WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«КИНАЗА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА MYLK1: АНАТОМИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ФУНКЦИИ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ А. Ю. ХАПЧАЕВ1,2, В. П. ШИРИНСКИЙ1 8 2016 г. Российский кардиологический ...»

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств

Успехи биологической химии, т. 56, 2016, с. 211–258

КИНАЗА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА MYLK1:

АНАТОМИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ФУНКЦИИ

И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ

А. Ю. ХАПЧАЕВ1,2, В. П. ШИРИНСКИЙ1

8 2016 г .

Российский кардиологический научно-производственный комплекс

Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва;

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, Москва I. Введение. II. Классификация и обозначения. III. Организация сложного гена mylk1 и контроль транскрипции. IV. Доменная структура КЛЦМ. V. Белок­белковые взаимодействия продуктов гена mylk1. VI. Посттрансляционные модификации продуктов гена mylk1. VII. Участие КЛЦМ/KRP в физиологических реакциях кле­ ток. VIII. Участие КЛЦМ в патологических процессах. IX. Заклю­ чение .

I. ВВЕДЕНИЕ Целью настоящего обзора является объединение, анализ и обобщение данных в области молекулярных и клеточно­биологических иссле­ дований киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) с включением в рас­ смотрение самых последних результатов, которые не вошли в более ранние обзоры [1–10] .

Фермент КЛЦМ был впервые обнаружен около 40 лет назад в скелетных и гладких мышцах [11, 12]. С тех пор знания о нем претер­ пели значительную эволюцию. Сегодня известно, что в геноме позво­ Принятые сокращения: КаМ – кальмодулин; КЛЦМ – киназа легких цепей мио­ зина; МАП­киназа – митоген­активируемая протеинкиназа; ПКА – цАМФ­зави­ симая протеинкиназа, протеинкиназа А; ПТМ – посттрансляционная моди­ фикация; РЛЦ – регуляторные легкие цепи; ФЛЦМ – фосфатаза легких цепей миозина; Erk1/2 – extracellular regulated kinase­1/2; IFN – интерферон гамма;



IL­1 – интерлейкин­1бета; KRP – kinase related protein; MYPT1 – myosin phos­ phatase target subunit 1; ROCK – RhoA­associated protein kinase; TNF – фактор некроза опухолей альфа; ZIPK – zipper­interacting protein kinase .

Адрес для корреспонденции: askerkhapcha@gmail.com Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 16­04­01742; 14­04­01813 и РНФ 14­35­00026 (раздел VII, подраздел «Экзоцитоз», раздел VIII, подраздел «Резистентность к инсулину и диабет») .

212 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский ночных есть не менее трех генов, кодирующих КЛЦМ. Ген mylk2 кодирует скелетномышечную КЛЦМ, а ген mylk3 – сердечную КЛЦМ [13, 14]. Эти киназы специфично экспрессируются в обозначенных типах мышц. В отличие от этих генов ген mylk1 устроен значительно сложнее [15, 16], и его многочисленные продукты распространены во многих, если не во всех клетках и тканях. Настоящий обзор посвящен рассмотрению именно гена mylk1 и его продуктов – множественных изоформ КЛЦМ и, частично, некиназного белка KRP/телокина .

Первоначально считалось, что единственной функцией КЛЦМ является фосфорилирование 20 кДа регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина. Дальнейшие исследования показали, что в ряде случаев вклад КЛЦМ в обеспечение клеточных реакций определяется не столько ее ферментативной активностью, сколько способностью выступать в роли скаффолда, т.е. платформы для сборки макромолекулярных комплексов. Соотношение каталитической и скаффолдной активнос­ тей в КЛЦМ, в особенности, в ее высокомолекулярной изоформе, является чрезвычайно актуальным вопросом, ответ на который позво­ лит значительно трансформировать взгляды на роль КЛЦМ в (пато) физиологии клетки .



КЛЦМ подвергается фосфорилированию другими протеинки­ назами, а также может быть ацетилирована и метилирована. Сов­ ременные методы протеомного анализа выявляют более 50 пост­ трансляционных модификаций (ПТМ) в структуре КЛЦМ, многие из которых реализуются in vivo (http://www.phosphosite.org [17]) .

При этом их функциональное значение установлено лишь в единич­ ных случаях, также как и природа модифицирующих ферментов .

Учитывая, что ПТМ белков часто имеют регуляторное значение in vivo, представляется важным изучить их роль в КЛЦМ в кон­ тексте регуляции клеточных функций. В настоящем обзоре систе­ матизированы имеющиеся данные по ПТМ КЛЦМ и предложены направления дальнейших исследований в этой критической области .

Несмотря на то, что вопросы участия КЛЦМ в патологических процессах не являются центральной темой обзора, трансляционные тенденции в области исследований этого белка отражены в обзоре отдельным разделом, в котором также оценены перспективы исполь­ зования КЛЦМ в качестве молекулярной мишени для создания новых лекарственных препартов .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 213

II. КЛАССИФИКАЦИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Впервые КЛЦМ выделили из скелетных мышц [12], затем была выде­ лена гладкомышечная форма КЛЦМ [11] и обнаружена высокомоле­ кулярная КЛЦМ, включающая полную последовательность гладко­ мышечной КЛЦМ и содержащая уникальную N­концевую область [18]. Более того, С­концевой фрагмент гладкомышечной КЛЦМ экспрессируется как независимый белок KRP/телокин (см. ниже), не обладающий каталитической активностью [19]. Все три белковых продукта (две изоформы КЛЦМ и KRP/телокин) кодируются слож­ ным геном mylk, изначально описанным термином «генетический локус» [18]. В литературе используется также обозначение mylk1, подчеркивающее различия с КЛЦМ из скелетной и сердечной мышц .

В данном обзоре нумерация экзонов сохранена в соответствии с пер­ вой работой по характеристике гена mylk1 [15], нумерация аминокис­ лотных остатков соответствует высокомолекулярной КЛЦМ человека, включающей 1914 аминокислотных остатков. В геноме человека ген mylk1 располагается в третьей хромосоме в области 3qcen­q21 [16] и захватывает около 270 тыс. п.о. ДНК [20, 21]. Специфичная для скелетных мышц КЛЦМ (skКЛЦМ) кодируется геном mylk2 [14], а в сердечной мышце с гена mylk3 экспрессируется специфичная сердечная изоформа КЛЦМ (caКЛЦМ) [13]. Кроме того, недавно обнаружена кальмодулин (КаМ)­независимая сердечная изоформа КЛЦМ [22] .

Для белковых продуктов гена mylk1 в литературе встречаются различные обозначения, вносящие определенную путаницу. Так, синонимами «высокомолекулярной» (high molecular weight) КЛЦМ являются также названия «немышечная» (non­muscle), «тяжелая»

(heavy), «большая» (long) или указывается молекулярная масса белка (210–220 кДа); для низкомолекулярной КЛЦМ использу­ ются названия «гладкомышечная» (smooth muscle), «легкая» (light), «малая» (small), «короткая» (short) или со ссылкой на молеку­ лярную массу (108–155 кДа). Лишенный каталитической актив­ ности С­концевой 17 кДа фрагмент КЛЦМ [19] известен под названиями KRP (Kinase­Related Protein) и телокин (telos + kinase) .





