогенны по размеру и морфологии, в связи, с чем были выделены 4 морфологических типа колоний: мелкие колонии (до 3 мм в диаметре);

крупные колонии (более 3 мм); рыхлые колонии (бледно окрашены, в них различимы «отдельные» клетки); плотные колонии (темно-синее окрашивание, «отдельные» клетки не различимы). Размер колоний характеризует способность клоногенных клеток к пролиферации:

активно пролиферирующие клоны характеризуются компактным расположением клеток (плотные колонии), медленно растущие клоны – редким расположением клеток (рыхлые колонии) (Паюшина О.В., Домарацкая, Е.И., 2015). В группах ВК и П преобладали плотные колонии. В группе П-в большинство колоний было рыхлым (рисунок 23). В группах наземного контрольного эксперимента разные по размеру колонии были рыхлыми (рисунок 23), что может указывать на сходную пролиферативную активность во всех группах .

Рисунок 23. Типы КОЕ-ф в культуре клеток костного мозга разных экспериментальных групп .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту .

П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента

3.1.5. Эффективность прикрепления стромальных предшественников костного мозга

Следующим рассмотренным параметром, характеризующим морфофункциональное состояние стромальных предшественников, была эффективность прикрепления клеток in vitro .

При одинаковой плотности посадки 12*104 кл/см2 в группе П количество клеток на мм2 (169±38) на 3 день было достоверно больше, а в группе П-в меньше (28±1), по сравнению с группой ВК (70±16), что демонстрирует бльшую эффективность прикрепления клеток в группе П и сниженную способность к адгезии после семидневного восстановления .

В наземном эксперименте количество клеток в группах С (181±20 кл/мм2) и СВК (135±35 кл/мм2) достоверно не отличались, хотя в группе С наблюдалась четкая тенденция к большему числу прикрепившихся клеток, а в группе С-в число клеток на мм2 было достоверно меньше (21±4) по сравнению с контролем. Эти данные указывают на сходные изменения адгезивных свойств клеток после экспериментальных воздействий и восстановления после них .

3.1.6. Пролиферативная активность клеток в первичной культуре костного мозга

Пролиферативную активность клеток оценивали по числу удвоений популяции клеток (PD). Прирост количества мононуклеаров костного мозга по мере культивирования характеризовался схожими значениями числа удвоений в группах космического полета и виварного контроля (рисунок 24) .

А Б

Рисунок 24. Число удвоений популяций клеток костного мозга большеберцовой кости мышей линии C57Bl/6N .

Данные представлены как M±m, p0,05

А) Полетный эксперимент

Б) Наземный контрольный эксперимент ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента В наземном эксперименте число удвоений популяций клеток в группах С и СВК достоверно не отличались. В группе С-в наблюдалась тенденция к снижению активности пролиферации клеток в первичной культуре костного мозга (рисунок 24) .

В состав костного мозга входят клетки разных дифферонов. Основным свойством стромальных клеток является адгезия к поверхности. Поэтому площадь, занятая адгизированными клетками, может характеризовать пролиферативную активность клеток стромального дифферона костного мозга. Была определена площадь, занятая клетками при плотности посадки 12*104 кл/см2 на 14 сутки культивирования. В группе П наблюдалась тенденция увеличения площади клеток по сравнению с другими группами, но эти изменения не были достоверными из-за высокой вариабельности в этой группе, а также за счет гетерогенности культуры. В группе П-в площадь колоний была достоверно меньше площади, занимаемой клетками в группах П и ВК (рисунок 25) .

А Б

Рисунок 25. Площадь, занятая клетками костного мозга мышей C57/Bl/6N (плотность посадки 12*104 кл/см2) .

Данные представлены как M±m, p0,05, * Достоверное отличие от контроля наземного эксперимента

А) Полетный эксперимент

Б) Наземный контрольный эксперимент ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента В группах наземного эксперимента наблюдались существенные разбросы значений внутри групп из-за гетерогенности культуры клеток. При плотности посадки 12*104 кл/см2 площадь, занятая клетками группы С, была больше контрольных значений, в то время как, группы С-в, была достоверно меньше по сравнению с контролем и значениями группы С (рисунок 25) .

Таким образом, факторы длительного космического полета и наземного контрольного эксперимента не повлияли на способность к колониеобразованию и пролиферативный потенциал стромальных клеток костного мозга мышей тех клеток, которые смогли прикрепиться in vitro. Следует заметить, что после космического полета увеличилась эффективность прикрепления стромальных клеток. Кроме того, наблюдалось снижение эффективности прикрепления и уменьшение площади, занятой клетками в группах восстановления полетного и наземного контрольного наземного экспериментов .

3.1.7. Дифференцировочные потенции стромальных предшественников костного мозга

Известно, что стромальные прогениторы костного мозга способны дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного происхождения (костные, жировые, хрящевые, гладкомышечные и др.). Более того, показано, что факторы космического полета и их моделирование (Буравкова Л.Б., Гершович П.М. и др., 2010) приводят к усилению адипогенеза, за счет снижения остеопотенций клеток-предшественников. Вследствие чего, были изучены спонтанные остео- и адипо- потенциалы стромальных предшественников костного мозга .

Спонтанный остеопотенциал стромальных предшественников костного мозга 3.1.7.1 .

На седьмые сутки во всех экспериментальных и контрольных группах большая часть стромальных предшественников была положительно окрашена на щелочную фосфатазу .

Популяции стромальных клеток-предшественников были гетерогенны по интенсивности окрашивания, причем, среди полетных клеток этот эффект был менее выражен (рисунок 26) .

Рисунок 26. Гетерогенность остеогенных предшественников по активности щелочной фосфатазы – маркера ранних стадий остеодифференцировки. Увеличение 200, окраска Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США) .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реабилитации после космического полета СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реабилитации после наземного контрольного эксперимента

Значения средней интенсивности и распределение интенсивности окраски в группах:

П/ВК, П-в/ВК оказались одинаковыми, т.е. на активность щелочной фосфатазы - раннего маркера остеодифференцировки, не повлияли факторы длительного космического полета .

Стромальный дифферон в основном состоял из клеток со средним уровнем активности щелочной фосфатазы во всех группах исследуемых клеток. Площадь, занимаемая окрашенными клетками в полетной группе, оказалась больше, по сравнению с контрольной группой (рисунок 27). Это соответствует данным по прикреплению клеток и конечной площади, занимаемой ими, что позволяет утверждать, что все эти клетки – строма .

Рисунок 27. Характеристика клеток стромального дифферона в первичной культуре: активность щелочной фосфатазы. Полетный эксперимент .

– средняя интенсивность на клетку, ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета В группах наземного эксперимента характер распределения интенсивности окраски был одинаков, за исключением того, что площадь, занимаемая клетками группы С, была несколько больше по сравнению с контрольной группой, а группы С-в – меньше. В группах С-в/СВК значение средней интенсивности в группе С-в было ниже по сравнению с контрольной группой, но не выходило за рамки доверительных интервалов (рисунок 28) .

Рисунок 28. Характеристика клеток стромального дифферона в первичной культуре: активность щелочной фосфатазы. Наземный контрольный эксперимент .

– средняя интенсивность на клетку .

СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента Полученные данные указывают на то, что факторы длительного космического полета не оказывают негативного влияния на ранние стадии спонтанного остеопотенциала стромальных клеток костного мозга мыши .

