WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 


«ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Направление: 020400.68 – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Магистерская диссертация ВЛИ Я Н И Е О ...»

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Направление: 020400.68 – биология

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Магистерская диссертация

ВЛИ Я Н И Е О КСИ Д А АЗО ТА ( I I ) Н А ФУН К Ц И О Н А Л Ь Н О Е

С О С ТОЯН И Е Н Е Й Р О - М О ТО Р Н О ГО АПП А РАТА

И К Р О Н ОЖН О Й М Ы Ш Ц Ы К Р Ы С Ы

Работа завершена:

"___"_________ 201_ г. ____________________ (О.А. Ярандаева)

Работа допущена к защите:

Научный руководитель к.б.н., доцент "___"_________ 201_ г. ____________________ (А.А. Еремеев) Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"_________ 201_ г. ____________________ (Г.Ф. Ситдикова) Казань–2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1 Физиологическая роль оксида азота (II) 9

1.2 Предполагаемые механизмы физиологического действия NO 16



1.3 Роль оксида азота в развитии патологических состояний 23

1.4 Электромиография, как метод исследования функционального состояния двигательных систем 26 1.4.1 Вызванные электрические ответы мышцы и их характеристики 30

1.5 Транскраниальная магнитная стимуляция 37

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40

2.1. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

2.2 Результаты исследований и их обсуждение 42 2.2.1 Влияние физиологического раствора на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва 2.2.2 Влияние нитропруссида натрия на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва 2.2.3 Влияние L-Name на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва 2.2.4 Влияние нитропруссида натрия на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией эфферентных путей спинного мозга 2.2.5 Влияние L-Name на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией эфферентных путей спинного мозга

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НМДА – рецептор – рецептор, связывающий N-метил-D-аспартат НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат ЭНМГ - электронейромиография ВП - вызванный потенциал ПД – потенциал действия СПИ - скорость проведения импульса ДЕ - двигательная единица МН – мотонейрон ТМС – транскраниальная магнитная стимуляция ВМП – вызванный моторный потенциал ЦВМП – центральное время моторного проведения ВМО – вызванный моторный ответ цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат цАМФ – циклический аденозинмонофосфат ГЦ (GC) – гуанилатциклаза ГАМК – гамма – аминомасляная кислота АХ – ацетилхолин ЦНС - центральная нервная система ПНС – периферическая нервная система ГМК – гладкомышечные клетки НПС – нижний пищеводный сфинктер ГМ НПС – гладкие мышцы нижнего пищеводного сфинктера ЖКТ – желудочно-кишечный тракт НСТ – нитросиний тетразолий ТЭА – тетраэтиламмоний ЧСС – частота сердечных сокращений АТФ - аденозинтрифосфат КАТФ – АТФ - чувствительные калиевые каналы АФК - активная форма кислорода RNOS – активные формы оксида азота LTP (long-term potentiation) – долговременная потенциация .





ВВЕДЕНИЕ

Оксид азота (II) (монооксид азота, NO) - газ, хорошо известный химикам и физикам, в последнее время привлек пристальное внимание биологов и медиков. Он осуществляет как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических функций [Ignarro, 1999; Baranano et al., 2001; Boehning, Snyder, 2003]. Впервые оксид азота (II) был идентифицирован как эндотелиальный фактор расслабления сосудов и медиатор бактерицидного действия макрофагов. Впоследствии было обнаружено, что глутамат, действуя на НМДА-рецепторы в центральной нервной системе, вызывает высвобождение химического агента, свойства которого сходны со свойствами эндотелиального фактора расслабления сосудов, и были получены доказательства нейрональной роли NO. Спустя несколько лет было показано, что NO модулирует освобождение медиаторов в центральной и периферической нервной системе в условиях как in vitro, так и in vivo .

NO образуется в результате окисления аминокислоты L-аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты L-цитруллина под влиянием фермента NO-синтазы в присутствии О2 и НАДФН. В настоящее время известно, что NO-синтаза представляет собой не один фермент, а семейство или группу ферментов (KФ 1.14.13.39), способных образовывать NO .

Синтезировать и выделять NO способны большинство клеток человека и животных, однако, наиболее изучены три клеточных популяции NO-синтаз:

эндотелия кровеносных сосудов, клеток нервной ткани и макрофагов. В связи с этим традиционно выделяют три типа NO-синтаз по уровню экспрессии в клетках, кодируемые различными генами: нейрональный (nNO-синтазы), эндотелиальный (eNO-синтазы) и макрофагальный (iNO-синтазы) типы .

Первые две формы являются Ca2+-зависимыми и постоянно вырабатываются в нейронах и в сосудах, соответственно, тогда как iNOS является индуцибельной формой и выделяется в ответ на воздействие внешних факторов при воспалительных процессах [Urushitani, 2001] .

Оксид азота (II) оказывает физиологические эффекты практически во всех возбудимых тканях, а именно, регулирует секрецию медиатора в центральных и периферических синапсах, участвует в формировании памяти и поведения, модулирует сократимость скелетной, гладкой и сердечной мышц, регулирует частоту и силу сердечных сокращений. В основе ряда эффектов NO лежит его влияние на центральные и периферические синапсы, где он может оказывать как ингибирующее, так и активирующее действие [Bredt, Snyder 1992; Schuman, Madison 1994; Pan 1996; Mukhtarov et al, 1999, Зефиров с соавт., 1999] .

Изучена роль газа в модуляции нервно-мышечной передачи: в двигательных нервных окончаниях холоднокровных животных обнаружена тоническая регуляция освобождения ацетилхолина с помощью NO [Lindgren, Laird 1994; Зефиров, Халиуллина, 1999; Thomas, Robitaille, 2001; Wang et al., 1995; Etherinton, Everett, 2004]; в присутствие ингибиторов NO-синтазы происходило усиление выброса медиатора [Ribera et al, 1998]; в нервномышечном синапсе теплокровных NO играет роль ретроградного мессенджера, регулирующего неквантовый выход ацетилхолина .

Оксид азота сам по себе не является токсичным и в нормальных условиях имеет свойство расширять сосуды. Однако при реакции NO с О 2 образуется сильнейший оксидант, пероксинитрит (ONOO-), который окисляет липиды, белки и ДНК. Именно эта реакция является причиной токсичного действия оксида азота при повреждении спинного мозга. Доказано, что после травмы спинного мозга в близлежащих тканях происходит существенное повышение концентрации NO [Soy, 2004] .

Целью настоящего исследования было изучение функционального состояния нейро-моторной системы икроножной мышцы крысы в условиях блокирования эндогенного синтеза и спинального субдурального введения донора оксида азота (II) .

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1). Изучить электромиографические характеристики икроножной мышцы крысы при спинальном субдуральном введении физиологического раствора .

2). Оценить влияние спинального субдурального введения водного раствора нитропруссида натрия (SNP) на параметры моторных (М-) ответов икроножной мышцы крысы .

3). Исследовать возбудимость спинальных двигательных центров икроножной мышцы крысы в условиях спинального субдурального введения водного раствора нитропруссида натрия (SNP) .

4). Оценить влияние спинального субдурального введения раствора LName на электромиографические параметры икроножной мышцы крысы .

5). Провести исследование ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией, в условиях введения источника экзогенного оксида азота (II) – нитропруссида натрия (SNP) .

6). Исследовать изменение ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией, при введении неспецифического блокатора NO-синтазы L-Name .

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физиологическая роль оксида азота (II) Оксид азота (NO) - газообразный посредник, участвует в функционировании разнообразных систем организма. Нейромедиаторная сущность NO заключается в том, что он синтезируется при возбуждении нейрона (в ответ на поступление ионов кальция) и, диффундируя в соседние клетки, активизирует в них образование цГМФ, способного влиять на проводимость ионных каналов и, таким образом, изменять электрогенез нейронов. NO отличается от традиционных нейромедиаторов тем, что он оказывает воздействие на ионные каналы не через плазмалеммальные рецепторы, а изнутри, со стороны цитоплазмы. Кроме того, действие NO не ограничивается только областью синаптических контактов, газ может влиять на ионные каналы на значительной площади плазматической мембраны нейрона [Alderton, 2001] .

Участие NO в синаптической пластичности наиболее ярко проявляется в таких процессах, как длительная синаптическая потенциация (повышение эффективности проведения возбуждения через синапс для каждого последующего импульса в их последовательности), более детально проанализированная в гиппокампе, и длительная синаптическая депрессия (снижение эффективности проведения возбуждения через синапс), лучше исследованная - в коре мозжечка [Esplugues, 2002] .

В первом случае возбуждение постсинаптического окончания приводит к повышению внутриклеточного уровня Са2+/кальмодулина, активирующих NO-синтазу и образование NO. NO, диффундируя в пресинаптическое окончание, вызывает образование цГМФ, что приводит к усилению и увеличению длительности выделения из пресинапса нейромедиатора, который, в свою очередь, оказывает возбуждающее действие на постсинаптический нейрон и таким образом возникает обратная положительная связь с постоянным усилением [Bult, 1990]. Такому механизму особое внимание уделяется в синапсах с наиболее распространенным и сильным возбуждающим нейромедиатором ЦНС глутаматом и особому глутаматному рецептору — НМДА - рецептору, являющемуся трансмембранным каналом для ионов кальция .

С длительной синаптической потенциацией, прежде всего в гиппокампе, связывают пластичность межнейронных связей, лежащих в основе памяти. Такое предположение основывается на ставших уже классическими представлениях Д. Хэбба (1949) о повышении эффективности синаптической передачи при возбужденном состоянии постсинаптического нейрона. Физиологические наблюдения об участии NO в процессах памяти и обучения противоречивы. Наряду с работами, в которых показано нарушение процессов обучения у экспериментальных животных при введении ингибиторов NO - синтазы, имеются и исследования с противоположными результатами. Неоднозначность получаемых результатов, возможно, связана с тем, что вводимые в организм ингибиторы NO - синтазы оказывали действие не только на всю нервную систему, но и на все органы и ткани животных, что не позволяло достичь локального влияния на продукцию NO в мозге [Calabrese, 2007] .

Нахождение животных (крыс) в обогащенной внешней среде (лабиринт, новая обстановка) приводит к увеличению числа нейронов, содержащих NOсинтазу во многих отделах головного мозга, причем предварительное введение ингибиторов NO-синтазы и НМДА-рецепторов приводило как к снижению активности NO-синтазы в нейронах, так и к нарушению процессов обучения [Thomas, 2001] .

В переживающих (живущих некоторое время в условиях культуры тканей) срезах головного мозга был показан и другой механизм действия NO на пресинаптические окончания. NO способен инициировать выделение нейромедиатора дофамина из нейронов не посредством экзоцитоза (обычный способ выделения нейромедиаторов с участием синаптических пузырьков), а путем трансмембранной диффузии при участии особого мембранного переносчика дофамина, участвующего в его захвате из межклеточной среды [Schuman, 1994]. В этом процессе не участвует цГМФ и предполагается прямое влияние NO на транспортные белки мембран .

В основе первого положения NO-гипотезы лежит возможность образования NO в постсинаптическом окончании при его возбуждении и влияние газа на пресинаптический аксон. Однако за счет диффузии к соседним нервным клеткам NO может оказывать влияние не только на пресинаптическое расширение аксона, формирующего синапс на этом постсинаптическом окончании, но и на близлежащие аксоны и дендриты, модулируя их активность [Archer, 1990]. Традиционная формулировка положения об участии NO в межнейронной коммуникации ограничивается обычно возможностью синтеза и выделения NO из локальной области нейрона — постсинаптического окончания. Однако, как показывают результаты свето- и электронно-микроскопических исследований, NOсинтаза определяется во всем объеме тела нейронов — в перикарионе, аксоне и дендритах. Поскольку при возбуждении нейрона по всей длине его отростков и в теле уровень кальция циклически колеблется (образуются своеобразные кальциевые волны), можно считать, что синтез и выделение NO могут инициироваться в любом участке тела и отростков нейронов. Таким образом, нейроны, содержащие NO-синтазу, способны создавать вокруг себя поле воздействия, то есть могут считаться своеобразными полевыми нейронами в отличие от традиционных нейронов, связанных друг с другом в локальных участках — синапсах [Зефиров, 1999] .