На наш взгляд, с современными знаниями об устройстве и ткане­ специфичности изоформ КЛЦМ, происходящих с гена mylk1, согла­ суются названия «высокомолекулярная» и «низкомолекулярная»

КЛЦМ (в англоязычной литературе более короткими и удобными представляются термины «long MLCK», L­MLCK и «short MLCK», s­MLCK). Поскольку в литературе аббревиатура KRP иногда также используется для обозначения белков, родственных кинезину (Kine­ sin­Related Proteins), мы будем использовать название KRP/телокин .

214 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский

III. ОРГАНИЗАЦИЯ СЛОЖНОГО ГЕНА MYLK1

И КОНТРОЛЬ ТРАНСКРИПЦИИ

Описанным белковым продуктам гена mylk1 соответствуют три класса мРНК, например, у птиц 9,0, 5,5 и 2,7 тыс. п.о., соответст­ венно [15, 18, 23] (рис. 1А). У млекопитающих размеры мРНК могут несколько отличаться [24]. Каждая мРНК возникает с незави­ симого промотора, при этом промоторы s­КЛЦМ и KRP/телокина располагаются в интронных для L­КЛЦМ областях [25–27], обус­ лавливая возникновение с соответствующих интронов уникальных 5'­некодирующих последовательностей мРНК. Таким образом, s­КЛЦМ и KRP/телокин используют более протяженные в 5'­область экзоны [25–27] .

Рис. 1. Схема строения гена mylk1 и регуляция его множественных промоторов .

A. Три класса мРНК транскрибируются с гена mylk1. Они кодируют изоформы KRP/телокина, s­КЛЦМ и L­КЛЦМ. KRP/телокин использует экзон 29А большего размера, чем экзон 29, используемый s­КЛЦМ и L­КЛЦМ .

s­КЛЦМ использует экзон большего размера, чем экзон 15, используемый L­КЛЦМ. Экзон 11 (9 в более ранних работах), присутствующий в L­MLCK1, отсутствует в результате сплайсинга в L­MLCK2. Нумерация экзонов приводится по оригинальным работам. Размеры экзонов и интронов, а также расстояния здесь и ниже указаны не в масштабе .

Б. Регуляция промотора KRP/телокина. Позиция +1 соответствует старту мРНК телокина человека (chr3 reverse strand: 123,620,607). Нумерация нуклеотидов соответствует последовательности гена mylk1 человека и основана на результатах исследований промотора KRP/телокина у кролика, мыши и крысы. Активаторы транскрипции и энхансеры показаны градациями зеленого цвета, ингибиторы и сайленсеры выделены красным и лиловым цветом. Зеленые стрелки обозначают стимулирующую активность, красные линии с кружком – ингибиторный эффект .

В. Регуляция промотора s-КЛЦМ. Нумерация нуклеотидов соответствует последовательности гена mylk1 человека и основана на результатах исследований промотора s­КЛЦМ мыши. Позиция +1 соответствует началу мРНК s­MLCK человека (chr3 reverse strand: 123,701,003). Пунктирные линии обозначают, что эффекты миокардина существенно слабее, чем в случае промотора KRP/ телокина. Для транскрипционных факторов Foxf1 и TEF показано связывание с промотором s­MLCK на основании их эффектов на этот промотор, однако точное место их связывания не определено. AR, рецептор андрогенов .

Г. Регуляция промотора L-КЛЦМ. Показана локализация гомологичных цис­элементов. Две указанные позиции +1 соответствуют участкам инициации транскрипции с двух независимых удаленных промоторов: мРНК NM_053025 (chr3 reverse strand 123,831,670) и NM_001321309 (chr3 reverse strand 123,884,253) .

Детальное описание в тексте .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 215 Рис. 1. Подпись к рис. см. на предыдущей стр .

216 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский

ПРОМОТОР KRP/ТЕЛОКИНА

Промотор KRP/телокина (рис. 1Б) активен только в гладких мышцах взрослого организма [28]. Ведущую роль в экспрессии KRP/телокина у мыши играет последовательность длиной 30 п.о., включающая А/Т­богатый участок и цис­элемент CC(AT)6GG (CArG­бокс), связы­ вающий транскрипционный фактор SRF [29]. Удаление CArG­бокса практически полностью подавляло экспрессию KRP/телокина, не затрагивая экспрессию s­КЛЦМ [30]. Активацию промотора KRP/ телокина под действием SRF усиливает кофактор, миокардин [31] .

В присутствие SRF и миокардина другим факторам, по­видимому, отводится второстепенная роль [32, 33]. Все описанные на сегод­ няшний день регуляторы промотора KRP/телокина связываются в непосредственной близости от участка связывания SRF, усиливая или ослабляя комплекс миокардина с SRF и, по­видимому, определяя различный уровень экспрессии KRP/телокина в разных типах гладких мышц.

A/T­богатая область связывает ряд энхансерных факторов:

Hoxa10­1 [32], близкородственные факторы TEF и TEF [33] и фак­ тор Foxf1 [34]. С тем же участком взаимодействуют репрессорные факторы Foxq1 [35] и Hoxb8 [32]. Hoxa10­1 и Hoxb8 конкурируют также за второй цис­элемент в 3'­области относительно старта транс­ крипции. Рядом располагается третий цис­элемент для Hoxb8. Фактор Hoxa10­1, возможно, участвует в контроле экспрессии KRP/телокина в отдельных типах гладких мышц, например, в гладких мышцах матки и кишечника, а сайленсерный эффект родственных ему Hoxa10­2 и Hoxb8, возможно, связан с регуляцией активности промотора KRP/те­ локина в немышечных тканях [32] .

Конкуренция с миокардином за связывание с SRF показана также для факторов GATA­6 [36] и Elk­1 [37], имеющих участки посадки на промоторе KRP/телокина рядом с CArG­боксом.

Интересно отметить, что в промоторе KRP/телокина человека в гомологичном участке в консенсусном цис­элементе фактора GATA­6 присутствует замена:

CATC вместо TATC. Насколько эта замена окажется важной для регуляторного влияния GATA­6 у человека остается неизвестным .