Спонтанный адипопотенциал стромальных предшественников костного мозга 3.1.7.2 .

После 7 дней культивирования в стромальных клетках гистохимически выявляли наличие липидных включений с помощью окраски Oil Red О (Sigma, США). Внутриклеточные липидные включения были обнаружены в цитоплазме крупных и мелких клеток стромального фенотипа, что характерно для культуры клеток костного мозга мышей (Паюшина О.В. и др., 2004). Каких-либо отличий между клетками разных групп не обнаружено (рисунок 29), что свидетельствует об отсутствии значимого влияния длительного космического полета и факторов наземного контрольного эксперимента на спонтанную адиподифференцировку стромальных клеток костного мозга мышей в первичной культуре .

В К П

–  –  –

Рисунок 29. Липидные включения в стромальных клетках в первичной культуре, ув. 400 Левый столбец – фазовый контраст, правый столбец – окраска Oil Red О .

Стрелками показаны липидные включения в стромальных клетках разного размера .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета

3.1.8. Клоногенная активность гемопоэтических предшественников костного мозга

Для оценки морфофункционального состояния гемопоэтического компартмента костного мозга мышей, который составляет большинство клеток костного мозга, после полетного и наземного контрольного экспериментов и периода 7-суточной реадаптации криоконсервированные клетки костного мозга были высеяны в полужидкую селективную среду для анализа клоногенной и дифференцировочной способности мультипотентных и линейнокоммитированных гемопоэтических прогениторных клеток .

Общее количество КОЕ в костном мозге мышей после длительного космического полета, незначительно снижалось относительно значений в группе ВК (таблица 6). После 7 дневной реадаптации к условиям земной гравитации в костном мозге мышей общее количество КОЕ оставалось на таком же уровне, как и сразу после полета (таблица 6) .

Таблица 6. Число КОЕ различных миелоидных ростков в полетном эксперименте

–  –  –

В полетном эксперименте абсолютное число колоний гранулоцитарных предшественников (КОЕ-Г) достоверно не отличалось между значениями экспериментальных групп по отношению к контролю (ВК), однако наблюдалась тенденция к снижению числа КОЕГ в полетной группе, а также незначительное повышение количества КОЕ-Г в группе П-в (таблица 6) .

Снижение числа колоний предшественников эритроцитов (БОЕ-Э) в полетной группе было более, чем в 6 раз по сравнению с контрольной группой (таблица 6). При этом наблюдалась тенденция к уменьшению числа колоний ранних гемопоэтических предшественников (КОЕ-ГЭММ). В группе П-в число БОЕ-Э увеличилось в сравнении с группой П, но оставалось ниже контрольных значений, при этом число КОЕ-ГЭММ еще более снизилось. Не обнаружено различий в количестве колоний предшественников макрофагов/моноцитов (КОЕ-М). В группе П-в заметно снижение числа колоний гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (КОЕ-ГМ) по сравнению с группами ВК и П, причем число колоний было достоверно меньше относительно группы П .

Соотношение уни- и мультипотентных колоний между группами П и ВК было схожим .

В группе П-в происходило снижение мульти- и бипотентных предшественников (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ) (рисунок 30) .

Рисунок 30. Соотношение уни- и мультипотентных гемопоэтических КОЕ среди мононуклеаров костного мозга в полетном эксперименте .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета Доля БОЕ-Э в группе П была намного меньше чем в группе ВК (рисунок 31). Процент КОЕ-ГЭММ также снижался по сравнению с контролем, при этом незначительно увеличивались доли миелоидных предшественников белой крови. В группе П-в доля мультипотентных колоний заметно снизилась (рисунок 30). Причем снижение наблюдалось как КОЕ-ГЭММ, так и КОЕ-ГМ ростков (рисунок 31). Среди унипотентных колоний значительно увеличилась доля КОЕ-Г по сравнению с значениями групп П и ВК (рисунок 31) .

Рисунок 31. Соотношение КОЕ различных миелоидных ростков в полетном эксперименте .

ВК – виварный контроль к полетному эксперименту П – группа 30-суточного космического полета П-в – группа 7-дневной реадаптации после космического полета БОЕ-Э – бурстообразующая единица эритроцитов, КОЕ-Г – колониеобразующая единица гранулоцитов, КОЕ-М – колониеобразующая единица макрофагов, КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов, КОЕ-ГЭММ – колониеобразующая единица гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов .

Анализируя полученные нами данные можно сказать, что факторы космического полета не повлияли на общее число колониеобразующих единиц и соотношение уни- и мультипотентных гемопоэтических колоний. При этом наблюдается угнетение эритропоэза, как на уровне линейно-коммитированных, так и на уровне мультипотентных гемопоэтических предшественников. Стоит отметить, что после периода 7-суточной реадаптации не происходит его полного восстановления. После периода 7-ми дневной реадаптации наблюдалось снижение доли мультипотентных колоний и увеличение доли гранулоцитарных предшественников, что может говорить о снижении числа мультипотентных предшественников и активации гранулоцитопоэза, указывающих на усиление врожденного иммунитета в условиях стресса .

Кроме того, увеличение количества КОЕ-Г на фоне низкого уровня БОЕ-Э и снижения количества КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ может свидетельствовать о реципрокных взаимоотношениях гемопоэтических ростков в костном мозге, когда при увеличении количества клеток одного ростка снижается количество клеток других ростков, не подвергшихся стимуляции (Иванова С.М., 2002) .

Общее количество КОЕ в костном мозге мышей после наземного контрольного эксперимента показали тенденцию к снижению (таблица 7) .

Таблица 7. Число КОЕ разных миелоидных ростков в наземном контрольном эксперименте

–  –  –

Кроме этого, в группе С происходило увеличение количества БОЕ-Э (в 2,7 раза) на фоне небольшого снижения количества КОЕ-Г и КОЕ-М (таблица 7) .

После 7 дней реадаптации общее количество КОЕ в группе С-в увеличилось относительно групп СВК и С (таблица 9). Число БОЕ-Э снизилось до уровня СВК. Количество КОЕ-Г, М, ГМ в группе С-в увеличилось в сравнении со значениями группы С, а в случае КОЕГ и КОЕ- ГМ также превысило и контрольные значения (таблица 7) .

Соотношение уни- и мультипотентных колоний между группами С и СВК было схожим .

В группе С-в происходило увеличение мульти- и бипотентных предшественников за счет увеличения числа КОЕ-ГМ (рисунок 32) .

Рисунок 32. Соотношение уни- и мультипотентных гемопоэтических КОЕ среди мононуклеаров костного мозга в наземном контрольном эксперименте .

СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту С – группа наземного контрольного эксперимента С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента Доля БОЕ-Э в группе С была больше чем в группе СВК (рисунок 33). Причем увеличение эритроидных предшественников происходило как на уровне общих предшественников (КОЕ-ГЭММ), так и на уровне более коммитированных предшественников (БОЕ-Э). При этом наблюдалось уменьшение доли гранулоцитарных предшественников. В группе С-в соотношение долей разных ростков возвратилось к контрольным значениям (рисунок 33) .

Рисунок 33. Соотношение КОЕ различных миелоидных ростков в наземном контрольном эксперименте .