Основное внимание в процессах синаптической пластичности уделяется, конечно, нейронам, однако нельзя не учитывать и роль глии .

Известно, что астроциты способны продуцировать NO, причем они обладают как конститутивной (в небольшом количестве), так и индуцибельной NOсинтазой. Если принять во внимание, что число астроцитов в 10—100 раз превосходит (в зависимости от области мозга) количество нейронов, то их роль в продукции NO и влиянии на механизмы электрогенеза нейронов может является весьма значимой [Галаган, 1991] .

Значение астроцитов как источника NO особенно ярко проявляется при патологии ЦНС. При многих нейродегенеративных заболеваниях, ишемии, травмах, опухолях головного мозга астроциты начинают экспрессировать NO-синтазу и продуцировать большой объем NO. С этим связывают гибель нейронов и других макроглиальных клеток, в частности одигодендроцитов [Prast, 2001] .

NO свободно диффундирует через клеточные мембраны и синтезируется группой ферментов, известных как синтазы оксида азота (NOS), из L-аргинина и различных кофакторов, в зависимости от типа клеток .

Три типа NOS ферментов были выявлены у млекопитающих, они названы согласно тем типам клеток, где они были впервые обнаружены: нейрональная NOS (nNOS), эндотелиальная NOS (eNOS) и индуцибельная NOS (iNOS), которые имеют различные функциональные и структурные особенности [Salapatek, 1998]. Изоформы NOS являются продуктами различных генов. Ген первой из них расположен в 7-й, второй - в 12-й и третий - в 17-й хромосомах. Активность nNOS (также известной как тип I) и eNOS (тип III) контролируется Са2+- кальмодулином и экспрессируется в мозге. Ферменты существенно инактивируются при низких концентрациях свободного кальция и максимально активен при его содержании около 1 мМ. Экспрессия iNOS (тип II) всегда активна и не зависит от уровня внутриклеточного Ca2+, и экспрессируется в ответ на воспалительные и противовоспалительные посредники, действующие на макрофаги, астроциты и микроглию. Хотя традиционно с нитро - передачей в мозге связывали только nNOS, но было показано, что eNOS также вносит свой вклад в реализацию физиологического действия NO в паренхиме мозга. NO очень стабильна в низких, физиологических концентрациях и производится стехиометрически после преобразования из L-аргинина в цитруллин в процессе, требующем НАДФН и O2 в качестве одного из субстратов, а также другие кофакторы [Wang, 2004] .

Что касается особенностей локализации, то nNOS, как было установлено, в большом количестве присутствует в нейронах, эндотелиальных клетках, в том числе эндотелии эфферентной артериолы почек, в тромбоцитах, macula densa, в незначительном количестве в толстой восходящей части петли Генле и других тубулярных сегментах и, возможно, в нисходящей vasa recta, а также в мозговом слое надпочечников, скелетных мышцах и др.. eNOS локализуется в больших количествах в эндотелии и, в частности, в тромбоцитах, интерлобулярной и афферентной артериолах, эфферентной артериоле, возможно, в нисходящей vasa recta, а также в гломерулах, мезангиальных клетках и др. .

Полезно разделять химические реакции, в которых оксид азота принимает участие прямо или косвенно. Прямая связь между низкими концентрациями NO и железосодержащих белков, таких как гуанилатциклазы (GC), и обуславливает большую часть физиологического действия NO [Ситдикова, 2006]. Непрямые реакции, наоборот, возникают в присутствии высоких концентраций NO и их результатом являются соединения активной формы оксида азота (RNOS) с активной формой кислорода (АФК), такое как мощный окислитель пероксинитрит (ONOO-), что может привести к вредному воздействию на клетки, из-за нитрозативного окислительного стресса. Это противоположное действие оксида азота, может нести как защитные, так и пагубные последствия для головного мозга, и в основном зависит от его концентрации и вида действующей ферментативной изоформы [Зефиров, 1999]. Клеточная сигнальная активность возможна только при низкой концентрации NO, синтезированного nNOS и eNOS. Высокая концентрация NO, синтезированного iNOS ответственна за увеличение количества соединения RNOS и АФК. Токсические эффекты NO в основном опосредованы его продуктами окисления, в частности, биологическим окислителем пероксинитритом. Мыши, лишенные гена, ответственного за синтез iNOS, например, в меньшей степени подвержены ишемическому повреждению мозга. Окислительный стресс является общей чертой патогенеза многих нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, и Хантингтона [Aley, 1998] .

Синтез пероксинитрита был выделен в качестве важного патогенного механизма, ответственного за эти нарушения. Интересно, что нейроны, которые выделяют nNOS, как известно, устойчивы для многих видов травм, в том числе к интоксикации тяжелыми металлами и к NO-индуцированной нейротоксичности. В периферической нервной системе (ПНС), NO индуцирует расслабление гладких мышечных клеток в желудочно-кишечном тракте и пещеристых тел [Земляков, 1985]. NOS физиологически активна в наномолярных концентрациях и стабильна в этом диапазоне. После синтеза NO может действовать на постсинаптические и пресинаптические структуры путем трансдукции GC, что в конечном итоге увеличивает внутриклеточный уровень вторичного мессенджера циклического гуанозинмонофосфат (цГМФ) [Anderson,1992]. Есть предположения, что NO может действовать и через другие механизмы трансдукции. NO обладает и другими важными функциями в нормальном мозге: регулирование потока крови, нейрогенеза и синаптической пластичности. Это также связано с долговременной потенциацией (LTP) синаптических соединений и может действовать в качестве антиапоптозного фактора в нормальной концентрации. После травмы мозга наоборот NO действует как нейродегенеративный агент, способствуя гибели нейронов. Несколько нейродегенеративных расстройств ЦНС связаны с чрезмерной активацией НМДА - рецепторов, в том числе инсульт и боковой амиотрофический склероз. Так как активация НМДА рецепторов является первичным стимулом для синтеза NO, предполагается, что он может играть определенную роль в НМДА - опосредованной нейродегенерации. Это было подтверждено в исследованиях на nNOS нокаутных мышах, которые устойчивы к эксайтотоксичности после острого ишемического повреждения [Daniel, 2000]. Все три типа NOS зависят от NADPH,который выступает в качестве кофактора для их деятельности .

Любой фермент НАДФН-D семейства катализирует перенос электронов от НАДФН в бесцветные соли нитросинего тетразолия (НСТ), который становится цветным, нерастворимым в воде красителем формазан, который виден через световой микроскоп. В нефиксированной ткани многие ферменты показывают НАДФН-активность, но было показано, что в фиксированной ткани большинство этих ферментов инактивированы и только ферменты из семейства NOS сохраняют свою НАДФН активность [Dawson, 1991] .

Соответственно, НАДФН-D был широко использован для обнаружения NOS активности в альдегид-фиксированных тканях, как в нормальных, так и в измененных структурах ЦНС, открыв два различных типа непирамидальных клеток: более реактивная группа, «гольджиподобные»

(клетки типа I) и маленькие и менее реактивные популяции (клетки типа II) .

Оба локализованы совместно с ГАМК в нейронах коры. Нейроны I типа имеют большие, темно окрашенные клеточные тела и дендриты, присутствуют в мозгу у всех млекопитающих, от однопроходных до приматов. Нейроны II типа, наоборот, слабо окрашенные, с маленькими клеточными телами, практически не участвуют в процессах, и, как сообщается, особенно многочисленны в мозге приматов. Обе группы клеток представляют собой важный источник NO в ЦНС [Schuman, 1994] .

Распределение НАДФН-D нейронов уже были описаны в ЦНС из нескольких отрядов млекопитающих. В мозге крысы, например, было показано, что НАДФН-D нейроны составляют примерно 2% от всей популяции клеток коры. НАДФН-d/NOS нейроны также обнаружены в спинном мозге, главным образом в поверхностных пластинках [Cassina, 2002] .

1.2 Предполагаемые механизмы физиологического действия оксида азота (II) Низкомолекулярный газ NO легко проникаeт через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, однако время его полужизни (в среднем не более 5 с) и расстояние возможной диффузии (небольшое, в среднем 30 мкм) ограничиваются высокой реакционной способностью молекулы и ее взаимодействием со многими возможными субстратами. Среди последних следует отметить гемоглобин, к гемовой группе которого NO имеет очень высокое сродство [Ситдикова, 2006] .

По своей химической природе NO относится к двухатомным нейтральным молекулам. Молекула NO парамагнитна. Она содержит нечетное число электронов, один из которых имеет неспаренный спин, что придает молекуле NO высокую реакционную способность. Взаимодействуя с другими свободными радикалами, NO образует ковалентные связи. Благодаря этой способности он может как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их. Молекула NO липофильна и поэтому легко проникает через клеточную мембрану, среднее время жизни молекулы биологических тканях составляет примерно 5.6 с [Зефиров, 1999] .

Действие, оказываемое NO на клетки, во многом зависит от количества газа. В небольших количествах, продуцирующихся обычно конститутивными формами NO - синтазы, эффект NO в основном связан с влиянием на гемовую группу растворимой (цитозольной) формы гуанилатциклазы .

Активированный фермент синтезирует циклический гуанозин монофосфат (цГМФ) - активный внутриклеточный посредник, регулирующий работу мембранных ионных каналов, процессы фосфорилирования белков (через протеинкиназы), активность фосфодиэстеразы, а также другие реакции [Lukas, 2000] .

Хотя эндотолиальная NO-синтаза является мембранно-связанной, а нейрональная - цитозольной, механизм их действия сходен и состоит в следующем. Ca2+ под влиянием определенных стимулов (ацетилхолин, гистамин, 5-оксиптриптамин, глутамат и др.) входит в клетку, где связывается в единый комплекс с кальмодулином в цитозоле. Комплекс Ca-кальмодулин выступает как кофактор и активирует NOS [Looms et al., 2001]. Под влиянием ингредиентной NOS образуются очень малые количества NO, которые измеряются пикомолями, но, продуцируемый под влиянием этих изоформ NOS осуществляет, главным образом, местную регуляцию, действуя в стандартных условиях. NO активирует клеточный фермент гуанилатциклаза (ГЦ), что приводит к образованию циклического гуанозина монофосфата (цГМФ), который и опосредует все эффекты NO. Будучи липофильной молекулой, NO легко диффундирует через клеточные мембраны и проникает в соседние клетки (например, из эндотелиальных в миоциты сосудов), где образующийся цГМФ снижает уровень свободного Ca и активирует киназу легкой цепи миозина, вызывая дилатацию сосудов [Shi et al., 1998] .

Следует отметить еще одно интересное наблюдение, связанное с нейронами, содержащими NO-синтазу, и не получившее пока полного объяснения. Еще в 60-х годах Е. Томас и Э. Пирс (1968) использовали новый гистохимический метод выявления активности фермента НАДФН-диафоразы (фермент, способный восстанавливать окисленную форму НАДФ) для анализа нервной системы и показали, что в разных отделах головного мозга имеются единичные нейроны с интенсивной положительной реакцией. Эти нейроны, которые получили название "одиночные активные клетки", остаются неповрежденными при разнообразной патологии нервной системы, в то время как большинство других клеток погибает. Относительно недавно выяснилось, что НАДФН-диафоразная активность свойственна NO-синтазе (НАДФН-диафоразная активность широко используется в настоящее время для гистохимической идентификации клеток, содержащих NO-синтазу, хотя НАДФН-диафораза и NO-синтаза — разные ферменты и их распределение в клетках мозга не всегда совпадает), и, таким образом, была установлена устойчивость нейронов, содержащих NO-синтазу, к разнообразным патологическим воздействия [Bishop, 2005]. Механизмы такого необычного и имеющего большое биологическое значение свойства клеток окончательно не выяснены .