Потенциальное ослабление эффекта GATA­6 у человека, возможно, компенсируется другими факторами, а также может объяснять следовую экспрессию KRP/телокина в сердце человека [38]. Конку­ рентными ингибиторами комплекса миокардин/SRF, для которых не обнаружены цис­элементы в промоторе, являются тимин­ДНК­ гликозилаза (TDG) [39] и HMG2L1 [40]. Фактор TEAD1 аналогичным образом ингибирует промоторы ряда гладкомышечных белков, в том числе s­КЛЦМ, позволяя предположить его отрицательное влияние на промотор KRP/телокина [41] .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 217

ПРОМОТОР S­КЛЦМ

Промотор s­КЛЦМ (рис. 1В) не имеет классической ТАТА­после­ довательности, но демонстрирует ряд общих черт с промотором KRP/ телокина. Минимальный промотор s­КЛЦМ располагается в неболь­ шом (432 п.о.) интроне между экзонами 14 и 15. В промоторе s­КЛЦМ мыши CArG­бокс связывает SRF, обеспечивает базовую активность промотора и принципиально важен для экспрессии s­КЛЦМ. Влияние миокардина на промотор s­КЛЦМ выражено меньше, чем в случае промотора KRP/телокина [27, 31]. Интересно, что у спонтанно гипертензивных крыс в непосредственной близости с гомологичным CArG­боксом находится вставка из 12 п.о., благодаря которой SRF прочнее связывается с промотором s­КЛЦМ, отвечая за повышенную экспрессию s­КЛЦМ [42]. Фактор GATA­6, связываясь с промотором s­КЛЦМ мыши, оказывает супрессорное действие [27]. У человека, как и в случае промотора KRP/телокина, в гомологичном консен­ сусном участке связывания GATA­6 присутствует замена, позволяя предположить менее значимую роль GATA­6 в регуляции экспрессии s­КЛЦМ у человека. Фактор Foxf1 активирует промотор s­КЛЦМ, однако фактор Foxq1 не влиял на экспрессию s­КЛЦМ [34]. Поскольку в промоторе KRP/телокина Foxf1 и Foxq1 конкурируют за связывание с одним цис-элементом, отсутствие эффекта Foxq1 на активность промотора s­КЛЦМ может объясняться влиянием дополнительных неустановленных факторов. Аналогичное объяснение можно дать тому факту, что активаторы промотора KRP/телокина TEF и TEF оказывают разнонаправленное действие на активность промотора s­КЛЦМ: TEF подавляет, а TEF усиливает экспрессию s­КЛЦМ в линейных гладкомышечных клетках А10 [33] .

В промоторе s­КЛЦМ обнаружен второй CArG­бокс, располагаю­ щийся в 1­ом для s­КЛЦМ интроне и не оказывающий существенного влияния на экспрессию s­КЛЦМ в линейных гладкомышечных клетках А10 и фибробластах 10Т1/2 [27], однако удаление участка интрона, включающего этот элемент, избирательно снижало экспрессию s­КЛЦМ в гладких мышцах у трансгенной мыши, не затрагивая экспрессию L­КЛЦМ и KRP/телокина [43] .

В дополнение к регуляции промотора s­КЛЦМ комплексом SRF/ миокардин в промоторе s­КЛЦМ мыши обнаружен консервативный цис-элемент CTGGGAA, ответственный за усиление промотора s­КЛЦМ регуляторным комплексом Notch1. Участие Notch1­сигна­ линга в экспрессии s­КЛЦМ подтверждается снижением экспрессии s­КЛЦМ в гладкомышечных клетках трансгенных мышей с нарушен­ ным сигналингом Notch1 [44]. Комплекс Notch1 индуцирует также 218 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский фактор HRT2, ингибирующий комплекс SRF/миокардин и взаимо­ действие Notch1­комплекса со своим цис-элементом. Таким образом, влияние Notch1 на активность промотора s­КЛЦМ определяется интенсивностью сигнала самого Notch1 и имеет авторегуляторный характер [45] .

ПРОМОТОР L­КЛЦМ

Промотор L­КЛЦМ (рис. 1Г) не содержит классической TATA­пос­ ледовательности, однако картированы DPE­промотор и другие классические регуляторные цис-элементы, такие как CAAT­бокс и несколько элементов класса E­бокс. Базовую активность промотора в эпителиальных клетках независимо контролируют цис-элемент для связывания р53 [20] и два кооперативных участка связывания Sp1 [46]. В эпителиальных клетках воспалительные факторы интер­ ферон гамма (IFN), фактор некроза опухолей альфа (TNF) или интерлейкин­1бета (IL­1) индуцируют экспрессию L­КЛЦМ [20, 47], которая не зависит от факторов р53 [20] и Sp1 [46] и регулируется при участии фактора NF­B [20]. Так, действие репрессорного гомо­ димера NF­B р50/р50 отменяется связыванием гетеродимера NF­B p50/p65, отвечающего за индукцию промотора L­КЛЦМ в ответ на стимуляцию TNF [48] или IL­1 [49]. В активации гетеродимера р50/р65 в эпителиальных клетках участвует TNF­зависимый каскад с участием протеинкиназ NIK и IKK [50]. Вместе с тем, IL­1 через каскад Erk1/2 активирует фактор Elk­1, который связывается со своим цис-элементом в минимальном промоторе L­КЛЦМ и активирует промотор [51], возможно, кооперируя с p65 NF­B. В передаче сигнала от IL­1 участвует также каскад p38 МАП­киназ, активирующий фактор АТF­2 [52]. Возможно, факторы Elk­1 и ATF­2 функционируют скоординированно, поскольку независимое ингибирование каждого из них подавляет эффекты IL­1 [51, 52]. В более удаленной 5'­области промотора обнаружены дополнительные энхансерные участки, два из которых связывают NF­B, а три других связывают Ap­1. Вместе с тем, имеются указания на существование в той же области неустановленных сайленсерных элементов [46] .

Наличием описанной выше многокомпонентной системы регуляции промотора L­КЛЦМ может объясняться отсутствие эффектов фарма­ кологического ингибирования NF­B на индукцию L­КЛЦМ при стимуляции эпителиальных клеток TNF [47], а также снижение вклада NF­B и параллельное возрастание роли Ap­1 в активации промотора L­КЛЦМ при дифференцировке эпителиальных клеток [46]. Совместное действие TNF и IFN существенно усиливает Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 219 индукцию L­КЛЦМ по сравнению с индивидуальным действием этих факторов [46], подтверждая комплексный контроль экспрессии L­КЛЦМ. Участком конвергенции сигналов IFN и TNF могут быть, например, фактор HIF­1 и его антагонист FIH. В условиях гипоксии, а также при стимуляции эпителиальных клеток IFN или TNF происходит активация HIF­1, коррелирующая с активацией экспрессии L­КЛЦМ, при этом специфическое подавление HIF­1 отрицательно влияло на экспрессию L­КЛЦМ. Однако прямого взаимодействия HIF­1 с промотором L­КЛЦМ не показано [53, 54] .

Для эндотелиальных клеток описан второй «минимальный промотор» и участок инициации транскрипции, располагающиеся на расстоянии примерно 52 тыс .

п.о. в 5'­области относительно описанных выше регуляторных элементов [21]. Расхождения с процитированными выше работами связаны, возможно, с наличием транскрипционных вариантов мРНК L­КЛЦМ, отличающихся 5'­неко­ дирующей областью в эпителиальных и эндотелиальных клетках [21, 46]. Поэтому экзон 1A в описанных выше работах соответствует экзону 3 (по мРНК NM_053025) в работе [21], показавшей, что экспрессия L­КЛЦМ в эндотелиальных клетках человека в ответ на стимуляцию VEGF определяется связыванием фактора Sp1 в области

–450…–331 п.о. относительно наиболее удаленного от кодирующей последовательности участка инициации транскрипции .