СВК - виварный контроль к наземному контрольному эксперименту, С – группа наземного контрольного эксперимента, С-в - группа 7-дневной реадаптации после наземного контрольного эксперимента, БОЕ-Э – бурстообразующая единица эритроцитов, КОЕ-Г – колониеобразующая единица гранулоцитов, КОЕ-М – колониеобразующая единица макрофагов, КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов, КОЕ-ГЭММ – колониеобразующая единица гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов .

Анализируя данные наземного контрольного эксперимента, можно сказать, что после наземного контрольного эксперимента общее число КОЕ статистически не отличалось между группами. В группе С происходит усиление эритропоэза, как на уровне раннего гемопоэтического предшественника, так и на уровне линейнокоммитированных клеток. Период 7 дневной реадаптации после наземного контрольного наземного эксперимента привел к восстановлению БОЕ-Э до исходного уровня. При этом также увеличилось количество КОЕ остальных ростков, за исключением КОЕ-ГЭММ. Наблюдаемый характер изменений, может свидетельствовать о наступлении фазы восстановления после стрессирующих условий эксперимента .

Таким образом, не обнаружено негативных изменений клоногенной, пролиферативной и дифференцировочной активности стромальных предшественников из костного мозга мышей C57Bl/6N после длительного 30-суточного космического полета. Число гемопоэтических колоний и соотношение уни-/мультипотентных колониеобразующих единиц также не изменились, хотя наблюдалась тенденция к уменьшению общего числа гемопоэтических колоний. Выявлено уменьшение колониеобразующих единиц миелоидного ростка кроветворения на уровне мультипотентных – КОЕ-ГЭММ, бипотентных – КОЕ-ГМ и унипотентных – БОЕ-Э и КОЕ-Г .

В период 7-дневной реадаптации происходило снижение эффективности прикрепления и пролиферативной активности стромальных клеток. Увеличение числа колоний гранулоцитарных предшественников указывает на восполнение дефицита клеточного компонента врожденного иммунитета, но восстановление эритропоэза в этот период было неполным .

Результаты, полученные после наземного контрольного эксперимента, демонстрируют, что в основном функциональная активность прогениторных клеток костного мозга мышей не менялась. Наблюдались специфические реакции со стороны гемопоэза, такие как активация эритропоэза, что проявилось в увеличении числа уни- и мультипотентных гемопоэтических колоний (КОЕ-ГЭММ, БОЕ-Э) .

После 7 дней реадаптации количество гемопоэтических колониеобразующих единиц соответствовало контролю, а эффективность прикрепления и пролиферативная активность костномозговых стромальных предшественников снизились по сравнению с контролем .

Считается, что причиной изменений в системах костной и гемопоэтической тканей, описанных ранее, может являться воздействие факторов космического полета на стволовые и прогениторные клетки костного мозга. В связи с этим, представляется интересным более подробно обсудить накопленные к настоящему времени данные (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977; Каландрова М.П, Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Швец В.Н., Вацек А. и др., 1981; Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Wronski T.J., Morey E.R., 1983; Vacek A., Serova L.V. et al., 1985;

Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Ильин Е.А., Капланский А.С., Савина Е.А., 1989; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991; Domaratskaya E.I., Michurina T.V. et al., 2002; Allebban Z., Gibson L.A. et al., 1996; Ichiki A.T., Gibson L.A. et al., 1996; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et al., 1996) .

Обобщение результатов, полученных после 7-22 суточных полетов крыс Вистар на биоспутниках «Космос» и «Бион» позволило сделать вывод, что в результате полетов происходит снижение числа прогениторных гемопоэтических клеток в костном мозге (Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Vacek A., Tkadlecek L. et. al, 1982; Wronski T.J., Morey E.R., 1983; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991) при сохранении клеточности и общей митотической активности кариоцитов костного мозга на уровне контроля (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977; Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987;

al., 1996). Было выявлено угнетение эритроидного, Lesnyak A., Sonnenfeld G. et представленного небольшими по численности и редко расположенными группами клеток, и лимфоидного ростков при усилении гранулоцитопоэза в костном мозге, с одновременным уменьшением числа ретикулоцитов в крови (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977; Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981; Vacek A., Tkadlecek L. et al., 1982; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991; Domaratskaya E.I., Michurina T.V. et al., 2002). Не было выявлено существенных изменений состава костного мозга – большое число клеток костного мозга составляли зрелые нейтрофилы, среди них встречались группы незрелых клеток типа миелобластов и промиелоцитов. Встречались отклонения в строении отдельных типов клеток, в основном у мегакариоцитов (Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1981;

Vacek A., Tkadlecek L. et al., 1982; Швец В.Н., Вацек А. и др. 1984; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991). Способность дифференцировки стволовых клеток в клетки эритроидного и миелоидного рядов не нарушались. Наблюдалось небольшое процентное преобладание гранулоцитарных элементов и их ранних предшественников в миелограмме у крыс полетной группы, сопровождающееся увеличением числа лейкоцитов и нейтрофилов в крови, что указывает на усиление гранулоцитопоэза в условиях космического полета. Активный гранулоцитопоэз, возможно, был обусловлен снижением резистентности организма к инфекциям. Эти изменения проходили на фоне снижения физиологической регенерации гемопоэза у крыс после полета (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977). Содержание Т- и Влимфоцитов в селезенке существенно не менялось, тогда как количество Т-лимфоцитов в костном мозге увеличивалось при снижении их пролиферативной активности. Также снижалась цитотоксическая активность NК-клеток. Наблюдалась инволюция лимфоидной ткани в тимусе (Швец В.Н., Вацек А. и др. 1984) .

Исследования КОЕ методом селезеночных колоний показали существенное (в 20 раз) снижение числа КОЕ в костном мозге. Эритроидная дифференцировка оставшихся КОЕ была существенно заторможена, а гранулоцитарная, напротив, усилена. Эти результаты хорошо согласуются с наблюдениями, описанными для костного мозга (Швец В.Н., Вацек А. и др. 1984;

Vacek A., Serova L.V. et al., 1985) .

Таким образом, анализ гемопоэза продемонстрировал наличие угнетающего действия факторов космического полета (7 – 22 суток), которое носило обратимый характер и полностью компенсировалось через 25-27 дней реадаптации. Факторы космического полета не затрагивают потенции стволовых клеток, ответственных за воспроизводство клеточного состава костного мозга, и выявленные изменения касаются, в основном, зрелых и созревающих клеток (Каландрова М.П., Родина Г.П., Серова Л.В., 1983; Vacek A., Serova L.V. et al., 1985) .

Результаты, полученные в эксперименте на СЛС-2 с крысами линии Спрейг-Доули после 13-14 суточного пребывания в условиях невесомости на МКС, в целом, соответствуют более ранним результатам экспериментов серии «Бион». Анализ костного мозга полетных крыс свидетельствует о торможении эритропоэза и лимфопоэза, снижении числа циркулирующих эритроцитов и лимфоцитов, усилении гранулоцитопоэза, появлении недифференцированных клеток и снижении активности иммунных клеток при сохранении митотической активности клеток костного мозга Число КОЕ-Г, КОЕ-ГМ, КОЕ-М, БОЕ-Э было меньше по сравнению с контролем. Кроме этого было снижено по сравнению с контролем общее число лейкоцитов и абсолютное число лимфоцитов и моноцитов за исключением нейтрофилов, количество числа циркулирующих эритроцитов. Содержание CD4-, CD8-, CD2-, CD3-Т-лимфоцитов и В-клеток в периферической крови также уменьшалось. Отличий резидентных лимфоцитов селезенки не было обнаружено (Allebban Z., Gibson L.A. et al., 1996; Ichiki A.T., Gibson L.A. et al., 1996;

Lesnyak A., Sonnenfeld G. et al., 1996). Кроме этого, была снижена активность Т-лимфоцитов .