Остается невыясненным и вопрос о том, почему большие дозы синтезированного газа не оказывают токсического влияния на клетки, в которых они образуются. Одним из возможных объяснений может быть то, что в нейронах, содержащих NO - синтазу, определяется высокая активность фермента супероксиддисмутазы, катализирующей распад токсических радикалов и защищающей, таким образом, клетку от их губительного действия [Brenman, 1996] .

Способность экзогенного оксида азота (NO) активировать калиевые токи нервных мембран показана сравнительно недавно. В частности, в работе А.Л. Зефирова с соавт., (1999) установлено, что NO приводит к увеличению выходящего потенциал-зависимого калиевого тока мембраны нервного окончания, что в последующем было подтверждено А.Л. Зефировым с соавт., (2001) и А.В. Яковлевым (2004). В работе А.Л. Зефирова с соавт., (2001), показано, что NO приводит к укорочению длительности потенциала действия (ПД) и уменьшению амплитуды следовой деполяризации (СД) миелинизированных нервных волокон. Авторы связывают этот феномен с увеличением потенциал - зависимых калиевых токов нодальной мембраны [Зефиров с соавт., 2001] .

Биологическая активность NO стимулируется некоторыми агонистами, включая L-аргинин, АХ, брадикинин и др. Но синтез NO является регулируемым процессом и может тормозиться различными аналогами Lаргинина, которые являются конкурентными ингибиторами NOS. При этом N-омега-циклопорил-L-аргинин является селективным ингибитором cNOS, в то время как аминогуанидин - iNOS. Некоторые другие аналоги L-аргинина, такие как N-монометил-L-аргинин (L-NMMA), N-нитро-Lаргининметиловый эфир (L-NAME), N-нитро-L-аргинин (L-NNA) способны тормозить выработку NO обоими ферментами. Выработка NO может также замедляться или прекращаться под влиянием гемопротеинов, метиленового голубого, супероксид радикалов, этанола, глюкокортикостероидов, индометацина .

Особое значение в рассмотрении физиологической роли NO имеет вопрос регуляции активности NO-синтазы. Конститутивные (ингредиентные) формы NOS (eNOS и nNOS) регулируются уровнем внутриклеточного Ca .

Внеклеточные гормоны и другие агенты, взаимодействуя с поверхностными клеточными рецепторами, открывают кальциевые каналы, и Ca проникает внутрь, где в комплексе с кальмодулином активирует NOS. Связанный с NOS кальмодулин способствует передаче электрона с НАДФ-Н на флавопротеиновый домен NOS и далее с флавина на гемовый домен NOS .

Этот электрон необходим для активации железа гемового домена, после чего железо связывает кислород, который реагирует с L-аргинином с образованием NO и цитруллина. Очевидно, что наличие всех перечисленных компонентов, также как и их недостаточность, важны для регуляции синтеза NO конститутивными формами NOS .

Нитропруссид натрия, являясь донором NO, вызывает снижение тонуса и вызванной сократительной активности гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера (ГМ НПС) так же, как и в других гладкомышечных структурах ЖКТ и сосудов. При этом дозозависимое ингибирование нитропруссида натрия сократительной активности ГМ НПС, по литературным данным, обусловлено снижением уровня цитозольного кальция и изменением калиевой проводимости мембраны [Daniel, Lukas, 2000] .

Были проведены исследования роли оксида азота в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток. Тонус сосудистых гладких мышц поддерживается многими регуляторными факторами, реализующими свой эффект через системы внутриклеточной сигнализации .

Передача информации от рецепторов плазматической мембраны к исполнительным системам осуществляется с помощью сигнальных молекул — вторичных посредников, основными из которых в гладкомышечных клетках (ГМК) являются ионы кальция и циклические нуклеотиды (циклический гуанинмонофосфат (цГМФ) и циклический аденозинмонофосфат (цАМФ)) [Esplugues, 2002]. В процессах взаимоотношения этих сигнальных систем особое значение занимает оксид азота NO. Методом двойного сахарозного мостика были проведены исследования электрической и сократительной активности гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера (НПС) при действии нитропруссида натрия .

Оценено действие донора оксида азота NO на калиевую и кальциевую проводимость мембраны, роль внутриклеточной NO-синтазы. Наблюдалась гиперполяризация мембран и снижение сократительной активности при применении нитропруссида натрия и L-NAME. Сделан вывод о действии NO на калиевую проводимость мембран, а также о возможном действии на сократительные белки и активацию цАМФ- зависимого пути регуляции физиологических функций гладкомышечной клетки (ГМК) НПС [Земляков, 1985] .

Сфинктеры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеют ряд существенных особенностей в регуляции их тонуса со стороны нервной и гуморальной систем организма. В настоящее время весьма интенсивно проводятся исследования по изучению влияния оксида азота (NO) на моторную функцию ЖКТ. Считается, что NO является одним из нейротрансмиттеров неадренергической — нехолинергической природы .

Одним из отделов ЖКТ, в регуляции работы которого важнейшую роль играет NO, является нижний пищеводный сфинктер (НПС) [Abdel-Latif,2001, Lukas, 2000]. Кроме NO, выделяемого нервными окончаниями, в мембране гладкомышечной клетки (ГМК) НПС найдена собственная NO-синтаза, имеющая структурные отличия от NO-синтазы нервных окончаний .

Связанная с мембраной NO-синтаза является Са2+-зависимой и участвует в регуляции мышечного тонуса НПС [Salapatek, 1998]. Считается, что увеличение концентрации оксида азота, вызванного добавлением в омывающий раствор нитропруссида натрия, приводит к активации цитозольной растворимой формы гуанилатциклазы. Повышение внутриклеточной концентрации цГМФ и активация соответствующих протеинкиназ снижает уровень цитозольного кальция Са2+,i в ГМК [Lukas, 2000], снижая его вход через потенциал-зависимые и хемочувствительные каналы, а также стимулируя его удаление наружу и депонирование в саркоплазматический ретикулум. Понижение уровня цитозольного кальция, в свою очередь, приводит к снижению тонического напряжения и силы вызванных сокращений гладкой мускулатуры [И. Ю. Земляков, 1985, В. Ф .

Байтингер, 1994]. Эндогенный NO, активируя растворимую гуанилатциклазу, оказывает свое влияние на К+-каналы посредством цГМФ-зависимых и цГМФ-независимых путей регуляции [Salapatek, 1998]. Большинство из имеющихся в литературе данных получены в исследованиях, проведенных на сосудистых ГМК и отдельных структурах ЖКТ. При этом ряд особенностей действия NO на ГМК НПС остаются до конца не изученными. Цель настоящего исследования — выявление некоторых особенностей регуляции параметров электрической и сократительной активности НПС оксидом азота .

Электрическая активность гладкомышечных препаратов характеризовалась стабильным уровнем мембранного потенциала покоя .

Препараты имели значительный исходный тонус, который изменялся нерегулярным образом около некоторых средних значений, служивших изолиниями для оценки тонических реакций. Раздражение препаратов импульсами электрического тока прямоугольной формы длительностью 5 с различной полярности приводило к возникновению электротонических потенциалов и развитию сократительных ответов. Действие деполяризующих импульсов тока любой амплитуды не приводило к генерации пиковых потенциалов действия, однако сопровождалось сократительной реакцией [Barone, 2000] .

Также были проведены опыты с применением тетраэтиламмония .

Действие ТЭА характеризовалось стойкой деполяризацией мембраны ГМК и ростом ее сопротивления. На фоне действия ТЭА применение нитропруссида натрия приводило к снижению сопротивления мембраны ГМК .

Тетраэтиламмоний подавляет основные виды калиевой проводимости мембраны ГМК [Daniel, 2000]. При действии нитропруссида натрия на фоне ТЭА наблюдается менее выраженная гиперполяризация мембраны а также более быстрое восстановление вызванной сократительной активности. Одной из причин возникающей гиперполяризации при действии нитропруссида натрия является повышение калиевой проводимости мембраны, но также нельзя исключить, что наблюдаемая гиперполяризация мембраны обусловлена снижением кальциевой проводимости [Lukas, 2000] .

Регуляторные эффекты NO на параметры электрической и сократительной активности ГМ НПС обусловлены не только изменением концентрации цитозольного кальция, но и увеличением калиевой проводимости мембран, о чем свидетельствует снижение сопротивления мембран. Также возможно непосредственное действие NO на сократительные белки ГМК .

Также было установлено влияние NO на различные функции млекопитающих и земноводных [Archer, 1990], в том числе и на хронотропную функцию сердца. NO, подобно активации КАТФ каналов, подавляет активность симпатических нервов в сердце и, вероятно, это один из путей его влияния на ЧСС. Очевидно, доноры NO оказывают влияние и на клетки проводящей системы сердца, увеличивая время предсердножелудочкового проведения возбуждения .

Кардиодепрессивное действие эндогенного NO может играть роль при определенных формах сердечной недостаточности [Lass, 2002]. Одним из механизмов отрицательного хронотропного действия NO является увеличение образования цГМФ. Показано, что внутриклеточное увеличение цГМФ экзогенным и эндогенным NO уменьшает частоту сокращений сердца у новорожденной крысы и мыши .

1.3 Влияние оксида азота (II) на развитие патологических состояний Результаты последних исследований позволили предположить, что активация NO-синтазы может выполнять не только положительную роль, но и оказывать повреждающее действие на клетки. Это связано с разнонаправленным действием механизмов, опосредующих эффекты NO, в результате чего ответ клетки на один и тот же стимул может быть существенно разным [Серая, 2002] .

Примерами токсического действия NO являются основные нейродегенеративные заболевания ЦНС, такие как ишемический инсульт, эпилепсия и другие судорожные расстройства, болезни Паркинсона и Альцгеймера, боковой ангиотрофический склероз и т.д. В основе развития этих расстройств лежит избыточная продукция оксида азота в результате гиперактивации глутаматных рецепторов НМДА-подтипа, ведущей к повышению содержания внутриклеточного кальция и активации NO-синтазы .

Также выявлено участие оксида азота в развитии инсулинозависимого диабета, при этом непосредственной мишенью действия NO и других свободных радикалов является ДНК -клеток островков Лангерганса .

Избыточная продукция NO индуцибельной формой NO-синтазы – важное звено в патогенезе острой недостаточности кровообращения при тепловом, кардиогенном, септическом и других видах шока .

В больших же концентрациях, образующихся, как правило, индуцибельной изоформой NO-синтазы, NO может оказывать на клетки токсический эффект, связанный как с прямым действием на железосодержащие ферменты, так и с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободноради-кального соединения пероксинитрита. Пероксинитрит (ONOO") образуется при взаимодействии

NO с радикальным супероксид анионом (Оi):

NO + Oi = ONOOТоксический эффект NO проявляется прежде всего в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ, а также ферментов, участвующих в репликации ДНК. Кроме того, NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли (АДФ - рибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели. Повреждение ДНК под влиянием NO является одной из причин развития апоптоза, особого вида клеточной смерти, регулирующейся геномом клетки .

Остается не выясненным вопрос о том, почему большие дозы синтезированного газа не оказывают токсического воздействия на клетки, в которых они образуются. Одним из возможных объяснений такого парадокса может быть то, что в нейронах, содержащих NO-синтазу, определяется высокая активность фермента супероксиддисмутазы, катализирующей распад токсических радикалов и защищающей клетку от губительного действия .