В дополнение к описанной выше регуляторной картине в гладко­ мышечных клетках A10 показано энхансерное действие GATA­6 на экспрессию L­КЛЦМ в противоположность сайленсерным эффектам GATA­6 на промоторы s­КЛЦМ и KRP/телокина [27]. Наконец, в регуляции гена mylk1 могут участвовать андрогены. Так, в клетках рака простаты, экспрессирующих L­КЛЦМ и s­КЛЦМ, андрогены подавляли экспрессию обеих форм КЛЦМ [55] .

ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

МикроРНК представляют собой класс небольших эндогенных неко­ дирующих РНК, участвующих в контроле уровня мРНК многих белков. В эндотелиальных клетках показана возможность отрица­ тельной регуляции L­КЛЦМ при участии микроРНК miR­374a, miR­374b, miR­1290, miR­520c­3p и miR­155 при этом их действие имеет аддитивный характер [56, 57]. Эти микроРНК связываются с 3'­некодирующей областью мРНК L­КЛЦМ, поэтому нельзя исключать их участия в регуляции мРНК s­КЛЦМ и KRP/телокина. У мышей с генетическим нокаутом микроРНК miR­1 в кардиомиоцитах индуцируется экспрессия гладкомышечной изоформы миокардина и 220 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский KRP/телокина. Несмотря на то, что miR­1 способна непосредственно связываться с 3'­некодирующей областью мРНК KRP/телокина, общей для KRP/телокина и s­КЛЦМ, экспрессия последней в кардио­ миоцитах не изменялась при нокауте miR­1 [58]. Возможно, эти различия связаны с большей зависимостью экспрессии KRP/телокина от миокардина (см. выше), однако нельзя исключать также влияния других регуляторных факторов. Для эндотелиальных клеток HUVEC показано, что стимуляция окисленными ЛПНП приводит к снижению уровня микроРНК miR­1 и активации экспрессии L­КЛЦМ, указывая, что низкий уровень экспрессии L­КЛЦМ в эндотелиальных клетках может быть, по крайней мере отчасти, обусловлен ингибиторным влиянием miR­1 [59]. В нескольких типах раковых клеток и у пациен ток с раком молочной железы отмечено, что снижение уровня miR­200c коррелирует с повышением экспрессии L­КЛЦМ и усилением инвазивной способности клеток. Более того, miR­200c имеет участки посадки в 3'­некодирующей области мРНК L­КЛЦМ [60], видимо, ограничивая уровень экспрессии L­КЛЦМ и, возможно, других продуктов гена mylk1 .

ПОЛИМОРФИЗМ ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

Как было отмечено выше, с гена mylk1 возникает три класса мРНК, кодирующих L­КЛЦМ, s­КЛЦМ и KRP/телокин, в то же время для L­КЛЦМ, видимо, существует два промотора, определяющих раз­ ные участки инициации транскрипции в различных типах клеток и возможен альтернативный сплайсинг некодирующих экзонов 5'­нетранслируемой последовательности [21, 46]. Описаны сплайс­ варианты мРНК L­КЛЦМ и KRP/телокина, затрагивающие коди­ рующую последовательность. Так, альтернативный сплайсинг 1 и 2 экзонов мРНК KRP/телокина приводит к возникновению допол­ нительного остатка Glu29 [38]. Для L­КЛЦМ человека описано несколько сплайс­вариантов, затрагивающих кодирующую после­ довательность, однако подтверждены только 2 белковых продукта:

полноразмерная изоформа КЛЦМ1 и преимущественно экспресси­ рующаяся КЛЦМ2, не содержащая остатки 437–505 [61]. В допол­ нение к сплайс­вариантам L­КЛЦМ у человека обнаружен ряд однонуклеотидных полиморфизмов, в том числе выражающихся в аминокислотных заменах, например, Pro21His, Pro147Ser, Val261Ala, Ser1341Pro, Arg1450Gln, Ser1759Pro, предварительной терминации поли пептидной цепи (Arg1480Х) или модулирующих уровень экспрессии [62–66] .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 221 Существенной гетерогенностью характеризуется KRP/телокин .

Было обнаружено три ацетилированных N­концевых последова­ тельности, соответствующих модифицированным Ala2, Met3 или Ser8 KRP/телокина птиц, при этом преобладала наиболее короткая форма белка. Кроме того, из 6 кодируемых С­концевых остатков Glu в очищенном из ткани KRP/телокине их количество варьирует от 0 до 5 [67]. Поскольку С­концевая последовательность KRP/телокина важна для связывания с миозином, гетерогенность С­концевого участка может создавать пулы KRP/телокина с различным сродством к миозину, регулируя его способность конкурировать с КЛЦМ за связывание с миозином (см. ниже) .

В антисмысловой цепи гена mylk1 расположено два семейства некодирующих РНК [68]: MYLK­AS1, включающая 4 экзона, и более короткая MYLK­AS2, включающая 3 экзона. Интересно, что один из экзонов MYLK­AS1 перекрывается с кодирующей последо­ вательностью mylk1, указывая на возможное участие MYLK­AS1 в регуляции s­КЛЦМ и L­КЛЦМ на посттранскрипционном уровне .

ТКАНЕСПЕЦИФИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ

ГЕНА MYLK1 Независимая регуляция белковых продуктов гена mylk1, и остающиеся во многом неизученными регуляторные сигналы, контролируют тканеспецифичную экспрессию изоформ L­КЛЦМ, s­КЛЦМ и KRP/ телокина .

KRP/телокин экспрессируется преимущественно в гладких мыш­ цах, при этом в фазных гладких мышцах экспрессия существенно выше [15, 26, 69]. В небольших количествах KRP/телокин экспрес­ сируется в сердечной мышце человека [38] .

s­КЛЦМ демонстрирует универсальную экспрессию и присутст­ вует практически во всех тканях [70]. В эмбриональный период экспрессия s­КЛЦМ низка и возрастает в постнатальный период в противоположность снижению экспрессии L­КЛЦМ [15, 71–73] .



В некоторых типах тканей и клеток s­КЛЦМ и L­КЛЦМ экспрес­ сируются совместно, например, в аорте птиц, откуда L­КЛЦМ была впервые выделена как белок [74, 75], и в нейтрофилах [76]. В эндотелии, эпителии, моноцитах и Т­клетках показано присутствие L­КЛЦМ [77–79], в то время как из тромбоцитов была выделена s­КЛЦМ c небольшой примесью L­КЛЦМ [80] .