Пролиферация клеток костного мозга после полета не изменилась, а после двух недель реадаптации увеличилась. Пролиферативная активность ГСК селезенки снижалась после полета и восстанавливалась до уровня контрольных значений после 14-суточной реадаптации .

Активность NK-клеток костного мозга не изменялась достоверно по сравнению с контролем (Allebban Z., Gibson L.A. et al., 1996; Lesnyak A., Sonnenfeld G. et al., 1996). Влияние микрогравитации на потенциал гемопоэтических клеток был изучен в модели in vitro. CD34+ клетки культивировали в жидкой среде на стромальном подслое после экспозиции в течение 8суток на космических кораблях STS-63 и STS-69. Было выявлено снижение их пролиферации, кроме этого, число эритроидных и миелоидных колоний было достоверно меньше по сравнению с контрольной группой. Клетки после экспозиции на МКС быстрее вступали в макрофагальную дифференцировку, чем клетки в наземном контроле (Davis T.A., Wiesmann W. et al., 1996) .

Полученные нами данные после космического полета биоспутника «Бион-М1», несмотря на имеющиеся различия (высота орбиты, длительность полета, видовая принадлежность экспериментальных животных), совпадают с результатами, полученными в предыдущих сериях экспериментов на биоспутниках, что указывает на общие закономерности развития выявленных изменений. Пролиферативная активность и общее число гемальных колоний остались на исходном уровне, происходило угнетение эритроидного ростка. В период 7-суточной реадаптации наблюдалось увеличение доли дифференцированных предшественников, с преобладанием гранулоцитарного ростка. Уменьшение числа эритроидных предшественников может быть связано как со снижением общего объема крови, и соответственно снижения числа эритроцитов для сохранения физиологических реологических свойств крови, так и со снижением потребности тканей в кислороде, в связи со снижением нагрузки. Кроме того, показано, что ряд важных факторов, регулирующих гемопоэз, и эритропоэз, в частности, (CXCL12, остеопонтин, ангиопоэтин-1, ТРО, SCF, EPO, HIF1/2) выделяется остеобластами (Rancin E.B., Wu C. et al., 2012; Green D.E., Rubin C.T., 2014; Calvi L.M., Link D.C., 2014; Klamer S., Voermans C., 2014; Panaroni C., Tzeng Y. et al., 2014). Возможно, снижение числа остеобластов, или более ранних стромальных предшественников костной ткани, во время космического полета могло привести к отмеченным изменениям (Calvi L.M., Link D.C., 2014) .

Данное предположение было бы интересно проверить в последующих экспериментах на биоспутниках .

При сравнении результатов, полученных в наземном контрольном эксперименте и после космического полета, выявлены противоположные эффекты на гемопоэтические стволовые клетки, в особенности, клетки эритроидного ростка. Изменения, возникающие в костном мозге у полетных и синхронных животных, по всей видимости, имеют различную природу .

Полученные нами данные хорошо коррелируют с результатами экспериментов, выполненных в 1970-х годах под руководством В.Н. Щвеца, по ограничению двигательной активности у крыс, в которых было показано, что после 2 недель эксперимента количество эритроидных КОЕ увеличивалось в 2-3 раза. Стоит отметить, что изменения, наблюдаемые у синхронных и полетных животных, могут иметь аналогичный характер, в частности, снижение массы тимуса и селезенки, однако их проявления после полета более выражены (Gridley D.S., Nelson G.A. et al., 2003). Кроме того, усиление эритропоэза могло вызвать существенное, (в 30 раз) по сравнению с полетом, повышение содержания углекислого газа в газовоздушной смеси в наземном контрольном эксперименте (Андреев-Андриевский А.А., Шенкман Б.С. и др., 2014) .

Тесная взаимосвязь стромальных и гемопоэтических клеток – отличительная черта культивируемых клеток костного мозга мышей, из-за чего гемопоэтические клетки встречаются даже после нескольких субкультивирований (Паюшина О.В., Буеверова Э.И. и др., 2002). Нами отмечено малое число гемопоэтических клеток в группе П, и их появление после семи дней реадаптации в группе П-в. Это коррелирует с полученными ранее данными о негативном влиянии факторов космического полета на гемопоэтические клетки костного мозга .

К сожалению, исследования компартмента стромальных предшественников, вовлеченных в ремоделирование костной ткани, которые сейчас принято называть мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК), при проведении экспериментов на биоспутниках пока немногочисленны. Эксперименты в рамках программы «Бион» выявили уменьшение массы минерализованной ткани, увеличение жировой ткани в костном мозге, снижение количества остеобластов при сохранении числа остеокластов, угнетение периостального ремоделирования в трубчатых костях (Jee W.S., Wronski T.J. et al., 1983; Wronski T.J., Morey E.R., 1983). Кроме того, было продемонстрировано и уменьшение числа костномозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у полетных животных (Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987). Эксперименты на биоспутниках «Космос» также показали снижение минерализации костей, особенно длинных трубчатых, уменьшение количества остеобластов и их активности при сохранении или увеличении числа остеокластов и появлении ранних предшественников остеокластов (Рогачева И.В., Ступаков Г.Н. и др., 1984;

Ильин Е.А., Капланский А.С., Савина Е.А., 1989; Дурнова Г.Н., Капланский А.С. и др., 1990) .

Изменялась активность клеток костной ткани. У крыс под влиянием невесомости происходило угнетение активности щелочной фосфатазы и повышение активности кислой фосфатазы в костях (Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987). Отмечено снижение содержания коллагена I типа в костной ткани и появление коллагена III типа, типичного для эмбриональных тканей, кожи и сосудов, а также ранних стадий воспаления и заживления, который в норме продуцируется клетками гладких мышц, фибробластами, ретикулярными клетками, но не остеобластами (Поспишилова И., Поспишил М., Серова Л.В., 1989). Число костно-мозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у полетных животных после 14 дней полета снижалось по сравнению с контрольными значениями (Vacek A., Bueverova E.I. et al., 1990). Результаты, полученные в эксперименте на СЛС-1, СЛС-2, показали, что после 9 – 14 суточного пребывания в условиях невесомости, имелись начальные признаки развития остеопении большеберцовой кости и торможения роста кости в длину. Зафиксировано наличие мононуклеарных клетокпредшественников остеокластов (Воробьева Г.Н., 1994; Дурнова Г.Н., Капланский А.С. и др., 1996). Молекулярно-генетический анализ выявил снижение уровня экспрессии мРНК остеонектина, остеокальцина, коллагена I типа в клетках костной ткани бедренной кости (Evans G.L., Morey-Holton E., Turner R.T., 1998) .