В то же время, действие ряда факторов (липопротеины низкой плотности, высокие концентрации глюкозы и ишемия) может вызывать снижение продукции NO как за счет ингибирования NO-синтаз, так и за счет снижения их экспрессии. При этом низкий уровень оксида азота приводит к повышению тонуса сосудов, свертываемости крови и снижению иммунитета, тем самым способствуя развитию гипертензии, атеросклероза, тромбозов, ишемической болезни сердца, инфекционных заболеваний и опухолевого роста .

Учёные продемонстрировали, что при блокировании синтеза NO на фоне получения L-Name у животных развивается выраженная артериальная гипертензия (стойкое повышение артериального давления). Однако животные, которым вводили не только L-Name, но и макролидные антибиотики, не продемонстрировали развития гипертензии. Ряд тестов, направленных на оценку функционального состояния сердечно-сосудистой системы (например, нагрузочные пробы), показал, что антибиотики макролидного ряда обладающие прямым терапевтическим эффектом за счёт прямых противовоспалительных, антиоксидантных, иммуномодуляторных и антитромботических свойств, практически полностью предотвращают негативные эффекты L-Name. [Черноморцева с соавт., 2010] .

Вещество L-Name также имеет и положительные эффекты .

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что блокада синтеза NO сопровождается стабилизацией динамики кровяного давления, ассоциирующейся как с низкочастотной, так и (в большей степени) с высокочастотной областью. Отметим, что, с одной стороны, существуют доказательства влияния эндотелиального уровня NO на динамику в низкочастотной области, но, с другой стороны, известно, что различные физиологические эффекты фармакологической блокады NO зависят от типа блокатора и его концентрации. В данной работе применялся L-Name, который является неспецифическим блокатором NO. Кроме того, использовалась доза 10 мг/кг, которая полностью блокирует синтез NO. Полученные результаты продемонстрировали эффекты L-Name на разные механизмы регуляции кровяного давления. Обнаруженный эффект стабилизации динамики сигналов кровяного давления самок крыс ассоциируется у них с высокой кардиоваскулярной устойчивостью к стрессу и развитию артериальной гипертонии. [Pavlov A.N. et al., 2010] Таким образом, возникает необходимость в модулирующем воздействии на системы генерации NO c тем, чтобы поддержать или усилить защитное и физиологическое действие NO и, в то же время, устранить или ограничить его повреждающие эффекты. По последним данным, эффекты оксида азота зависят не только от концентрации, но также от места его продукции, диффузии в клетках и тканях, образования NO-содержащих соединения, взаимодействия с реактивными формами кислорода (в особенности с супероксид-анион радикалом) и, возможно, от других факторов [Серая, 2002] .

Таким образом, для понимания процессов, лежащих в основе перехода защитных эффектов этого агента в повреждающие, а также для выработки новых стратегий лечения необходимо установить роль этих факторов в проявлении биологической активности NO .

1.4 Электромиография, как метод исследования функционального состояния двигательных систем Электромиография (ЭМГ) - метод исследования биоэлектрических потенциалов, возникающих в скелетных мышцах человека и животных при возбуждении мышечных волокон; регистрация электрической активности мышц .

В основе метода ЭНМГ лежит применение электрической стимуляции нервного ствола с последующей регистрацией и анализом ВП, отводимых с иннервируемой им мышцы или непосредственно с самого нервного ствола .

Современная аппаратура позволяет регистрировать ПД нерва, а также мышечные потенциалы — М - ответ, Н-рефлекс, F-волну и некоторые другие .

Стимуляция нерва в двух точках, находящихся на определенном расстоянии друг от друга, позволяет вычислить время, в течение которого вызванный электрической стимуляцией импульс проходит это расстояние, а затем и СПИ. Исследование проводится с помощью электромиографа, имеющего специальный вход для регистрации ЭМГ, и электрического стимулятора, работа которых синхронизирована .

Электронейромиограмма (ЭНМГ) - кривая, записанная на фотоплёнке, на бумаге с помощью чернильно-пишущего осциллографа или на магнитных носителях .

Анализ ЭНМГ - кривых проводится в зависимости от типа миографа непосредственно на экране осциллоскопа (измерение латентных периодов, амплитуд, частотных характеристик) или на фотобумаге и фотопленке. В последние 10—15 лет в связи с развитием компьютерной микропроцессорной аппаратуры существенно расширились возможности автоматизированного анализа ЭНМГ. Современные электронейромиографы по сути являются компактными компьютеризованными системами, которые производят стимуляцию по определенной заданной программе, усреднение кривых и оперативный автоматический обсчет латентных периодов, амплитуд, СПИ, а также спектральный частотный анализ ЭНМГ. Полученные результаты аппарат печатает на термальной бумажной ленте или на экране дисплея [Персон, 1969] .

Для ЭНМГ-исследования необходим электрический стимулятор, способный продуцировать одиночные, спаренные или ритмичные прямоугольные стимулы длительностью от 0,05 до 2 мс и регулируемой интенсивностью от 0 до 250—500 В. Частота стимулов может меняться от 1 до 30—100 Гц. Отдельные электростимуляторы позволяют достигать частоты 1000—2000 Гц, продолжительность серии стимулов может регулироваться произвольно или автоматически (длительностью 50—1000 мс). Важнейшим условием работы электростимулятора, входящего в состав электронейромиографа, является синхронизация стимулирующего сигнала с запуском развертки луча на осциллоскопе .

Раздражающие электроды могут быть двух типов — накожные или игольчатые. В настоящее время чаще используют биполярные накожные раздражающие электроды. Форма электродов может быть различной в зависимости от задач исследования, топографии стимулируемого нерва .

Игольчатые раздражающие электроды применяют значительно реже поверхностных и преимущественно в тех случаях, когда исследуемый нерв расположен глубоко и труднодоступен стимуляции. Игольчатый электрод вводят вблизи нервного ствола. Он позволяет выполнять супрамаксимальное стимулирование со значительно более слабым стимулом. Игольчатые электроды рекомендуют применять также в случаях топографической близости нескольких нервов во избежание распространения стимула на соседние стволы .

Игольчатые отводящие электроды вставляют в область конечной пластинки в мышцу: 2—3 электрода вводят на некотором расстоянии друг от друга в зависимости от размеров мышцы по линии, перпендикулярной ходу мышечных волокон, что позволяет получить общее представление о мелкой мышце .

Предложено много вариантов игольчатых отводящих электродов, которые подразделяют на 3 основные группы: униполярные, биполярные и мультиэлектроды. Наиболее употребляемы биполярные электроды. И стимулирующие, и отводящие игольчатые электроды требуют специального ухода. Металл же изолирующий материал электрода должен выдерживать кипячение или хранение в 90% спирте в течение суток. Необходимо оберегать электрод от повреждений; появление зазубрин на острие иглы увеличивает болезненность исследования, повреждает мягкие ткани и мышечные волокна, вызывает резкое раздражение рецепторов .

В настоящее время различают следующие электромиографические исследования:

1.Стимуляционная электромиография:

Определение скорости проведения импульсов по моторным и сенсорным волокнам периферических нервов. С помощью стимуляционного электрода стимулируются двигательные или чувствительные нервы, и с помощью регистрирующих электродов регистрируются двигательный ответ или вызванный потенциал. Зная разницу во времени между разными потенциалами в зависимости от точек стимуляции и зная дистанцию между двумя точками, мы можем определить время распространения возбуждения по нерву между двумя точкам стимуляции .

Исследование нейромышечной передачи. У пациентов с патологиями нервно-мышечной передачи (миастения) синапсы не вырабатывают достаточного количества медиаторов (перенесших импульсов) между нейронами и между нейроном и мышечным волокном. С помощью электромиографии для выявления функционального дефекта производится высокочастотная стимуляция (3-5Гц) определенного нерва и регистрируются мышечные ответы. При миастении амплитуды последующих ответов становятся меньше и меньше (синапс не успевает предоставить достаточного количества медиаторов при такой частоте) .

Исследование симпатического вызванного потенциала. С помощью этого метода определяется скорость проведения импульсов по симпатическим волокнам, а также сила распространения потенциала по вегетативным волокнам. Данный метод показан при диагностике заболеваний вегетативной нервной системы .

Соматосенсорные вызванные потенциалы. С помощью этого метода можно определить скорость проведения импульсов по сенсорным волокнам на уровне спинного и головного мозга .

2.Поверхностная электромиография. С помощью этого метода можно определить состояние мышечного волокна и выявить характер поражения мышечной системы, а также определить общую мощность мышцы в целом .

3.Игольчатая электромиография. Специальная игла вводится в исследованную мышцу, определяется работоспособность мышечного волокна (потенциал двигательных единиц) при напряжении мышцы и наличие спонтанной активности в покое .

4.Магнитная стимуляция головного мозга. С помощью специализированного магнитного стимулятора стимулируется кора головного мозга, и регистрируется двигательный ответ в исследованной конечности [Гехт, 1997] .

Современная электромиография является полимодальным методом исследования и включает большое количество методик. В настоящее время наиболее распространенными являются методики исследования вызванного электрического ответа мышцы (М-ответа) и скорости проведения возбуждения по нерву. Несмотря на достаточно глубокое изучение М-ответа в норме и патологии до настоящего времени этот феномен не потерял актуальности .

Электромиография позволяет установить изменение мышечного тонуса и нарушения движений. Она может быть применена для характеристики мышечной активности и ранней диагностики поражений нервной и мышечной систем, когда клинические симптомы не выражены. ЭМГисследования позволяют объективизировать наличие болевого синдрома, динамику процесса .

1.4 Вызванные электрические ответы мышцы и их характеристики Вызванный электрический ответ мышцы - потенциал действия, возникающий в мышце при ее прямой, непрямой или рефлекторной стимуляции. Среди вызванных электрических ответов выделяют моторный (М) ответ - потенциал, возникающий в мышце при электрическом раздражении двигательных волокон нерва, рефлекторный (Н) ответ, возникающий в мышце при раздражении низкопороговых чувствительных волокон нерва, и F-ответ, возникающий в мышце при электрической стимуляции двигательных аксонов нерва и являющийся результатом антидромного проведения волн возбуждения от места стимуляции к мотонейрону, возбуждения мотонейронов и возвратного проведения волны возбуждения до иннервируемых им мышечных волокон .

Вызванные электрические ответы используются при исследовании функционального состояния мотонейронов и центральных систем регуляции двигательной функции. Есть основания полагать, что вызванные электрические ответы могут быть использованы и для анализа ряда патологических процессов, происходящих в мышце [Гехт, Касаткина, 1983;

Гехт с соавт., 1984; Thomas, 1985; Buchtal, 1992] .

М-ответ — вызванный потенциал мышцы, являющийся суммарным синхронным разрядом ДЕ мышцы в ответ на электрическое раздражение нерва. Обычно М-ответ регистрируют с помощью поверхностных (накожных) или стальных игольчатых электродов .

При изучении М-ответа обращают внимание на интенсивность порогового раздражения, латентный период вызванного потенциала, его форму, амплитуду, длительность, а также на взаимозависимость этих показателей .

Необходимо регистрировать порог раздражения (порог М-ответа) — минимальное электрическое раздражение, способное вызвать М-ответ .

Величина пороговой стимуляции в обычных условиях может варьировать в небольших пределах в зависимости от характера наложения электродов, индивидуальных особенностей кожного сопротивления. Грубое повышение порога М-ответа наблюдается при поражении нерва или мышцы, снижение порога встречается крайне редко. Определяют также интенсивность раздражения, вызывающего М-ответ, максимальной амплитуды (максимальный М-ответ). Амплитуда М-ответа при максимальном раздражении может иметь некоторые колебания в величине, что определяется непостоянным включением наиболее высокопороговых ДЕ. С целью гарантированного охвата всех функционирующих ДЕ мышцы используют так называемое супрамаксимальное раздражение — повышение силы раздражения после достижения максимального М-ответа еще на 25—50% .