При анализе данных иммуноблоттинга тканей с антителами к КЛЦМ cкладывается впечатление, что L­КЛЦМ, как правило, лучше выявляется в тканях с высоким содержанием немышечных 222 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский клеток – эпителия, эндотелия, иммунных клеток, и относительно невысоким содержанием гладких мышц (легкие, печень, почки, селезенка) [73, 75]. При культивировании первичных клеток экспрес­ сия L­КЛЦМ возрастает, полностью или частично замещая s­КЛЦМ [70, 71, 73]. Обе изоформы КЛЦМ в разном соотношении обычно присутствуют в линейных клетках, например, в клетках гладкомы­ шечного происхождения А10, A7r5 и GbaSM­4 [74, 81], и немышеч­ ного происхождения HeLa, COS­7, 3T3 [73, 82, 83] и др. Раковая трансформация клеток также сопровождается изменением уровня экспрессии КЛЦМ, при этом в одних типах наблюдается снижение экспрессии [84, 85], а в других экспрессия возрастает [60, 86]. Учиты­ вая описанную выше сложную регуляцию гена mylk1, различия в экспрессии его продуктов в тканях в различные периоды развития организма, а также при раковой трансформации и переводе клеток в культуру можно связать с изменением баланса регуляторных сигналов и факторов, контролирующих экспрессию этого гена .

IV. ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА КЛЦМ

Все три белковых продукта гена mylk1 используют одну рамку считы­ вания, поэтому структура меньшего продукта полностью включена в структуру большего. На рис. 2 приведена схема строения самого протяженного белкового продукта, L­КЛЦМ; N­концевой Met1 s­MLCK соответствует Met923 L­КЛЦМ, а N­конец KRP/телокина соответствует Met1761 L­КЛЦМ. Биохимическая организация s­КЛЦМ и отдельные аспекты ее ферментативных свойств были сум­ мированы ранее [7, 10]. В настоящей работе будут отмечены наибо­ лее интересные и важные биохимические и структурные свойства s­КЛЦМ, рассмотрены новые данные, и больше внимания будет уделено уникальной области L­КЛЦМ, а также известным способам регуляции каталитических и неферментативных свойств КЛЦМ .

Каталитический домен располагается в центральной области s­КЛЦМ, гомологичен каталитическим доменам ряда других про­ теин киназ и содержит консенсусную Mg2+­АТФ­связывающую пос ледо вательность Gly–X–Gly–X–X–Gly–(X)14–Lys [23], пос­ тоянно доступную для связывания Mg2+­АТФ [87]. К N­концу от Mg2+­АТФ­связывающего участка располагается кластер кислых остатков, важных для распознавания РЛЦ [88]. Фермент сначала связывает Mg2+­АТФ, а затем РЛЦ [89]. Несмотря на то, что несколько работ претендуют на расширение списка субстратов КЛЦМ [76, 90, 91], РЛЦ миозина являются единственным общепризнанным субстратом Киназа легких цепей миозина: обзор свойств Рис. 2. Доменная организация, белок­белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации L­КЛЦМ Основные структурные элементы L­КЛЦМ (см. вставку с расшифровкой обозначений) представлены в линейной форме .

На схеме доменной организации L­КЛЦМ отмечены некоторые аминокислотные остатки, модификация которых может иметь физиологическое значение. Нумерация остатков дана для L­КЛЦМ1 человека (NM_053025). Ферменты, модифи­ цирующие эти остатки, указаны сверху. Скобки отмечают участки L­КЛЦМ, вовлеченные во взаимодействие с другими белками (обозначены под скобками). (?) – участок / участки взаимодействия точно не картированы или имеют слабую доказательную базу. ПКG – протеинкиназа G, ПКС – протеинкиназа С, СаМКII – Са­КаМ­зависимая киназа II типа .

Детальное описание в тексте .

224 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский КЛЦМ in vivo с неоспоримой физиологической значимостью. В составе РЛЦ ключевую роль играет Arg16 [92], направляющий КЛЦМ на Ser19 РЛЦ. Фосфорилирование двух РЛЦ на одной головке миозина происходит упорядоченно с использованием различных механизмов [93]. Одной из причин такого поведения может быть некаталитическое взаимодействие КЛЦМ с миозином за счет С­концевой области (см .

ниже). В условиях in vitro при высоких концентрациях КЛЦМ фос­ форилируется также Thr18 РЛЦ [94], однако in vivo Thr18, по­види­ мому, служит субстратом для других протеинкиназ, в частности ROCK [95] и ZIPK [96]. Фосфорилирование Thr18 в дополнение к Ser19 усиливает активность Mg2+­АТФазы миозина [97], однако монофосфорилирование РЛЦ по Thr18 коррелирует с расслаблением в гладких мышцах [98] и, возможно, в отсутствие фосфорилирования Ser19 не будет стимулировать активность немышечного миозина в других клетках .

Регуляторный участок КЛЦМ прилегает непосредственно к С­концу каталитического домена и состоит из автоингибиторной пос­ ледовательности и следующим за ней участком связывания Са2+/КаМ .

Предложенная изначально модель псевдосубстратного ингибирования основывалась на сходстве в расположении положительно заряженных аминокислотных остатков в автоингибиторной последовательности и в участке фосфорилирования РЛЦ [99], однако соседний гидрофоб­ ный кластер Tyr–Met–Ala в автоингибиторной последовательности оказался наиболее важным для ингибирования [100], указывая, что механизм автоингибирования не ограничивается мимикрией РЛЦ. На основании анализа автоингибиторной последовательности КЛЦМ был разработан пептидный ингибитор PIK (от англ. Peptide Inhibitor of Kinase), [101], который дополнительно обладал способностью проникать через биологические мембраны [102, 103]. В дальнейшем был создан также ряд более устойчивых аналогов PIK, применяемых в исследованиях in vitro и in vivo [102, 104, 105] .

КЛЦМ является Са2+/КаМ­зависимым ферментом. Даже при базо­ вой концентрации Са2+ в клетке C­концевой домен КаМ может быть постоянно связан с КЛЦМ [106]. Повышение уровня Са2+ и после­ дующее связывание Са2+ в N­концевой области КаМ вызывают пере­ стройки как в КаМ так и в КЛЦМ, открывая доступ РЛЦ к активному центру [107]. Эти данные указывают на то, что эффективное связы­ вание пептидных ингибиторов КЛЦМ, представляющих собой ана­ логи РЛЦ (как, например, пептид 11­19 [108]) будет происходить только после повышения уровня Са2+ и освобождения участка связы­ вания РЛЦ .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 225 Наконец, следует отметить, что субстратная специфичность, акти­ вация под действием Са2+/КаМ и ферментативные свойства L­КЛЦМ in vitro полностью идентичны таковым s­КЛЦМ [74] .

Участок связывания миозина, отличный от каталитического центра, располагается непосредственно на С­конце молекулы КЛЦМ и является общим для обеих форм КЛЦМ и KRP/телокина. Кислая С­концевая область KRP/телокина обеспечивает основной вклад в связывание с миозином in vitro [109], индуцируя переход миозина II в развернутую, способную к филаментообразованию конформацию [110], а также отвечает за конкурентное ингибирование фосфорили­ рования РЛЦ под действием КЛЦМ [111] и других протеинкиназ со сходной субстратной специфичностью [112] .