Более поздние исследования позволили прояснить механизм вовлечения различных типов костных клеток в костный гомеостаз в невесомости. Так, было показано, что в этих условиях происходит замедление клеточного цикла остеобластов и усиление остеоцитопосредованного остеолизиса (Blaber E.A., Dvorochkin N. et al., 2013). Кроме этого, угнетается дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток, о чем свидетельствует снижение экспрессии маркерных генов без снижения экспрессии ранних маркеров «стволовости», что сопровождается увеличением числа малодифференцированных предшественников (Blaber E., Sato K., Almeida E. A.C., 2014). Тем не менее, многие вопросы, связанные с потенциалом малодифференцированных стромальных предшественников, локализованных в костном мозге, остаются открытыми .

Анализируя полученные нами результаты, можно констатировать, что равное число КОЕ-ф сразу после длительного космического полета, периода реадаптации и виварного контроля свидетельствует о сохранности стволовых клеток стромального дифферона. Отличие от полученных ранее результатов на крысах, где выявлено уменьшение КОЕ-ф (Швец В.Н., Кривенкова Н.П., 1977; Domaratskaya E.I., Michurina T.V. et al., 2002) может объясняться видовой особенностью выбранного объекта исследования и увеличением длительности полета и действием перегрузок во время посадки спускаемого аппарата. При анализе поведения тотальной популяции клеток костного мозга, включающей стволовые и прогениторные клетки in vitro, было обнаружено, что на 3 день и далее общее количество клеток в культуре было достоверно больше по сравнению с контрольной группой. Этот результат может объясняться усиленной пролиферацией клеток стромы в группе П (Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., 2015) во время полета из-за воздействия малых доз ионизирующего излучения (Домарацкая Е.И., Старостин В.И. и др., 2003; Domaratskaya E.I., Tsetlin V.V. et al., 2005). Кроме того, клетки группы П, по-видимому, обладают большей эффективностью прикрепления, т.к. число удвоений популяций групп П и ВК не отличаются. Преобладание рыхлых колоний и снижение числа прикрепившихся клеток в группе П-в, по сравнению со значениями групп П и ВК, говорит о том, что как пролиферативные, так и адгезивные свойства стромальных предшественников после 7 дней реадаптации подавлены .

Площадь колоний, занимаемая клетками группы П, достоверно больше по сравнению с соответствующим контролем, что коррелирует с данными о числе прикрепившихся клеток на 3 сутки культивирования. При одинаковой пролиферативной активности клеток костного мозга такое поведение может объясняться активацией стромальных предшественников после экстремального воздействия (космический полет или перегрузки при посадке). Достоверное снижение этих показателей в группе П-в, как относительно контрольной группы, так и полетной, свидетельствует о незавершившейся адаптации к земным условиям. Это своего рода «качели» физиологических реакций на экстремальное воздействие: воздействие – усиление всех процессов – «качели» вверх; прекращение воздействия (незавершенная адаптация) – «качели»

вниз. В проведенных ранее исследованиях показано, что на 14 сутки реадаптации не происходит полного восстановления исследуемых функций. В то же время после космических полетов длительностью 7 – 22 суток полное восстановление наступает в течение 26 – 27 суток реадаптации крыс (Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Vacek A., Michurina T.V. et al., 1991) .

В группах наземного контрольного эксперимента наблюдалась похожая картина. Число прикрепившихся клеток на 3 сутки культивирования и площадь, занимаемая колониями, в группе С были больше по сравнению с группой СВК. В группе С-в как число прикрепившихся клеток, так и площадь, занимаемая колониями, были достоверно меньше по сравнению со значениями групп С и СВК .

Меньшая гетерогенность по активности щелочной фосфатазы и большая площадь, занятая окрашенными клетками в полетной группе по сравнению с группами контроля и восстановления говорит о сохранности спонтанного остеопотенциала клеток и большем числе стромальных клеток, что согласуется с данными об эффективности прикрепления клеток и морфологии колоний .

Изучение влияния факторов космического полета на стромальные предшественники костного мозга является сложной проблемой, т.к. на нее накладывается ряд объективных ограничений, основное из них – малое количество клеток. Они составляют 0.001 – 0.01% от всех мононуклеарных клеток костного мозга (Procop, D. J., 1997) и для более полного исследования процессов, возникающих при действии факторов космического полета требуется большое число подобных экспериментов .

Комбинированное действие длительного фракционированного -облучения и 3.2 .

антиортостатического вывешивания на нишу прогениторных клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar Для исследования были взяты самцы крыс линии Wistar Подопытные животные были случайным образом разделены на 4 экспериментальные группы: 1. Виварный контроль - «К», 2 .

Вывешивание – «В», 3. Группа облучения, животные, которые были подвержены воздействию ионизирующего излучения в суммарной дозе 3 Гр – «О», 4. Животные, подвергшиеся синхронному комбинированному воздействию длительного фракционированного -облучения и вывешивания – «ОВ». После периода 2-недельной реадаптации животные также были разделены на группы: виварный контроль после восстановления – «ВК», восстановление после воздействия вывешивания – «ВВ», восстановление после облучения – «ВО», восстановление после комбинированного действия вывешивания и ионизирующего облучения – «ВОВ» .

Выделение костного мозга проводили из двух бедренных костей каждого животного (рисунок 34) .

Рисунок 34. Схема эксперимента по оценке влияния моделирования эффектов факторов микрогравитации и космического излучения на нишу прогениторных клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar

–  –  –

Число, выделенных мононуклеаров костного мозга после длительного (30 суток) вывешивания и фракционированного -излучения, достоверно не отличалось от количества клеток, выделенных в группе контроля, но следует отметить тенденцию к увеличению числа выделенных клеток в экспериментальных группах. В среднем, наибольшее число клеток было выделено в группе В (532*106 кл), чуть меньше в группе О (410*106 кл), а в группе ОВ (340*106 кл) число выделенных мононуклеаров было схожим с контрольными значениями (323*10 6 кл) (рисунок 35А). Увеличение числа выделенных мононуклеаров в группах может объясняться снижением адгезионных свойств клеток из-за остеопороза костей задних конечностей после воздействия опорной разгрузки и ионизирующего излучения и (Wronski T.J., Morey-Holton E.R.,1987; Green D.E., Rubin C.T., 2014) .

Рисунок 35. Количество выделенных мононуклеаров костного мозга крыс линии Wistar

А) После 30-ти суточного вывешивания и облучения

Б) После периода 2-недельной реадаптации † - достоверное отличие значений групп ВВ от В; ВО от О Данные представлены как M±m, p0,05 К, ВК – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

Отсутствие значимого увеличения числа выделенных клеток в группе комбинированного воздействия, может объясняться нелинейным эффектом действия нескольких факторов разной физической природы. Воздействие одного фактора, возможно, меняет чувствительность клеточных систем к действию другого .

После 14-суточного восстановления число выделенных мононуклеаров не отличалось от значений в контроле. Стоит обратить внимание, что этот показатель в группах ВВ и ВО было достоверно меньше по сравнению с данными до периода восстановления в соответствующих группах (рисунок 35Б) .

3.2.2. Цитофлуориметрический анализ и иммунофенотип клеток костного мозга На 18 день культивирования был определен фенотип клеток. Анализируемые клетки были достаточно однородны по структуре, размеру и уровню автофлюоресценции и представляли собой одну субпопуляцию клеток (рисунок 36) .

Рисунок 36. Гистограмма распределения ядросодержащих клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar на 18 день культивирования Клетки были окрашены моноклональными антителами против следующих поверхностных маркеров CD90, CD73, характерных для стромальных клеток и CD45, CD11b основных маркеров лейкоцитов. Окрашенные клетки были проанализированы на проточном цитофлюориметре Epics XL (рисунок 37) .