Форма М-ответа зависит от ряда факторов. При биполярном отведении М-ответ имеет негативную и позитивную фазы соответственно прохождению волны возбуждения под обеими электродными пластинами .

Амплитуда М-ответа зависит от количества и синхронности вызванной активации двигательных единиц мышцы. Гибель части ДЕ, возникающая при развитии денервационного синдрома, приводит к снижению амплитуды Мответа. Основное проявление денервационного синдрома мышцы – дегенерация концевой пластинки – зоны мышечного волокна, где сосредоточен весь холинергический аппарат того волокна. При этом появляются новые ацетилхолиновые рецепторы на всем протяжении мышечного волокна («растекание рецепторов») и в связи с этим повышается общая чувствительность к ацетилхолину всего волокна .

Основным патологическим паттерном М-ответа является снижение амплитуды, что обусловлено тремя различными причинами:

1. гибелью части периферических мотонейронов и связанных с ними двигательных единиц;

2. снижением возбудимости мотонейронов и/или аксонов;

3. нарушением невральной проводимости и соответствующим увеличением длительности М-ответа, что приводит к снижению амплитуды .

Снижение возбудимости мотонейронов и аксонов обусловлено нарушением их микроструктуры или обменных процессов; оно может быть обратимым или прогрессировать в зависимости от интенсивности и длительности воздействия повреждающих факторов. Нарушение возбудимости аксонов проявляется в первую очередь и бывает более выраженным в дистальных отделах нервов, потому стимуляция в проксимальной точке нерва вызывает М-ответ большей амплитуды, чем в дистальной точке .

Амплитуда М-ответа понижается при удалении точки стимуляции от мышцы, что связано с увеличением времени активации ДЕ. В норме при удалении точки проксимальной стимуляции на середину конечности это понижение не превышает 20% от амплитуды дистального М-ответа. Развитие частичного блока невральной проводимости возбуждения вследствие патологического фокального изменения мембраны нервного волокна приводит к значительному снижению амплитуды (более 20%) проксимального М-ответа по сравнению с дистальным .

Длительность М-ответа - довольно вариабельный показатель, особенно при исследовании периферических нервов на разных уровнях, поэтому его целесообразно измерять на вызванных потенциалах, полученных при стимуляции нервов в дистальной точке. При этом моторный ответ на раздражение носит характер фазического движения за счет сокращения быстрых «белых» мышц, регулируемого -большими мотонейронами. Для большинства мышц кисти и стопы длительность М-ответа в норме составляет 4 – 7 мс .

Патологические паттерны длительности М-ответа зависят от характера поражения периферического мотонейрона. Поражения, приводящие к нарушению возбудимости мотонейронов, ведут к уменьшению длительности М-ответа. Поражения периферической нервной системы, характеризующиеся нарушением аксональной проводимости, приводят к повышению длительности моторного вызванного потенциала .

Поражение тел мотонейронов при переднероговых патологических процессах и аксонов при заболеваниях и травмах периферических нервов приводит к снижению амплитуды и длительности М-ответа с характерным нарушением его формы .

Латентность М-ответа измеряется также при чувствительности 200 – 500 мкВ/дел. и скорости развертки 1 – 2 мс/дел. Для клинических исследований используется терминальная латентность, т.е. латентность Мответа, полученного при стимуляции нерва в дистальной точке. Латентности М-ответов, вызванных стимуляцией проксимальных точек периферических нервов, используются для расчета скоростей невральной проводимости возбуждения. Сравнительный анализ абсолютных значений терминальной латентности при повторных исследованиях осуществляется путем стандартизации регистрации М-ответа, что позволяет сохранить постоянное расстояние между отводящим и стимулирующим электродом .

Н-рефлекс является моносинаптическим рефлекторным ответом мышцы при электрическом раздражении нервного ствола афферентных нервных волокон. У взрослых в норме вызывается в основном только в мышцах голени при стимуляции большеберцового нерва током субмаксимальной (по отношению к М-ответу) величины. Впервые Н-рефлекс, который проявляется в виде синхронного ответа значительного количества ДЕ трехглавой мышцы голени человека на одиночное раздражение афферентных волокон большеберцового нерва электрическим током, описал P. Hoffmann (1918). В 1922 году P. Hoffmann и в 1928 году P. Hoffmann и C.J .

Кeller пришли к заключению, что Н-рефлекс, имеющий относительно короткий и постоянный латентный период, является аналогом ахиллова рефлекса и представляет частный случай моносинаптического рефлекса. P .

Hoffmann связывал открытый им рефлекс с рефлекторным ответом мотонейронов трехглавой мышцы голени на электрическое раздражение афферентых волокон большеберцового нерва .

В 1950 году J.W. Magladery и D.B. McDougal назвали этот рефлекс по имени его первооткрывателя P. Hoffmann (т.е. Н-рефлекс) .

В отличие от М-ответа, являющегося прямым мышечным ответом на раздражение двигательных волокон нерва, Н-рефлекс - ответ рефлекторный, вызываемый раздражением чувствительных волокон нерва, с распространением возбуждения центростремительно ортодромно к спинному мозгу, синаптическим переключением сигнала с аксона чувствительной клетки на мотонейрон и затем проведением импульса по двигательным волокнам к иннервируемым ими мышечным волокнам .

При постепенном увеличении интенсивности раздражения нерва выявляется своеобразное соотношение в динамике изменения амплитуды рефлекторного и моторного ответов мышцы. Н-ответ появляется при силе раздражения, подпороговой для М-ответа. По мере возрастания амплитуды Н-рефлекса появляется минимальный по амплитуде М-ответ. В дальнейшем при усилении раздражения амплитуда Н-ответа достигает максимума и начинает уменьшаться, а амплитуда М-ответа увеличивается. При силе раздражения, супрамаксимальной для М-ответа, Н-ответ, как правило, уже не определяется .

Подобная динамика появления вызванных рефлекторного и прямого ответов мышцы и изменения их амплитуды обусловлена прежде всего различным порогом возбуждения афферентных и эфферентных волокон нервного ствола при его электрической стимуляции [Buchtal et al., 1974] .

При исследованиях изучаются следующие параметры Н-рефлекса:

латентный период, порог и динамика изменения амплитуды при увеличении силы стимуляции, соотношение максимальных амплитуд Н-ответа и М-ответа (в процентах), форма и длительность Н-ответа .

Рассчитывая латентность Н-рефлекса, при стимуляции из одной точки можно достаточно точно определить поражение сенсорного или двигательного отдела рефлекторной дуги, а анализируя соотношение амплитуды Н-рефлекса и М-ответа при нарастании силы стимула, можно оценить степень возбудимости рефлекторной дуги и сохранность ее элементов .

Латентный период H-рефлекса может увеличиваться при поражении любого отрезка рефлекторной дуги: патологии чувствительных и двигательных волокон стимулирующего нерва, нарушении синаптического проведения .

Изменение H-рефлекса при центральных двигательных расстройствах могут проявляться и как его увеличение, и как его уменьшение с соответствующим изменением величины порогов, его вызвавших. При повышенной рефлекторной возбудимости увеличивается амплитуда Hрефлекса, уменьшается его порог, увеличивается отношение амплитуд Нрефлексов и M-ответов .

1.5 Транскраниальная магнитная стимуляция Транскраниальная магнитная стимуляция (ТМС) представляет собой неинвазивный метод, который даёт возможность вызвать в нейронах головного мозга деполяризацию или гиперполяризацию. ТМС основана на применении принципа электромагнитной индукции с целью создания слабых электрических токов посредством использования быстро меняющихся магнитных полей, что позволяет вызвать определённую активность в конкретных частях мозга .

Впервые принцип индуктивной стимуляции мозга посредством использования вихревых токов был применен в 20-м веке. Первые успешные исследования ТМС были в 1985-м году проведены Энтони Баркером и его коллегами в Шеффилде, они продемонстрировали проведение нервных импульсов от моторной зоны коры головного мозга в спинной мозг с сопутствующей стимуляцией мышечных сокращений .

В основе метода лежит генерация электрического поля в глубине тканей, ведущая к деполяризации мембраны нервной клетки и появлению, дальнейшему распространению потенциала действия. При этом на уровне первых трех перехватов Ранвье происходит возбуждение проксимальной части аксона быстропроводящих мотонейронов (D-волна, direct wave) и несколько вставочных нейронов, которые с различной временной задержкой передают возбуждение на мотонейрон (I-волна, indirect wave). Так, в ответ на однократно предъявленный стимул моторной коре появляется залп нисходящих волн возбуждения, конечной мишенью которых являются альфамотонейроны, передающие возбуждение периферическим нервам [Amassian, 1990; Terao, 2002] .

Действующим фактором в данном методе являются вихревые электрические поля, индуцируемые в тканях магнитным полем высокой амплитуды. За счет быстрого нарастания вектора магнитной индукции (скорость которого достигает 104 Тл* ) возникающие вихревые электрические поля вызывают круговые движения зарядов. Индукционные (вихревые) электрические токи значительной плотности способны, вызвать возбуждение волокон периферических нервов и ритмическое сокращение миофибрилл скелетной мускулатуры, гладких мышц сосудов и внутренних органов (феномен магнитостимуляции). Индуцированный ток в тканях протекает в плоскостях, параллельных плоскости индуктора, но в противоположном направлении (если ток в индукторе направлен по часовой стрелке, ток в ткани будет идти против часовой стрелки) .

ЭМГ-регистрация волны возбуждения с мышц конечностей дает возможность исследовать такие параметры, как характеристики вызванного моторного потенциала (ВМП) (порог, амплитуда, латентный период, форма и др.), время центрального моторного проведения (ВЦМП), анализировать процессы возбуждения и торможения в мозге (период молчания, транскаллозальное торможение, внутрикорковое торможение и возбуждение) .

Эти показатели используются в клинике для оценки функционального состояния кортико-спинального тракта [Di Lazzaro, 1990; Rossini, 1999;

Abbruzzese, 2002], зрелости кортико-спинального тракта у детей, картирования мышечного представительства, а также для исследования нейропластических процессов, возбудимости зрительной коры, локализации центра речи .

Изучение амплитуды ВМП дает представление о количестве вовлекаемых в стимуляцию мотонейронов (МН) [Buchmann, 2003], в то время как величина порога ВМП отражает возбудимость корковых МН. При поражениях кортико-спинального тракта (таких как инсульт, спинальная травма) имеет место повышение порога ВМО. Низкий порог ВМО может наблюдаться при таких заболеваниях, как генерализованная идиопатическая эпилепсия, боковой амиотрофический синдром (БАС), некоторые психические расстройства, для которых характерна повышенная возбудимость нервной системы. Порог ВМО может изменяться под воздействием медикаментозных средств [Karin Edebol Eeg-Olofsson, 2006] .

Вычисление времени центрального моторного проведения — разность между латентным временем ВМО при корковой стимуляции (над уровнем vertex) и латентным временем ВМО при сегментарной стимуляции выбранного уровня (обычно C6–C7, L3–L5) — позволяет дифференцировать уровень поражения пирамидного пути (корковый, спинальный) .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Объекты, материалы и методы исследования Исследование проводили на 30 беспородных лабораторных крысах массой 120-180 г. Все эксперименты проведены с соблюдением биоэтических норм .

Животным осуществляли перерезку спинного мозга (спинализацию) между 2 и 3 грудными позвонками под общим эфирным наркозом.

Через 2 часа после спинализации субдурально вводили:

1) физиологический раствор (20мг/кг),

2) источник экзогенного оксида азота нитропруссид натрия дозировка 20 мг/кг, концентрация 100 мкМ .

3) неспецифический блокатор NO-синтазы L-Name дозировкой 20 мг/кг Введение веществ осуществляли между 4-5 поясничными позвонками .

Для этого фиксировали животное спиной вверх. Делали продольный разрез на уровне пояснично-крестцового отдела. Расслаивали окружающие ткани, раздвигали тела позвонков, осуществляли прокол твердой мозговой оболочки, вводили препарат .