Ig­ и Fn­подобные домены. Непосредственно к N­концу от ката­ литического домена располагается фибронектин­подобный домен III типа, функции которого остаются неизвестными. В s­КЛЦМ присутствуют три иммуноглобулин G­подобных домена С2­типа (IgG C2), каждый из которых включает порядка 100 аминокислот­ ных звеньев: два IgG C2­подобных домена расположены к N­концу от Fn­подобного домена, а третий составляет С­концевой домен КЛЦМ. Именно этот домен с небольшими фланкирующими после­ довательностями экспрессируется как независимый белок KRP/те­ локин. В уникальной N­концевой области L­КЛЦМ располагается еще 6 дополнительных IgG C2­подобных доменов [18, 61]. Их функ циональная значимость остается малоизученной, однако высказаны предположения, что они участвуют в белок­белковых взаимодействиях КЛЦМ непосредственно или, по аналогии с IgG­по­ добными доменами титина [113], могут обратимо расплетаться, увеличивая линейные размеры КЛЦМ и/или открывая участки для взаимодействия с другими белками (см. ниже) .

Повторы KPV/A обнаруживаются в составе КЛЦМ млекопитаю­ щих, располагаясь к N­концу от первого IgG C2­подобного домена s­КЛЦМ. Повторы этого типа представляют собой 12­членные участки, в которых присутствуют по два консервативных триплета KPV и KPA. У разных видов животных количество таких повторов сильно различается, внося существенный вклад в межвидовые разли­ чия по молекулярной массе КЛЦМ. Роль KPV/A повторов остается неясной .

Актин­связывающий домен s­КЛЦМ располагается на самом N­конце молекулы и представляет собой три 28­членных повтора, в составе которых ключевую роль во взаимодействии с актином играет мотив DFRxxL [114]. Считается, что три DFRxxL мотива обес­ 226 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский печивают связывание s­КЛЦМ с тремя мономерами актина, и благо­ даря нескольким участкам связывания с актином N­концевая область s­КЛЦМ способна перешивать отдельные филаменты актина in vitro [115]. Высказано предположение, что за счет поочередного связывания и диссоциации отдельных DFRxxL­мотивов s­КЛЦМ мигрирует вдоль актинового филамента, расширяя свой ареал действия [116]. На филаменте актина участок взаимодействия DFRxxL­домена s­КЛЦМ отличен от участков связывания миозина, тропомиозина, кальпонина и кальдесмона [117], не налагая стерических препятствий на лате­ ральную миграцию s­КЛЦМ. Возможно, в регуляции ассоциации КЛЦМ с актином принимает участие КаМ за счет второго участка связывания, который, согласно исследованиям in vitro, перекрывается с DFRxxL­мотивами [118, 119]. Связывание s­КЛЦМ с актином за счет DFRxxL­мотивов относительно непрочное, поэтому в немышечных клетках, менее «насыщенных» акто­миозиновыми структурами, s­КЛЦМ обнаруживается преимущественно диффузно и легко дис­ социирует при нарушении целостности клеток [115]. В составе уникального N­концевого домена L­КЛЦМ обнаруживаются еще два DF/VRxxL­мотива, усиливающих связывание с актином [74]. Однако полное удаление пяти DFRxxL­мотивов из состава полноразмерной L­КЛЦМ не приводило к ее диссоциации от цитоскелета [115], указы­ вая на наличие дополнительного участка связывания актина. Он был картирован в пределах двух первых IgG C2­подобных доменов [120, 121] .

V. БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

Неоспоримыми физиологически значимыми белковыми партнерами КЛЦМ являются актин, миозин и КаМ. В то же время, эксперимен­ тальные данные указывают на существование и других белковых партнеров (рис. 2) .

Тубулин – структурный компонент микротрубочек взаимодействует с L­КЛЦМ in vitro и колокализуется с L­КЛЦМ в трансфицированных клетках CV­1 [122]. Благодаря взаимодействию с тубулином L­КЛЦМ может служить одним из структурных организаторов цитоскелета, интегрируя актиновый и тубулиновый цитоскелет .

Супервиллин представляет собой скаффолдовый мембранный белок, содержащий участки взаимодействия с актином, миозином и рядом других цитоскелетных белков. N­концевой фрагмент супер­ виллина (остатки 1–174) взаимодействует с уникальным N­концевым доменом L­КЛЦМ in vitro и колокализуется с активированным Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 227 миозином на периферии клеток [123]. Авторы предположили, что ингибиторный эффект супервиллина на распластывание клеток реализуется благодаря активации и сборке миозина в примембранной области. При этом эффект супервиллина отменялся при подавлении активности КЛЦМ в клетках .

Кортактин, актин­связывающий цитоскелетный белок, взаимо­ действует с L­КЛЦМ в эндотелиальных клетках. Кортактин иммуно­ преципитируется антителами против L­КЛЦМ из эндотелиальных клеток, при этом стимуляция тирозиновых киназ повышает количество кортактина в преципитате [124]. Фосфорилирование кортактина или полноразмерной сплайс­изоформы L­КЛЦМ (L­КЛЦМ1) тирозино­ вой киназой с­Src усиливает его взаимодействие с L­КЛЦМ1, однако кортактин не влиял на активность всех изоформ КЛЦМ in vitro, как и КЛЦМ не влияла на связывание кортактина с актином. В то же время, присутствие L­КЛЦМ подавляло стимулируемую кортактином активацию Arp2/3 [125]. За связывание со всеми изоформами КЛЦМ отвечает SH3­домен кортактина. Предполагаемые участки связывания кортактина с КЛЦМ локализованы в районе DFRxxL мотивов [126] и, возможно, это взаимодействие может регулироваться Са2+/КаМ, связывающимся в этом участке и модулирующим связывание КЛЦМ с актином. Возможно, в уникальном N­концевом домене L­КЛЦМ имеются дополнительные кортактин­связывающие элементы. Усиле­ ние фосфорилирования кортактина по остаткам тирозина в эндоте­ лиальных клетках в присутствии L­КЛЦМ может быть обусловлено ее скаффолдной активностью и рекрутированием нерецепторных тиро­ зиновых протеинкиназ, в частности, с­Src [124] и/или изменением конформации кортактина и облегчением его взаимодействия с с­Src .

Участие L­КЛЦМ в активации тирозиновых киназ было отмечено также в нейтрофилах [76] .

Pyk2, цитоплазматическая тирозиновая киназа семейства FAK, в нейтрофилах рекрутируется в комплекс с 2­интегринами и необхо­ дима для полноценной активации интегринов и адгезии нейтрофилов .

В нейтрофилах L­КЛЦМ–/– мышей активация Pyk2 снижена и нару­ шено взаимодействие Pyk2 с 2­интегринами. Прямое взаимодействие Pyk2 с L­КЛЦМ подтверждается коиммунопреципитацией, а также взаимодействием очищенной Pyk2 и рекомбинантного каталитичес­ кого домена КЛЦМ in vitro. Интересно отметить также, что подав­ ление ферментативной активности L­КЛЦМ в нейтрофилах частично подавляло активацию Pyk2, а каталитический домен КЛЦМ способен фосфорилировать и активировать Pyk2 in vitro. Эти данные указывают на участие как каталитической, так и неферментативной активности КЛЦМ в активации Pyk2 [76] .