CD90(Thy1) является часто используемым маркером для идентификации МСК и других малодифференцированных стромальных клеток (Dominici M., Le Blanc K. et al., 2006) .

CD73 – гликозилфосфатидилинозитол (GPI), якорный клеточный поверхностный белок, известный так же, как экто-5’-нуклеотидаза, играющий критическую роль в переключении на адреносинергитический сигнальный путь (Stagg J., Smyth M.J., 2010). Это сигнальная молекула адгезии, регулирующая взаимодействие клетки с компонентами внеклеточного матрикса, такими как ламинин и фибронектин (Ghiringhelli F., Bruchard M. et al., 2012) .

CD45 –антиген, представленный на всех гемопоэтических клетках, кроме эритроцитов и тромбоцитов (Taube C., Tertilt C. et al., 2011; Sen A., Rothenberg M.E. et al., 2012) .

CD11b – субъединица рецептора интегринов, известного как макрофаг -1 – антиген. Масэкспрессируется на многих клетках, отвечающих за врожденный иммунитет (моноциты, гранулоциты, макрофаги и естественные киллеры) (Ho M.K., Springer T.A., 1982), которые вовлекаются в различные стадии иммунного ответа, включающие в себя адгезию, миграцию, фагоцитоз, хемотаксис, клеточную активацию и цитотоксичность (Hynes R.O., 2002; Solovjov D.A., Pluskota E., Plow E.F., 2005) .

Рисунок 37. Репрезентативные гистограммы распределения кариоцитов из костного мозга костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar на 18 день культивирования, несущих различные антигены РЕ- антитела мечены фикоэритрином FITC – антитела мечены флуоресцеином изотиоцианатом Во всех экспериментальных группах большинство клеток (89 – 99%) экспрессировали маркер стромальных клеток CD90. Однако в группе ОВ доля CD90+ была меньше по сравнению с другими группами. Доля CD73+ клеток в группах с облучением оказалась ниже контрольных значений. В группе В доля CD73+ клеток была такой же, как и в контроле. Доля CD45+ и СD11b+ клеток была достоверно больше в группе О по сравнению со всеми остальными (рисунок 38). Увеличение доли CD45+ и CD11b+ клеток в группе О может демонстрировать усиление взаимодействия стромальных и гемопоэтических клеток, при этом уменьшение доли CD73+ клеток, возможно, говорит, что взаимодействие с гемопоэтическими клетками снижает адгезивные свойства стромальных клеток. Отсутствие этого эффекта при комбинированном воздействии указывает на отсутствие аддитивности действующих факторов (Лившиц Н.Н., Мейзеров Е.С. и др., 1973; Штенберг А.С., 2014) .

Рисунок 38. Иммунофенотип клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar после 30-ти суточного вывешивания и облучения на 18 день культивирования .

Данные представлены как M±m, p0,05, - достоверное отличие от контроля, p0,05 К – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания .

После реадаптации доля CD90+ клеток во всех группах была одинаковой и составляла 98%. Доля CD73+ увеличилась во всех экспериментальных группах, особенно в группе ВВ (98%). Число гемопоэтических клеток (CD45 и СD11b) во всех группах не превышала 5%. В группах ВО и ВОВ доля СD11b+ клеток была около 4%, что превышало значения в группах ВК и ВВ (рисунок 39). Стоит отметить, снижение в группе ВО числа клеток, несущих гемопоэтические маркеры, после периода реадаптации. Максимальные изменения были выявлены в группах с воздействием ионизирующего излучения, что свидетельствует о большей чувствительности ниши прогениторных клеток костного мозга именно к этому фактору .

Восстановление долей прогениторных клеток, несущих различные антигены, до контрольных значений говорит об обратимости негативных изменений, вызванных стрессирующими факторами, и адекватной работе компенсаторных механизмов приспособления к изменяющимся внешним условиям .

Рисунок 39. Иммунофенотип клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar после периода 2-недельной реадаптации на 18 день культивирования .

Данные представлены как M±m, p0,05, - достоверное отличие от контроля, p0,05 ВК – виварный контроль, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

3.2.3. Клоногенная активность гемопоэтических предшественников костного мозга

Для оценки морфофункционального состояния гемопоэтического компартмента костного мозга крыс, который составляет большинство клеток костного мозга, после моделирования эффектов микрогравитации и космического излучения и периода 2-недельной реадаптации клетки костного мозга были высеяны в полужидкую селективную среду для анализа клоногенной и дифференцировочной способности мультипотентных и линейнокоммитированных гемопоэтических прогениторных клеток .

После 30 суток воздействия общее число гемопоэтических КОЕ в костном мозге у облученных животных снизилось. Интересно, что облучение при вывешивании привело к незначительному увеличению числа колоний (рисунок 40). Возможно, это объясняется, как и в случае изменения иммунофенотипа, неустановленным характером влияния на клетки факторов гиподинамии и облучения (Штенберг А.С., 2014), кроме того имеются данные, что в 50% случаев низкие дозы -облучения приводят к увеличению числа гемопоэтических колоний in vitro (Домарацкая Е.И., Старостин В.И. и др., 2003) .

Рисунок 40. Число гемопоэтических колоний, образованных миелоидными предшественниками костного мозга крыс линии Wistar после 30-ти суточного вывешивания и облучения .

Данные представлены как M±m, p0,05. К – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания .

Снижение числа колоний в группе О, в основном, происходило за счет уменьшения гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ) и гранулоцитарных (КОЕ-Г) предшественников, причем снижение числа КОЕ-Г было наиболее выраженным. После вывешивания наблюдалась тенденция к уменьшению числа КОЕ предшественников макрофагов. В группе ОВ увеличивалось число всех типов КОЕ, но более всего увеличилось число колоний предшественников макрофагов (КОЕ-М) (таблица 8) .

Таблица 8. Число КОЕ разных миелоидных ростков после 30-ти суточного вывешивания и облучения

–  –  –

Следует отметить изменение соотношения разных типов гемопоэтических колоний в экспериментальных группах по сравнению с контролем (рисунок 41) .

Рисунок 41. Соотношение разных типов гемопоэтических колоний, образованных мононуклеарами костного мозга крыс линии Wistar после 30-ти суточного вывешивания и облучения. К – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания .

КОЕ-Г – колониеобразующая единица гранулоцитов, КОЕ-М – колониеобразующая единица макрофагов, КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов .

В группе В доля КОЕ-ГМ увеличилась в 2 раза по сравнению с контролем, при этом доля КОЕ-М уменьшилась в двое. В группах О и ОВ доля КОЕ-М возросла в 2 и 1,5 раза, соответственно, доля КОЕ-Г снизилась в 1,3 – 1,6 раза. После вывешивания число колоний, образованных ранними плюрипотентными предшественниками, было больше (30%) по сравнению с остальными группами (15%), в которых соотношение плюри- и монопотентных колоний было одинаковым (рисунок 42) .

Рисунок 42. Соотношение уни- и бипотентных гемопоэтических колоний, образованных мононуклеарами костного мозга крыс линии Wistar после 30-ти суточного вывешивания и облучения. К – виварный контроль, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

После 2-недельного периода реадаптации, общее количество КОЕ приблизилось к контрольным значениям (рисунок 43) .