Через 15 мин после введения вещества электромиографическими методами оценивали функциональное состояние нейро-моторного аппарата икроножной мышцы крысы. С помощью игольчатых электродов регистрировали электрические ответы икроножной мышцы, вызванные раздражением седалищного нерва одиночными прямоугольными импульсами длительностью 0.5 мс с частотой 0.5 имп/мин. Интенсивность стимулов варьировала от 0.3 до 35 В. В качестве раздражающего, использовали игольчатые электроды, которые вкалывали в область проекции седалищного нерва. Методом Н-ответа изучали рефлекторную возбудимость двигательных центров. Для исследования состояния периферической части нервномышечного аппарата регистрировали М-ответ. Для нанесения стимула, усиления и регистрации ответов была использована экспериментальная установка на базе электромиографа MG-42 фирмы «Медикор» и процессора Pentium .

Также регистрировали моторные потенциалы икроножной мышцы, вызванные магнитной стимуляцией шейного и пояснично-крестцового отдела спинного мозга у крыс под уретановым наркозом (15% раствор в дозе 1,5 г/кг внутрибрюшинно). При стимуляции подбирали такое положение катушки магнитного стимулятора, при котором ВМП имели максимальную амплитуду, минимальную латентность, постоянную форму и конфигурацию .

Определяли порог возникновения латентный период, максимальную амплитуду, длительность ВМП и ВЦМП. ЦВМП представляло собой разность времени общего проведения (время распространения магнитного импульса от момента стимуляции шейного отдела спинного мозга до момента регистрации ВМП) и времени периферического проведения (время распространения магнитного импульса от момента стимуляции поясничнокрестцового отдела спинного мозга до момента регистрации ВМП) .

В экспериментах использовали исследовательскую установку «НейроМВП4" фирмы Нейрософт .

В качестве контрольных использовали данные, полученные при исследовании интактных животных .

Статистическую обработку производили с использованием пакета прикладных программ “Origin”. Достоверность результатов определяли по tкритерию Стьюдента .

2.2 Результаты исследование и их обсуждение 2.2.1 Влияние физиологического раствора на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва Для исключения влияний операционной травмы на функциональное состояние нейро-моторного аппарата проводили оценку электромиографических характеристик икроножной мышцы в условиях субдурального введения физиологического раствора .

Введение физиологического раствора не приводило к достоверным изменениям параметров моторного ответа икроножной мышцы крысы. Порог М-ответа после введения физиологического раствора составил 105±7% от контроля (р0,05). Результаты представлены на рисунке 1 А .

Максимальная амплитуда моторного ответа после введения физиологического раствора составила 110±7% по отношению к контролю (р0,05). Результаты показаны на рисунке 1 Б .

Значения временных параметров M-ответа после введения физиологического раствора также достоверно не изменились. Латентность моторного ответа составила 107±8% от контрольных значений (р0,05) .

Длительность М-ответа незначительно уменьшилась и составила 98±7% по отношению к контролю (р0,05). Результаты показаны на рисунках 1В и 1Г соответственно .

Рисунок 1 - Параметры моторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении физиологического раствора. По оси ординат обозначены А - значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В значения латентного периода, Г - значения длительности М-ответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях .

На рисунке 2 отображены параметры рефлекторных ответов икроножной мышцы крысы в условиях субдурального введения физиологического раствора. Амплитудные и временные параметры рефлекторного ответа икроножной мышцы крысы достоверно не изменились .

Порог Н-ответа составил 98±5% по отношению к контролю (p0,05) .

Результаты представлены на рисунке 2 А .

Максимальная амплитуда рефлекторного ответа - 97±7% от контрольных значений (р0,05). Результаты показаны на рисунке 2 Б .

Латентный период Н-ответа составил 112±10% по отношению к контролю (р0,05). Результаты показаны на рисунке 2 В .

Длительность рефлекторного ответа составила 98±8% по отношению к контролю (р0,05).Результаты показаны на рисунке 2 Г .

Рисунок 2 - Параметры рефлекторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении физиологического раствора. По оси ординат обозначены А - значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В - значения латентного периода, Г - значения длительности Нответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях .

При оценке значения отношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов (Hmax/Mmax) также не обнаружено достоверных отличий контрольных значений. Так, значение Нmax/Mmax составило 98±7% по сравнению с контролем (р0,05) .

Результаты представлены на рисунке 3 .

Рисунок 3 - Отношение максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов икроножной мышцы крысы при введении физиологического раствора. По оси ординат обозначены значения отношения максимальной амплитуды Н-ответа к максимальной амплитуде М-ответа, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлый столбец – контроль, темный – значение отношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов в экспериментальных условиях .

Вызванные электрические ответы используются при исследовании функционального состояния мотонейронов, центральных систем регуляции двигательной функции, а также периферических звеньев нейро-моторного аппарата .

Есть основания полагать, что вызванные электрические ответы могут быть использованы и для анализа ряда патологических процессов, происходящих в мышце [Гехт Б.Н., Касаткина Л.Ф., 1983; Гехт Б.Н. с соавт., 1984; Thomas P.K., 1985; Buchtal F., 1992]. Изменение параметров Н- и Мответов, по сравнению с контрольными данными, может свидетельствовать о развитии патологического процесса в двигательной системе [Гехт Б.Н. с соавт., 1984; Buchtal F., 1992]. В наших исследованиях влияния субдурального введения физиологического раствора на электромиографические характеристики икроножной мышцы крысы обнаружено, что полученные в экспериментах данные не отличаются от контрольных. Таким образом, можно заключить, процедура инъекции под оболочки спинного мозга не оказывает влияние на функциональное состояние двигательных центров и периферических структур нейро-моторного аппарата .

2.2.2 Влияние нитропруссида натрия на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва На рисунке 4 представлены результаты электромиографического исследования икроножной мышцы крысы после субдурального введения нитропруссида натрия. Мы наблюдали достоверное увеличение порога моторного ответа. Так, порог моторного ответа икроножной мышцы крысы составил 180±14% по отношению к контрольным значениям (р0,05) .

Результаты представлены на рисунке 4 А .

Максимальная амплитуда незначительно уменьшалась и составила 83±15% по сравнению с контролем (р0,05). Результаты показаны на рисунке 4 Б .

Временные параметры моторного ответа икроножной мышцы крысы в ходе эксперимента достоверно не изменялись. Результаты представлены на рисунках 4В и 4Г .

Рисунок 4 - Параметры моторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А - значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В значения латентного периода, Г - значения длительности М-ответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях.* - достоверность, p0,05 .

Известно, что моторный ответ — вызванный потенциал мышцы, являющийся суммарным синхронным разрядом двигательных единиц мышцы в ответ на электрическое раздражение нерва .

При изучении М-ответа обращают внимание на интенсивность порогового раздражения, латентный период вызванного потенциала, его форму, амплитуду, длительность, а также на взаимозависимость этих показателей. Одним из основных показателей является порог раздражения (порог М-ответа) — минимальное электрическое раздражение, способное вызвать М-ответ. Грубое повышение порога М-ответа обычно наблюдается при поражении нерва или мышцы [Гехт с соавт., 1997]. В наших исследованиях также было обнаружено достоверное увеличение порога моторного ответа. Однако, на наш взгляд, зарегистрированные преобразования не могли быть вызваны повреждением периферических звеньев двигательной системы. Мы считаем, что изменение порога М-ответа икроножной мышцы после субдурального введения источника экзогенного оксида азота было центрозависимо и связано с изменением состояния спинальных мотонейронов. Данное предположение подтверждается дальнейшими результатами проведенных исследований .

Так, порог рефлекторного ответа достоверно увеличился и составил 210±15% по сравнению с контролем (р0,05). Результаты представлены на рисунке 5 А .

Максимальная амплитуда Н-ответа составила 112±8% от контрольных значений (р0,05). Результаты показаны на рисунке 5 Б .

Латентность Н-ответа составила 68±10% по отношению к контролю (р0,05). Результаты показаны на рисунке 5 В .

Длительность рефлекторного ответа после введения нитропруссида натрия составила 88±12% от контроля (р0,05). Результаты представлены на рисунке 5 Г .

Рисунок 5 - Параметры рефлекторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А - значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В значения латентного периода, Г - значения длительности Н-ответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Введение экзогенного источника оксида азота привело к достоверному уменьшению латентного периода рефлекторного ответа .

На рисунке 6 представлено значение отношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов (Hmax/Mmax). Как видно, значение снизилось и составило 73±10% от контрольных значений (р0,05) .

Рисунок 6 - Отношение максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов икроножной мышцы крысы при введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены значения отношения максимальной амплитуды Н-ответа к максимальной амплитуде М-ответа, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100% .

Светлый столбец – контроль, темный – значение отношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Характеристики рефлекторных ответов мышцы отражают состояние иннервирующих ее спинальных мотонейронов. Обнаруженное в наших экспериментах увеличение порога Н-ответа, а также увеличение значения соотношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов икроножной мышцы указывает на уменьшение рефлекторной возбудимости соответствующих двигательных центров и сужение пула мотонейронов, реагирующих на афферентный стимул. Такие преобразования могут быть связаны с изменением электрических свойств мембраны клеток. При повышении концентрации оксида азота (II) в спинном мозге он диффундирует в мотонейроны и активизирует в них образование цГМФ, способного влиять на проводимость ионных каналов и, таким образом, изменять электрогенез нейронов. Показано, что экзогенный оксид азота активировать калиевые токи нервных мембран (Зефиров и др., 1999) .

Уменьшение латентного периода, вероятно, обусловлено нейромедиаторным эффектом оксида азота .

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о значимости оксида азота (II) в регуляции функционального состояния центральных и периферических структур двигательных систем. Эффекты оксида азота могут быть опосредованы, как изменением свойств мембраны мотонейронов, так и модуляцией синаптической передачи .

2.2.3 Влияние L-Name на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных электрической стимуляцией седалищного нерва Введение блокатора NO-синтазы L-Name в субдуральное пространство приводило к изменению порога моторного ответа икроножной мышцы порог М-ответа уменьшался до 85±16% (р0,05), а амплитуда не достоверно возрастала и достигала 103±16% (р0,05) .

Временные характеристики моторного ответа икроножной мышцы значительно не изменялись – латентный период М-ответа уменьшался до 95±20% (р0,05), длительность увеличивалась и достигала 116±22% (р0,05) от контрольных значений .

Результаты исследований представлены на рисунке 7 .

Рисунок 7 - Параметры моторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В - значения латентного периода, Г - значения длительности M-ответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100% .

Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Показано, что субдуральное введение неспецифического блокатора NOсинтазы L-Name приводит к снижению интенсивности стимуляции, пороговой для возникновения М-ответа. Это, вероятно, свидетельствует о повышении возбудимости эфферентных аксонов, которая может определятся возбудимостью соответствующих мотонейронов. В литературе описаны эффекты NO в центральной нервной системе [Prast, Philippu, 2001; Esplugues, 2002]. Показано, что NO может изменять мембранную проводимость мотонейрона [R.Morales et. al., 2002]. Возможно, в наших экспериментальных условиях, снижение концентрации оксида азота (II) приводит к деполяризации мембраны мотонейронов иннервирующих икроножную мышцу, повышению их возбудимости и, как следствие, увеличению возбудимости аксонов, что и выражается в снижении порога М-ответа .

Увеличение амплитуды моторного ответа, возможно, вследствие увеличения синхронности мышечных волокон .

Введение блокатора NO-синтазы в субдуральное пространство приводило к изменениям характеристик рефлекторного ответа икроножной мышцы – порог Н-ответа увеличился до 140±17% (р0,05), амплитуда возрастала и достигала 140±12% (р0,05) от контрольных значений .