228 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский MIF (Macrophage Migration Inhibition Factor) был идентифициро­ ван в качестве партнера L­КЛЦМ с использованием двугибридной системы. Взаимодействие подтверждается данными иммунопреци­ питации химерного фрагмента КЛЦМ из лизатов эндотелиальных клеток BPAEC и косвенными иммунофлуоресцентными данными .

Взаимодействие MIF с уникальным N­концевым фрагментом L­КЛЦМ ослаблялось при укорочении фрагмента с 585 до 516 N­кон­ цевых аминокислотных остатков. При делеции экзона, отсутствую­ щего в L­КЛЦМ2 (см. выше), связывание ослаблялось еще больше .

Таким образом, 515 N­концевых аминокислотных остатков L­КЛЦМ достаточно для взаимодействия с MIF и последовательность L­КЛЦМ 437–505 может быть одним из участков взаимодействия. Вместе с тем, MIF не экранировал фосфорилирования L­КЛЦМ с­Src (в пре­ делах 415–500) и не влиял на взаимодействие L­КЛЦМ с актином и кортактином [127]. Функциональная значимость потенциального взаимодействия MIF с L­КЛЦМ остается неясной .

Скаффолд 14­3­3 имеет потенциальные участки связывания на краях 1­го IgG C2­подобного домена L­КЛЦМ. В пользу взаимо­ действия L­КЛЦМ и 14­3­3 указывает обогащение двух изоформ 14­3­3 (24 и 27 кДа) в иммунопреципитате FLAG­меченого фрагмента КЛЦМ и частичное подавление фосфорилирования Tyr464 L­КЛЦМ, отменявшееся в присутствии антагониста белков 14­3­3 [128]. К сожа­ лению, взаимодействие 14­3­3 и L­КЛЦМ основано на косвенных данных и не подтверждено пока другими работами .

Фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ) – специализированный антагонист КЛЦМ, по­видимому, также является партнером белковых продуктов гена mylk1. Еще в ранних работах было предположено существование комплекса КЛЦМ и ФЛЦМ на основании совмест­ ного выделения этих ферментов из гладкомышечной ткани [129] .

Эти косвенные данные получили продолжение в виде ряда экспе­ ри ментальных наблюдений у мыши с генетическим нокау том KRP/телокина, указывавших на роль KRP/телокина в положи­ тельной модуляции активности ФЛЦМ [30]. Поскольку KRP/телокин экранирует РЛЦ в составе миозина от действия активирующих протеинкиназ [111, 112], но не связывается с фосфорилированным миозином [130], было предположено, что влияние KRP/телокина на дефосфорилирование миозина реализуется через прямое или косвенное влияние на ФЛЦМ [30]. Недавно были представлены экспериментальные физиологические и биохимические указания на непосредственное взаимодействие KRP/телокина с фосфорилиро­ ванной регуляторной субъединицей ФЛЦМ MYPT1, приводившее к отмене эффекта ингибиторного фосфорилирования MYPT1 [131] .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 229 Возможно, такое взаимодействие объясняется определенным сходст­ вом последовательности KRP/телокина и малой субъединицы ФЛЦМ M20, функции которой остаются пока неизвестными .

Потенциальными партнерами КЛЦМ, идентифицированными в ходе глобальных скрининговых работ с использованием методов дрожжевой двугибридной системы, коиммунопреципитации и метода пептидных матриц, является еще порядка трех десятков белков, однако подтверждение взаимодействия КЛЦМ с этими белками и установление функциональной значимости таких взаимодействий остается предметом будущих исследований .

С известными оговорками к числу белковых партнеров можно отнести различные ферменты, использующие КЛЦМ и KRP/телокин в качестве своих субстратов, в частности тирозиновую киназу с­Src [125]. Поскольку обратимые посттрансляционные модификации (ПТМ) играют важную роль в регуляции активности практически всех белков организма, ниже будут рассмотрены наиболее интересные ПТМ белковых продуктов гена mylk1 .

VI. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ

ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

По данным интернет­ресурса PhosphositePlus (http://www.phosphosite .

org) [17], в структуре L­КЛЦМ обнаруживается более 10 участков аце­ тилирования и около 40 участков фосфорилирования. В то же время метилирование и убиквитинирование остатков Lys и Arg встречается в этом белке в единичных случаях. Для подавляющего большинства ПТМ L­КЛЦМ не установлена функциональная значимость, и в лите­ ратуре имеются лишь отдельные сообщения по этой теме .

МОДУЛЯЦИЯ СВОЙСТВ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

АЦЕТИЛИРОВАНИЕМ

Одной из первых обнаруженных посттрансляционных модификаций KRP/телокина было конститутивное ацетилирование N­концевой ами­ нокислоты всех изоформ, отличающихся длиной N­концевой после­ довательности [67]. Для s­КЛЦМ также показано ацетилирование по остатку Met1 [132]. По­видимому, эти модификации защищают KRP/ телокин и s­КЛЦМ от деградации. Недавно показана возможность модуляции L­КЛЦМ под действием ацетилтрансферазы hARD1 [133]. Авторы показали, что hARD1 связывается в районе 4–5 IgG C2­подобных доменов L­КЛЦМ и ацетилирует эпсилон­аминогруппу Lys608 (рис. 2). В трансфицированных клетках hARD1 подавляет фосфорилирование РЛЦ и КЛЦМ­зависимую инвазию и миграцию 230 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский раковых клеток HT1080, а замена Lys608Arg полностью отменяла эффект hARD1 на активность L­КЛЦМ. Взаимодействие hARD1 с L­КЛЦМ требовало предварительной активации L­КЛЦМ Са2+/КаМ, указывая на возможные сложные взаимодействия между удаленными в первичной последовательности доменами L­КЛЦМ .

МОДУЛЯЦИЯ СВОЙСТВ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ГЕНА MYLK1

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ

Модуляция свойств белковых продуктов гена mylk1 фосфорилиро­ ванием на сегодняшний день изучена несколько лучше по сравнению с другими типами ПТМ. Благодаря протеомным технологиям идентифицирован целый ряд участков фосфорилирования КЛЦМ in vivo, часть из которых совпала с ПТМ, определенными ранее в исследованиях in vitro (рис. 2). Одна из таких имеющих большое функ циональное значение ПТМ – фосфорилирование КЛЦМ по т.н. сайту А в КаМ­связывающем домене [134]. Фосфорили­ рование Ser1760 в этом сайте протеинкиназами А (ПКА), G, С или Са2+/КаМ­зависимой протеинкиназой II типа приводит к ослаблению взаимодействия КаМ с КЛЦМ и снижению доступности РЛЦ, экрани­ рованной автоингибиторной последовательностью белка [134–136] .

Фосфорилирование Ser1759 с теми же функциональными последст­ виями осуществляет р21­активируемая протеинкиназа PAK2 [137] .

Имеются коммерческие фосфоспецифические антитела, позволяю­ щие оценивать фосфорилирование Ser1760, и, соответственно, уровень ингибирования КЛЦМ, однако встречаются работы, где положительная реакция с этими антителами рассматривается как активация КЛЦМ [83], что заставляет с осторожностью относиться к выводам таких исследований .