Рисунок 43. Число гемопоэтических колоний, образованных миелоидными предшественниками костного мозга крыс линии Wistar после периода 2-недельной реадаптации. Данные представлены как M±m, p0,05. К – виварный контроль, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

Число колоний в группе ВО увеличилось в 1,6 раза в основном за счёт увеличения числа КОЕ-Г (увеличение в 3,6 раза), а в группе ВОВ незначительно снизилось из-за уменьшения числа КОЕ-М (таблица 9). В период восстановления после вывешивания число гранулоцитарномакрофагальных предшественников уменьшилось в 2 раза, по сравнению с данными, полученными после вывешивания, а в группе ВОВ уменьшилось число макрофагальных предшественников, как на уровне би-, так и на уровне унипотентных предшественников (таблица 9) .

Таблица 9. Число КОЕ разных миелоидных ростков после периода 2-недельной реадаптации .

–  –  –

Соотношение долей гемопоэтических КОЕ разных типов после 2-недель реадаптации вернулось к контрольным значениям (рисунок 44). Увеличилась доля КОЕ-Г во всех группах (в 1,2 – 1,9 раза), при этом доля КОЕ-М в группах ВО и ВОВ снизилась в 2 – 2,5 раза. Доля КОЕГМ уменьшилась во всех экспериментальных группах, наиболее значимо в группе ВВ – в 2 раза, а группах ВО и ВОВ незначительно (рисунок 44) .

Рисунок 44. Соотношение разных типов гемопоэтических колоний, образованных мононуклеарами костного мозга крыс линии Wistar после периода 2-недельной реадаптации .

К – виварный контроль, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания. КОЕ-Г – колониеобразующая единица гранулоцитов, КОЕ-М – колониеобразующая единица макрофагов, КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов .

Соотношение плюри- и монопотентных колоний во всех группах после периода восстановления было сходным (рисунок 45). Доля бипотентных колоний в группе ВВ уменьшилась в 2,5 раза по сравнению с группой В и достигла контрольных значений. В группах ВО и ВОВ доля бипотентных колоний также снизилась, но незначительно .

Таким образом, в период 2-недельной реадаптации происходит восстановление пула гемопоэтических предшественников (гранулоцитарных, макрофагальных и гранулоцитарномакрофагальных) костного мозга крыс. Изменения, обнаруженные сразу после воздействия, носят обратимый характер, что свидетельствует о сохранности гемопоэтического дифферона костного мозга крыс .

Рисунок 45. Соотношение уни- и бипотентных гемопоэтических колоний, образованных мононуклеарами костного мозга крыс линии Wistar после периода 2-недельной реадаптации .

ВК – виварный контроль, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

3.2.4. Размер гемопоэтических колоний костного мозга

Ранее в работах под руководством Швеца В.Н. было показано модифицирующее влияние радиационного облучения на гемопоэтические клетки, как изменение размеров колоний (показано на мышах с использованием теста селезеночных колоний) (Швец В.Н., 1975). В нашей работе при изучении влияния неблагоприятных факторов разной физической природы на функциональную активность костномозговых гемопоэтических прогениторов крыс также были выявлены изменения в значениях площади образуемых колоний. Так, площадь гранулоцитарных колоний уменьшалась, при этом эффект был наиболее выражен при комбинированном воздействии. Площадь макрофагальных колоний, наоборот, была выше контрольных значений в группе О, однако стоит отметить существенную вариабельность значений. Площадь смешанных колоний уменьшалась при всех рассмотренных воздействиях .

Наиболее выраженное снижение наблюдалось после вывешивания (рисунок 46). После периода восстановления площадь, занятая колониями практически не изменилась (рисунок 46) .

Наблюдалось незначительное уменьшение площади, занятой гранулоцитарными колониями в группе ВО .

Рисунок 46. Средняя площадь гемопоэтических колоний разных типов в костном мозге крыс линии Wistar после 30-ти суточного вывешивания и облучения и 2-недельного периода реадаптации .

Данные представлены как M±m, * - достоверное отличие от контроля, p0,05, К – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

Кроме этого было определено соотношение площади, занимаемой гемическими колониями к их числу. Известно, что размер колоний, т.е. занимаемая ими площадь характеризует пролиферативный потенциал клоногенных клеток, активно пролиферирующие клоны образуют крупные колонии (Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., 2015). Если исходить из утверждения одна клетка – одна колония, то по отношению площади КОЕ к их числу (S/N), можно косвенно судить о пролиферативном потенциале клоногенных клеток .

После облучения S/N-отношение увеличилось в 2,5 раза среди гранулоцитарных предшественников. При вывешивании значения S/N-отношение увеличилось у макрофагальных предшественников и снизилось в 3 раза у бипотентных (рисунок 46). При комбинированном воздействии наблюдалось снижение значения показателя S/N-отношения у всех гемических предшественников. После 2-недельного восстановления в группе ВО наблюдалось увеличение S/N у макрофагальных предшественников, в то время как у гранулоцитарных оно уменьшилось в 4 раза до значений контроля (рисунок 46). В группе ВВ наблюдалось уменьшение S/N макрофагальных и гранулоцитарных КОЕ на фоне двукратного его увеличения у КОЕ-ГМ. В группе ВОВ S/N-отношение КОЕ-М увеличилось до уровня контроля, КОЕ-Г не изменилось и осталось ниже, чем в контроле. S/N-отношение КОЕ-ГМ увеличилось незначительно и осталось меньше чем в контроле. Этот анализ показал, что с увеличением числа колоний не происходит увеличения их размеров. Поэтому можно сделать вывод, что клоногенная активность клеток не всегда соответствует пролиферативной активности клеток, их образующих .

Рисунок 47. Соотношение площади колоний и их числа, образованных гемопоэтическими предшественниками костного мозга крыс после 30-ти суточного вывешивания и облучения и 2недельного периода реадаптации .

К – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

3.2.5. Пролиферативная активность стромальных предшественников костного мозга

Пролиферативная активность кариоцитов костного мозга крыс оценивалась по числу удвоений популяций клеток (PD). Анализ числа удвоений популяций показал, что изменения пролиферативной активности произошли только в группе В, где этот показатель был максимальным число удвоений популяций клеток было максимальным (рисунок 48А). Следует отметить тенденцию к снижению пролиферативной активности в группе комбинированного воздействия двух факторов (группа ОВ) .

Рисунок 48. Число удвоений популяций клеток (PD) в культуре костного мозга крыс линии Wistar. Данные представлены как M±m, p0,05, # –достоверное отличие значений в группах вывешивания до и после периода реадаптации

А) После 30-ти суточного вывешивания и облучения

Б) После периода 2-недельной реадаптации К, ВК – виварный контроль, В – вывешивание, О – облучение, ОВ – комбинированное действие облучения и вывешивания, ВВ – восстановление после вывешивания, ВО – восстановление после облучения, ВОВ – восстановление после комбинированного действия облучения и вывешивания .

Возможно, что вывешивание нарушает взаимодействие между стромальными и гемопоэтическими клетками (это предположение подтверждается данными по числу выделенных клеток и иммунофенотипирования), приводя к активации пролиферации стромальных клеток при вывешивании. В группе ОВ действие двух факторов приводило к незначительному снижению пролиферативной активности клеток костного мозга .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«ЮЖНО-УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ: Директор института Высшая школа экономики и управления _И. П. Савельева 24.06.2017 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА к ОП ВО от 03.11.2017 №007-03-1363 дисциплины Б.1.14 История таможе...»