Введение блокатора NO-синтазы в субдуральное пространство не приводило к изменениям данных характеристик рефлекторного ответа икроножной мышцы – Латентный период Н-ответа уменьшалась до 92±23% (р0,05), длительность увеличивалась и достигала 119±13% (р0,05) от контрольных значений .

Результаты исследований представлены на рисунке 8 .

Рисунок 8 - Параметры рефлекторного ответа икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А значения порога, Б - значения максимальной амплитуды, В - значения латентного периода, Г - значения длительности Н-ответов, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100% .

Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Показано, что уменьшение концентрации NO в нейронах спинного мозга в результате субдурального введения неспецифического блокатора NOсинтазы L-Name приводит к возрастанию максимальной амплитуды Н-ответа икроножной мышцы. Такие преобразования указывают на повышение рефлекторной возбудимости соответствующего двигательного центра, а уменьшение порога указывает на понижение возбудимости двигательных центров мотонейронов. Характеристики H-ответа могут друг другу не соответствовать. Причины расхождения показателей возбудимости мотонейронов является отсутствие тесных взаимосвязей между параметрами H-ответов, отражающими деятельность различных элементов пула, регуляторные механизмы которых независимы. Порог H-ответа может являться показателем состояния гамма-мотонейронов, определяющих возбудимость мышечных афферентов и низкопороговых элементов пула .

Амплитуда максимального H-ответа и крутизна его нарастания при усилении раздражения характеризует свойство высокопороговых альфа-мотонейронов, возбудимость которых может регулироваться независимо от возбудимости гамма-элементов .

При оценке значения соотношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов были обнаружены достоверные отличия контрольных значений. Нmax/Mmax икроножной мышцы составило 140±8% (р0,05) по отношению к контролю .

Рисунок 9 - Отношение максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов икроножной мышцы крысы при введении L-Name. По оси ординат - значения Hmax/Mmax, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлый столбец – контроль, темный – значение отношения максимальных амплитуд рефлекторного и моторного ответов в экспериментальных условиях. *-достоверность, р0.05 При оценке соотношения максимальных амплитуд Н- и М-ответов, мы получили, что Нmax/Мmax увеличивается, что трактуется исследователями, как расширение мотонейронного пула, реагирующего на афферентную стимуляцию и повышение рефлекторной возбудимости двигательного центра .

Вероятно, NO участвует в регуляции функционального состояние мотонейронов составляющих спинальный двигательный центр скелетной мышцы .

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о влиянии оксида азота (II) на характеристики моторных и рефлекторных ответов икроножной мышцы крысы .

2.2.4 Влияние нитропруссида натрия на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией эфферентных путей спинного мозга На рисунке 10 представлены результаты исследования ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией, после субдурального введения нитропруссида натрия. При стимуляции на уровне шейного отдела СМ мы наблюдали уменьшение порога ответа. Он составил 87±3% по отношению к контрольным значениям (р0,05). Результаты представлены на рисунке 10 А .

Максимальная амплитуда значительно возросла и составила на уровне шейного отдела 335±30%, по сравнению с контролем (р0,05). Результаты показаны на рисунке 10 Б .

В работе Б.М. Гехта с соавт., (1997) показано, что увеличение амплитуды ВМП свидетельствует о повышении возбудимости мотонейронов спинного мозга .

Рисунок 10 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А

- значения порога при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, Б значения максимальной амплитуды при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Временные характеристики ответа икроножной мышцы значительно не изменялись – латентный период ВМО при стимуляции на уровне шейного отдела составил 103±6% (р0,05), Длительность увеличивалась и достигала 176±13% (р0,05) от контрольных значений при стимуляции на уровне шейного отдела .

Результаты исследований представлены на рисунке 11 .

Рисунок 11 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А

- значения латентного периода при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, Б - значения длительности при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

При стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела после введения экзогенного источника оксида азота (II) порог увеличился до значения 114±6%. Рисунок 12 А. Максимальная амплитуда возрастала значительно и составила при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела - 266±10% Рисунок 12 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А

- значения порога при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела, Б – значения максимальной амплитуды при стимуляции на уровне поясничнокрестцового отдела, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Значение латентного периода при стимуляции на уровне поясничнокрестцового возросло до 174±14%, длительность уменьшилась до 86±4% .

Рисунок 13 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении нитропруссида натрия. По оси ординат обозначены А

- значения латентного периода при стимуляции на уровне поясничнокрестцового отдела, Б – значения длительности при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * достоверность, p0,05 .

Величина порога ВМО отражает возбудимость корковых МН. При поражениях кортико-спинального тракта (таких как инсульт, спинальная травма) имеет место повышение порога ВМО. Низкий порог ВМО может наблюдаться при повышении возбудимости нервной системы .

Изучение амплитуды ВМО дает представление о количестве вовлекаемых в стимуляцию мотонейронов (МН) [Buchmann, 2003] .

Возбуждение постсинаптического окончания приводит к повышению внутриклеточного уровня Ca2 + /кальмодулина, активирующих NO-синтазу и образование NO. Оксид азота (II), диффундируя в пресинаптическое окончание, вызывает образование цГМФ, что приводит к усилению и увеличению длительности выделения из пресинапса нейромедиатора, который, в свою очередь, оказывает возбуждающее действие на постсинаптический нейрон и таким образом возникает обратная положительная связь с постоянным усилением. Следовательно, можно предположить, что значительное увеличение амплитуды ВМО было связано с действием NO .

2.2.5 Влияние L-Name на параметры ответов икроножной мышцы крысы, вызванных магнитной стимуляцией эфферентных путей спинного мозга Введение блокатора NO-синтазы в субдуральное пространство приводило к изменениям характеристик ВМО икроножной мышцы – порог ответа уменьшился до 67±7% (р0,05) при стимуляции на уровне шейного отдела, амплитуда возрастала и достигала соответственно 201±6% (p0,05) от контрольных значений .

Результаты исследований представлены на рисунке 14 .

Рисунок 14 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А - значения порога при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, Б - значения максимальной амплитуды при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Введение блокатора NO-синтазы в субдуральное пространство привело к уменьшению значения латентного периода ВМО икроножной мышцы – 81±9% при стимуляции на уровне шейного отдела и длительность достигала значения 93±6% (р0,05) от контрольных значений. Результаты представлены на рисунке 15 .

Рисунок 15 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А - значения латентного периода при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, Б значения длительности при стимуляции на уровне шейного отдела СМ, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

Порог ВМО в экспериментальных условиях существенно не изменился. При стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела он составил 100±8% .

Амплитуда возросла до 372±20% (р0,05) от контрольных значений .

Рисунок 16 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А - значения порога при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела, Б – значения максимальной амплитуды при стимуляции на уровне поясничнокрестцового отдела, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

101±3% при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела. 66±12% (р0,05) от контрольных значений Рисунок 17 - Параметры ВМО икроножной мышцы крысы при субдуральном введении L-Name. По оси ординат обозначены А - значения латентного периода при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела, Б – значения длительности при стимуляции на уровне пояснично-крестцового отдела, выраженные в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Светлые столбцы – контроль, темные – данные, полученные в экспериментальных условиях. * - достоверность, p0,05 .

ВЫВОДЫ

1). Рефлекторная возбудимость двигательных центров икроножной мышцы крысы в условиях увеличения концентрации оксида азота (II) в спинном мозге уменьшается .

2). В условиях увеличения концентрации оксида азота (II) в спинном мозге происходит уменьшение пула мотонейронов, реагирующих на афферентный стимул .

3). При спинальном субдуральном введении экзогенного источника оксида азота (II) нитропруссида натрия порог моторного ответа икроножной мышцы увеличивается .

4). Оксид азота (II) участвует в регуляции функционального состояния центральных и периферических структур двигательных систем. Эффекты оксида азота могут быть опосредованы, как изменением свойств мембраны мотонейронов, так и модуляцией синаптической передачи .

5). В условиях блокирования эндогенного синтеза оксида азота, происходит уменьшение порога М-ответа икроножной мышцы, остальные параметры моторного ответа (длительность, амплитуда, латентный период) крысы изменяются не достоверно .

6). Блокирование фермента синтеза оксида азота NO-синтазы приводит к увеличению порога и амплитуды Н-ответа .

7). Увеличение соотношения максимальных Н- и М-ответов икроножной мышцы крысы в условиях снижения эндогенного уровня оксида азота (II) связано с расширением пула реагирующих мотонейронов .

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1). Ашмарин, И.П. Нейрохимия / И.П. Ашмарин, П.В. Стукалова // 1996 .

Институт биомедицинской химии РАМН, М .

2). Бадалян, Л.О. Клиническая электромиография / Л.О. Бадалян, И.А .

Скворцов // - М., Медицина.- 1986.- C. 368 .

3). Галаган, М.Е. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо - и эндогенных источников / М. Е. Галаган, А. В. Широколава, А. Ф .

Ванин // Вопросы медицинской химии.- 1991.- T. 37, № 1.- С. 67-70 .

4). Герасимова, Е.В. Сероводород как эндогенный модулятор освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки / Е.В. Герасимова, Г.Ф .

Ситдикова, А.Л. Зефиров // Нейрохимия. – 2008.- Т. 25, №1-2.- С. 138-145 .

5). Гехт, Б.М. Электромиография нервно-мышечных заболеваний / Б.М. Гехт, Л.Ф. Касаткина, М.И. Самойлов и др. // Таганрог: Изд-во ТГРУ, - 1997.- C .

370 .

6). Гехт, Б.М. Теоретическая и клиническая электромиография. Л.: Наука,C. 229 .

7). Земляков, И.Ю. Физиологические особенности гладкомышечных клеток нижнего пищеводного сфинктера: Автореф. дис. … канд. мед. наук. Томск,C. 26 8). Зефиров, А.Л. / А. Л. Зефиров, Л. Л. Каталымов, И. В. Усмендеева (Кузнецова), Р. Р. Халиуллина // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131, - № 5. С .

604 .

9). Зефиров, А.Л. Функциональная роль оксида азота / А.Л. Зефиров, А.Х .

Уразаев // Успехи физиологических наук.- 1999.- Т.30, № 1.- С. 547-72 .

10). Зефиров, A.Л. Эффекты экзогенного NО на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания / А. Л. Зефиров, Р. Р .

Халиуллина, А. А. Анучин // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1999.- Т. 128, № 8.С. 144-147 .

11). Иоффе, М.Е. Кортикоспинальные механизмы инструментальных двигательных реакций. М.: Наука,- 1973.- C. 204 .

12). Коц, Я.М. Организация произвольного движения. М.: Наука,- 1975.- C .

248 .

13). Марков Х.М. L-аргинин – оксид азота в терапии болезней сердца и сосудов. Кардиология, - 2005.- Т. 6, С. 87-95 .

28. Персон, Р.С. Электромиография в исследовании человека. М.: Наука,C. 231 .

14). Персон, Р.С. Двигательные единицы и мотонейронный пул // Физиология движений. Руководство по физиологии. Л.: Наука,- 1976.- С. 69 .

15). Серая, И.П. Современные представления о биологической роли оксида азота / И.П. Серая, Я.Р. Нарциссов // Межрегиональный институт цитохимии .

- Москва, 2002г .

16). Ситдикова, Г.Ф. Газообразные посредники в нервной системе / Г.Ф .

Ситдикова, А.Л. Зефиров // Российский физиол. журнал им. И.М.Сеченова. – 2006. – Т. 92, № 7. – С.872-882 .

17). Яковлев, А.В. Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов оксида азота (II) на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. Автореф. дисс.... канд. биол. наук. - Казань, 2004. – C .

17 .

18). Abdel-Latif A.A. Cross talk between cyclic nucleotides and polyphosphoinositide hydrolysis, protein kinases and contraction in smooth muscle // Exp. Biol. Med.- 2001. T. 226,- № 3,- C. 153—163 .