«Будущее благодаря многолетнему опыту Rhepanol® fk Rhepanol fk на всех плоских кровлях мира как у себя дома КРАТКО Rhepanol fk – старейшая в мире синтетическая кровельная мембрана 50-летний опыт гидроизоляции на основе PIB свыше 95 млн. кв. метров уложенных кровель по всему миру стандарт по DIN EN 13956...»

«Problemy istorii, lologii, kul’tury Проблемы истории, филологии, культуры 2 (2016), 356–363 2 (2016), 356–363 © The Author(s) 2016 ©Автор(ы) 2016 ВАРИАТИВНОСТЬ СВЯЗИ "КУКЛА РОК" В ХУДОЖЕСТВЕННЫХ ТЕКСТАХ Н.М. Солнцева Московский государст...»

«ГБУЗ "ТОКБ им. В.Д. Бабенко" Иммунитетсамозащита организма. Иммунитет – это система биологических механизмов самозащиты организма, с помощью которых он распознает и уничтожает все чужеродное (генетически отличающееся от него), если оно проникает в орга...»

«Обратите внимание: данный документ предназначен для использования в качестве ресурса для ознакомления заявителей с образцами заявлений CLP. Окончательные заявления должны быть поданы на английском я...»

«НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2014. – Т. 23, № 4. – С. 61-75. УДК 597.6 (470.43) ОЧЕРК ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ЗЕМНОВОДНЫХ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ (ЧАСТЬ 2. 1991-2013 гг.) © 2014 А.И. Файзулин, И.В. Чихляев, А.Е. Кузовенко Поступила 17.05.2014 В сообщении пред...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра клеточной биологии и биоинженерии растений БАЛКОВСКАЯ Анна Владимировна СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ АСЕПТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР ТРУДНОРАЗМНОЖАЕМЫХ СОРТОВ КЛЕМАТИСОВ Аннотация к дипломной работе Научный руководитель: кандидат би...»

«Оценочный лист пояснительной записки творческого проекта lllрифТ _ Класс ~~ш ~ lZВ#fft? Тема проекта 9Шптza~.~4шJ ~ 11 k Кол-во По факту Критерии оценки проекта баллов I Общее оформление Качество исследования (акт...»

«Ненашева Татьяна Анатольевна Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток 03.00.13 физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург – 2008 Работа выполнена на кафедре физиологии челов...»

«2. Плодородие почв и применение удобрений 12. Подоляк, А.Г. Травосмеси на основе клевера в зоне радиоактивного загрязнения / А.Г. Подоляк, Т.В. Арастович // Белорусское сельское хозяйство. – 2005. – № 6(38). – С. 3638.13. Касьянчик, С.А. Урожай и содержание основных элементов питания в многолетних злаковых трава...»

«СОРОКИНА МАРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА И АПОПТОЗА И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОСОБЕННОСТЯМИ КЛИНИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ И ТЕЧЕНИЯ МИОМЫ МАТКИ 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: заслуженный...»

«Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН ЛАБОРАТОРНЫЕ МИНИАТЮРНЫЕ СИБИРСКИЕ СВИНЬИ как модельный объект в медико-биологических и биотехнологических исследованиях Уважаемые коллеги, В предлагаемом буклете размещены материалы по созданию и перспективам использования лабо...»

«117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, корп.6 Тел./факс +7 (495) 640-17-71 Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по России бесплатный) E-mail: hotline@dna-technology.ru, www.dna-technology.ru Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/08867 Комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА–НК/П...»

«УТВЕРЖДАЮ И.о. директора ИПР В.С. Рукавишников "" 2016 г. БАЗОВАЯ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ СИСТЕМНО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЗЕМЛЕУСТРОЙСТВА ТЕРРИТОРИИ Направление ООП 21.04.02 "Землеустройство и кадастры" Профиль подготовки "Управление земельными ресурсами" Квалификация (степень) Магистр Базовый учебны...»

«Памяти неизвестных героев века минувшего посвящается. Андреев Иван Тихонович Г. В. Фуфыгина (Смышляева) А. Н. Фуфыгин Составляя родословную фамилии СМЫШЛЯЕВЫХ (см. Кольский родословец №№ 1-3), много времени пришлось провести в музеях и архивах Хабаровско...»

«МИОЛОГИЯ – УЧЕНИЕ О МЫШЦАХ При изучении миологии необходимо постоянно обращаться к предыдущим разделам анатомии – остеологии и артросиндесмологии . При этом рекомендуется повторять костные образова...»

«Самарская Лука. 2008. – Т. 17, № 3(25). – С. 650-000. © 2008 А.Н. Дзюбан, Л.А. Выхристюк, Е.П. Романова НИНА НИКОЛАЕВНА ГУСЕВА (1913-1995) Dzuban A.N., Vychristuk L.A., Romanova E.P. Nina Nikolaevna Guseva (19...»

«Охрана традиционных знаний: проекты статей Rev. 2 (23 сентября 2016 г.) ПРЕАМБУЛА/ВВЕДЕНИЕ Признание ценности (i) признание [целостного] [специфического] характера традиционных знаний и их [непреходящей] ценности, включая их социальную, духовную, [экономическую], интеллектуальную, научную, экологическую, техническую, [коммерческую],...»

«Издание второе дополненное Е.Н.Аитова, кандидат биологических наук И.А.Рудаков, доктор медицинских наук РУКОВОДСТВОБИБЛИОТЕКА ДИСТРИБЬЮТОРА ПО ПРИМЕНЕНИЮ ПРОДУКЦИИ СПРАВОЧНИК ПО ПРОДУКЦИИ ANTI-AGE. CРЕДСТВА ПРОТИВ СТАРЕНИЯ КОЖИ Старение организма и старение кожи – одна из главных проблем медицины и косметологии. Это и...»

«САНКТ-ПЕТЕРБУРГ СКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ОЛИМПИАДА ШКОЛЬНИКОВ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Общеобразовательный предмет/комплекс предметов: Биология 2010-2011 учебный год В...»

«ДЯЧУК Вячеслав Алексеевич МИОГЕННАЯ И НЕЙРОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК ЛИЧИНОК МИДИИ MYTILUS TROSSULUS IN VIVO И IN VITRO 03.00.30 – биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2008 Работа выполнена...»

«"Согласовано" Президент Российского общества фтизиатров, главный внештатный специалист-фтизиатр Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор, д. м. н. _ И. А. Васильева 3 октяб...»

«УДК 582.26(571.56) ГИДРОФИТЫ И ВИДОВОЙ СОСТАВ ЭПИФИТОНА ОЗЕРА ЧОНО (БАССЕЙН РЕКИ ЯНА) Копырина Л.И. ФГБУН "Институт биологических проблем криолитозоны" СО РАН, Якутск, e-mail: l.i.kopyrina@mail...»

«УДК 616.8 А.Ф. Кононов, Г.А.Переяслов, Б.И. Хлабустин ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ АППАРАТНО-ПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА "МИОКОМ"В статье описываются назначение, функциональные возможности и основные области применения аппаратно – программного комплекса (АПК) "МИОКОМ". В частности описаны критерии, определившие структурну...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.