19). Alderton, W. K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition / W .

K. Alderton, C. E. Cooper, R. G. Knowles, // 2001. Biochem. J.- 2001,- T. 357,- C .

593–615 .

20). Aley, K. O. Nitric oxide signaling in pain and nociceptor sensitization in the rat / K. O. Aley, G. McCarter, J. D. Levine // 1998. J. Neurosci.- 1998,- T. 18,- C .

7008–7014 .

21). Anderson, C. R. NADPH diaphorase-positive neurons in the rat spinal cord include a subpopulation of autonomic preganglionic neurons - Neurosci. Lett.,T. 139,- C. 280–284 .

22). Archer, S.L. Comparison of hemodynamic effects of nitric oxide and endothelium-dependent vasodilatators / S. L. Archer, K. Rist, D. P. Nelson et al. // J. Appl. Physiol.- 1990.- T. 68,- C. 737- 747 .

23). Baranano, D.E. Atypical neural messengers/ D.E. Baranano, C.D. 4. Ferris, S.H. Snyder. //Trends. Neurosci. – 2001. – T. 24, – C. 99-106 .

24). Barone, P. Non-uniformity of neocortex: areal heterogeneity of NADPHdiaphorase reactive neurons in adult macaque monkeys / P. Barone, H .

Kennedy // Cereb. Cortex. – 2000.- T. 10,- C. 160–174 .

25). Beckman, J. S. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite:

implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide / J. S .

Beckman, T. W. Beckman, J. Chen, P. A. Marshall, B. A. Freeman// Proc. Natl .

Acad. Sci. U.S.A.- 1990.- T. 87,- C. 1620–1624 .

26). Bishop, A. NO signaling in the CNS: from the physiological to the pathological / A. Bishop, J. E. Anderson // Toxicology. – 2005. – T. 208. – C. 193– 205 .

27). Blaise G. A. Nitric oxide, cell signaling and cell death /G. A. Blaise, D .

Gauvin, M. Gangal, S. Authier// Toxicology. - 2005.- T. 208,- C. 177–192 .

28). Boehning, D. Novel neural modulators / D. Boehning, S.H., Snyder // Annu .

Rev. Neurosci. – 2003. – T. 26, – C. 105-131 .

29). Bredt, D. S. Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in neuronal populations of the mammalian CNS together with NADPH diaphorase /D. S. Bredt, C. E. Glatt, P. M. Hwang, M. Fotuhi, T. M. Dawson, S .

H. Snyder// Neuron. – 1991.- T. 7,- C. 615–624 .

30). Brenman, J. E. Nitric oxide signaling in the nervous system. / J. E. Brenman, D. S. Bredt// Methods Enzymol – 1996.- T. 269,- C. 119–129 .

31). Buchman, J. Disturbed transcallosally mediated motor inhibition in children with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD). /J. Buchman, A. Walters, F .

Haessler// Clin. Neurophysiol. – 2003.- 114 – 2036-42 .

32). Bult, H. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter / H. Bult, G. E. Boeckxstaens, P. A. Pelckmans, F. H. Jordaens, Y .

M. Van Maercke, A. G. Herman// Nature – 1990.- T. 345,- C. 346–347 .

33). Calabrese, V. Nitric oxide in the central nervous system: neuroprotection versus neurotoxicity / V. Calabrese, C. Mancuso, M. Calvani, E. Rizzarelli, D. A .

Butterfield, A. M. Stella// Nat. Rev. Neurosci. – 2007.- T. 8,- C. 766–775 .

34). Cassina, P. Peroxynitrite triggers a phenotypic transformation in spinal cord astrocytes that induces motor neuron apoptosis / P. Cassina, H. Peluffo, M. Pehar, L. Martinez-Palma, A. Ressia, J. S. Beckman, A. G. Estevez, L. Barbeito// J .

Neurosci. Res.- 2002.- T. 67,- C. 21–29 .

35). Daniel, E.E. Nitric oxide from enteric nerves acts by a different mechanism from myogenic nitric oxide in canine lower esophageal sphincter /E. E. Daniel, J .

Jury, A. M. Salapatek et al. // J. Pharm. and Exp. Therap. 2000.- T. 294,- C. 270— 279 .

36). Dawson, T. M. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues / T. M. Dawson, D. S. Bredt, M. Fotuhi, P .

M. Hwang, S. H. Snyder// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1991.- T. 88,- C. 7797– 7801 .

37). Esplugues, J.V. NO as a signaling molecule in the nervous system/ J.V .

Esplugues // British. J. Pharmacol. – 2002. - T. 136, – C. 1079-1095 .

38). Ignarro, L.J. Endothelium-derived relaxing factor from pulmonary artery and vein possesses pharmacologic and chemical properties identical to those of nitric oxide radical / L.J. Ignarro, R.E. Byrns, G.M. Buga, K.S. Wood // Circ.Res. - 1999 .

– T.61, - C.866-879 .

39). Lass, A. Functional and Analytical Evidence for Scavenging of Oxygen Radicals by L-Arginine / A. Lass, A. Suessenbacher, G. Wolkart, B. Mayer and F .

Brunner // Mol. Pharmacol.- 2002.- T. 61,- C. 1081-1088 .

Looms D.K., Tritsaris K., Nauntofte B., Dissing S. Nitric oxide and cGMP activate Ca 2+ - release processes in rat parotid acinar cells / D.K. Looms, K. Tritsaris, B .

Nauntofte, S. Dissing // Biochem.- 2001.- J. 355 : С. 87-95 .

40). Lukas, K.A. Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP / K. A. Lukas, G. M. Pitari, S. Kazerounian et al. // Pharmacol. Rev. 2000.- T. 52,- C. 375—413 .

41). Prast, H. Nitric oxide as modulator of neuronal function / H. Prast, A .

Philippu // Progr. Neurobiol. – 2001.- T. 64,- C. 51-68 .

42). Salapatek, A.M. Myogenic NOS in canine lower esophageal sphincter:

enzyme activation, substrate recycling and product actions / A. M. Salapatek, YuFang Wang, Yu-Kang Mao et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 1998.- T. 274,- C .

1145—1157 .

43). Schuman, E.M. Nitric oxide and synaptic function / E.M. Schuman, D.V .

Madison // Annu. Rev Neurosci. – 1994. – T. 17, – C. 153-183 .

Shi T.J., Holmberg K., Xu Z.Q., Steinbusch H., Vente J., Hokfelt T. 1998. Effect of peripheral nerve injury on cGMP and nitric oxide synthase levels in rat dorsal root ganglia: time course and coexistence / T.J. Shi, K. Holmberg, Z.Q. Xu, H .

Steinbusch, J. Vente, T. Hokfelt // Pain, T. 78, C. 171 – 180 .

44). Sitdikova, G.F. Modulation of neurotransmitter release by carbon monoxide at the frog neuro-muscular junction/ G.F. Sitdikova, R.R. Islamov, M.A .

Mukhamedyarov et al. // Curr. Drug. Metab. – 2007. – T. 8, №2. – C. 177-184 .

45). Snyder, S.H. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers/ S.H. Snyder, S.R. Jaffrey, R. Zakhary// Brain. Res. Rev. – 1998. – T .

26, – C. 167–175 .

46). Soy, O. Time-level relationship for nitric oxide and the protective effects of aminoguanidine in experimental spinal cord injury / O. Soy,. Aslan, H. Uzun, .

Barut,.A. Akyldz, A. Belce, A. olak // Acta Neurochir. (Wien). – 2004. - T .

146, № 12,- C. 1329-1335 .

47). Thomas, S. Differential frequency-dependent regulation of transmitter release by endogenous nitric oxide at the amphibian neuromuscular synapse / S. Thomas, R. J. Robitaille // Neuroscience – 2001. - T. 21, № 4, - C.1087-1095 .

48). Urushitani, M. The role of nitric oxide in amyotrophic lateral sclerosis / M .

Urushitani, S. Shimohama // ALS and other Neuron Disorders. – 2001. - T. 2, № 2 .

- C. 71–81 .

49). Wang, R. Signal Transduction and the Gasotransmitters. NO, CO and H 2S in Biology and Medicine/ R.Wang. – Totowa:. Humana Press, 2004. – C. 377 .






Похожие работы:

«Бюллетень Союза по сохранению сайгака Saiga News зима 2007/08: Выпуск 6 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Культурный обмен между Великобританией и Калмыкией стал Содержание источником вдохновения для всех участнико...»

«Государственное бюджетное дошкольное образовательное учреждение детский сад № 4 комбинированного вида Пушкинского района Санкт-Петербурга Сценарий экологического досуга на тему: "Весна пришла природа ожила" по произведению К.И. Чуковского "Путаница" подготовительной к школе группы № 7 компенсирующей направленности старшей группы компе...»

«Светлой памяти Александра Вольдемаровича Пейве посвящают эту книгу авторы Александр Вольдемарович ПЕЙВЕ ( 19091985) РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ГЕОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES GEOLOGICAL INSTITUTE PROBLEMS OF THE LITHOSPHERE GEODYNAMICS Transactions, vol. 511 Founded in 1932 COLLECTION OF SCIENTIFIC PAPERS Resp...»

«ЛОГВИНОВА Дарья Сергеевна РОЛЬ "СУЩЕСТВЕННЫХ" ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА В ПРОЦЕССЕ РАБОТЫ МИОЗИНОВОЙ ГОЛОВКИ 03.01.04 Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2018 Работа выполн...»

«ГБУЗ "ТОКБ им. В.Д. Бабенко" Иммунитетсамозащита организма. Иммунитет – это система биологических механизмов самозащиты организма, с помощью которых он распознает и уничтожает все чужеродное (генетически отличающееся от него), если оно проникает в орга...»

«Всемирный конгресс САИ ‘06 От САИ к УАИ ОТ САИ К УАИ СТРАТЕГИЧЕСКАЯ "ДОРОЖНАЯ КАРТА" ГЛОБАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ _Всемирный конгресс САИ ‘06 От САИ к УАИ _Всемирный конгресс САИ ‘06 От САИ к УАИ СОДЕРЖАНИЕ КРАТКОЕ РЕЗЮМЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 4 Необходимость разработки стратегии управления аэронавигационной информацией 4 Определение и контекст управ...»

«Научные № 3 | 2017 ISSN 2587-618Х горизонты Научные горизонты 3 | 2017 Международный научный журнал * Выходит один раз в месяц * Редакционная коллегия: Главный редактор (учредитель) ИП Всяких Максим Владимирович, кандидат экономических наук Бессмерт...»

«Итоги XXI региональной научно-практической конференции "Творчество юных" (11-12 марта 2017 г.) № Номинация ФИО Школа Научный руководитель (победители, призеры, грамоты) 12 марта Секция "Биология"...»

«147 [46] СТРОГАНОВ Николай Сергеевич Строганов Николай Сергеевич (1902 1982) – известный ученый, гидробиолог, профессор МГУ им. Ломоносова. Заслуженный деятель науки РСФСР. Строганов Н.С. родился 25 декабря 1902 года в большой крестьянской семье в д. Акулово Дмитровского района Московской области. Жизнь Строганова Н.С. в документа...»

«Вятчин Илья Геннадьевич МЕХАНИЗМ Са2+-РЕГУЛЯЦИИ ТОНКИХ НИТЕЙ ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ НА ПРИМЕРЕ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание учёной степен...»

«Тематика дипломных работ но специальности 5В073200 Стандартизация, сертификация и метрология 1. Разработка СМК центральной лаборатории автоматизации и измерительной техники в условиях АО "Алюминий Казахстана".2...»

«Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150) 458 2017. Volume 7. Issue 1 ID: 2017-01-28-A-11615 Краткое сообщение Кудашова А.С. Геометрия в анатомической терминологии ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, кафедра русской и классической филологии На...»

«Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по над...»







 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.