Для L­КЛЦМ был показан ряд участков фосфорилирования вне каталитического домена, но влияющих на ферментативную актив­ ность. Так, фосфорилирование Tyr464 и Tyr471 в уникальном N­кон­ цевом домене L­КЛЦМ под действием протеинкиназы с­Src in vitro в 2–3 раза повышает ферментативную активность L­КЛЦМ [138], указывая, что L­КЛЦМ может иметь «сложенную» пространственную структуру, в которой реализуется взаимодействие N­концевой и С­концевой частей молекулы. С такой гипотетической моделью конформации L­КЛЦМ согласуются и упомянутые выше данные по влиянию ацетилирования Lys608 L­КЛЦМ под действием hARD1 [133]. К сожалению, кристаллическая структура полноразмерной L­КЛЦМ, где будут отражены взаимодействия пространственно удаленных участков, остается неизвестной .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 231 Интересно отметить, что Tyr464 и Tyr471 входят в состав единого экзона, отсутствующего в L­КЛЦМ2 [61]. Соответственно, с­Src не фосфорилирует L­КЛЦМ2 и не регулирует ее каталитическую активность. Тирозиновая киназа c­Abl фосфорилирует in vitro около 10 тирозиновых остатков в L­КЛЦМ1, включая Tyr464. В резуль­ тате фосфорилирования c­Abl также, как и под действием с­Src, возрастает каталитическая активность L­КЛЦМ и увеличивается ее сродство к кортактину [139]. В этой же работе обнаружено авто­ фосфорилирование L­КЛЦМ по 19 остаткам Ser и Thr. В связи с этим, соотнести фосфорилирование каких­либо определенных остатков L­КЛЦМ с изменением ее каталитической активности не представляется возможным. Более того, столь множественное фос­ форилирование не исключает неспецифической модификации in vitro в присутствии избытка протеинкиназы. В пользу такого пред­ положения говорит то обстоятельство, что только в двух случаях из девяти тирозиновое фосфорилирование по участкам c­Abl in vitro подтверждено в раковых клетках с помощью масс­спектрометрии (см. http://www.phosphosite.org) .

Показано, что мутирование остатка Ser149 в последовательности L­КЛЦМ курицы (гомологичен Ser154 человека и Ser149 мыши и подтвержден как фосфосайт in vivo) на Asp149 приводит к ослаблению связывания N­концевого актин­связывающего фрагмента L­КЛЦМ c цитоскелетом в клетках HeLa [121]. К протеинкиназам, которые могут фосфорилировать Ser149 птиц in vitro, относятся ПКА и сходная с ней по субстратной специфичности протеинкиназа Aurora B. Последняя активна в митозе и фосфорилирует N­концевой домен L­КЛЦМ по остаткам серина в митотических клетках HeLa [140]. ПКА может фосфорилировать L­КЛЦМ в интерфазных клетках. Таким образом, ПКА и Aurora B составляют минимальный набор протеинкиназ, способных модулировать актин­связывающие свойства L­КЛЦМ в клетках .

В большинстве же работ, где сообщается о фосфорилировании L­КЛЦМ в клетках и тканях, не установлены механистические связи между фосфорилированием конкретных аминокислотных остатков L­КЛЦМ и изменениями свойств клеток. Так, тирозиновое фосфо­ рилирование L­КЛЦМ подтверждено в эндотелиальных клетках, стимулированных дипероксиванадатом, мощным активатором тирозиновых киназ и ингибитором тирозиновых фосфатаз [124], и показано в фибробластах, трансформированных конститутивно активным рецептором эпидермального фактора роста v­Erb­B [141]. В обоих случаях авторы отмечали изменения в статусе активации сократительных белков в изучаемых клетках. Проде­ 232 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский монст рировано фосфорилирование КЛЦМ под действием МАП киназ, сопровождающееся увеличением каталитической активности КЛЦМ, повышением уровня фосфорилирования РЛЦ миозина в клетках и ускорением их миграции [142]. Поскольку консенсусные участки для МАП киназ располагаются вне каталитического домена КЛЦМ, можно предположить, что активация КЛЦМ, обнаруженная в этой работе, требовала внутримолекулярных взаимодействий между удаленными в первичной структуре доменами КЛЦМ, аналогично тому, как это предположено выше для фосфорилирования Tyr464 и Tyr471 и ацетилирования Lys608 в N­концевой области L­КЛЦМ .

Обнаружено множественное фосфорилирование KRP/телокина как отдельного белкового продукта гена mylk1, так и в составе C­концевого домена КЛЦМ (см. http://www.phosphosite.org). Для восьми из десяти остатков Ser и Thr в неструктурированной после­ довательности, фланкирующей с N­конца IgG C2­подобный домен KRP/телокина, показано фосфорилирование, что позволяет предпо­ ложить важную регуляторную роль этого участка в КЛЦМ. В то же время никаких указаний на функциональные свойства этой после­ довательности в составе КЛЦМ, которые могли бы регулироваться фосфорилированием, не получено за исключением сообщения о том, что фосфорилирование этого домена протеинкиназой А усиливает ингибиторный эффект фосфорилирования по сайту А [136]. Фосфорилирование гомологичного участка KRP/телокина ПКА и МАП киназами не влияет на его способность ингибировать фосфорилирование миозина и развитие сокращения гладкой мышцы [112]. При стимуляции сокращения изолированных фазных гладких мышц фосфорилирование KRP/телокина возрастает при развитии сокращения, но мало изменяется при последующем расслаблении [75]. Количественный анализ изменения степени фосфорилирования отдельных остатков показал рост фосфорилирования Ser13 KRP/ телокина с 20 до 100% при сокращении мышцы, тогда как уровень фосфорилирования Ser19 изменялся при сокращении/расслаблении незначительно и составлял 25% [143]. Согласно данным лаборатории А. Сомлио и предложенной ими модели, KRP/телокин активирует ФЛЦМ и, таким образом, вызывает расслабление гладкой мышцы .

Этот эффект усиливается при фосфорилировании KRP/телокина по остатку Ser13 протеинкиназой G [144, 145] за счет того, что фосфо­KRP/телокин связывается с фосфорилированной и инакти­ вированной MYPT1 и преодолевает это ингибирование, позволяя ФЛЦМ дефосфорилировать миозин [131]. Следует заметить, что прямое взаимодействие с MYPT1 in vitro было показано для фосфо­ Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 233 мимикрирующего мутанта KRP/телокина (Ser13Asp), но не для фос­ форилированного по Ser13 KRP/телокина и белка дикого типа .

Суммируя раздел, можно отметить, что все белковые продукты гена mylk1 подвергаются в клетках и тканях множественным ПТМ .

Для некоторых ПТМ доказано влияние на каталитическую активность КЛЦМ, что отражается на активации миозинового мотора и, следо­ вательно, на параметрах клеточной подвижности. Функциональное значение основной части ПТМ в КЛЦМ и KRP/телокине остается не известным .

VII. УЧАСТИЕ КЛЦМ / KRP В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ

РЕАКЦИЯХ КЛЕТОК

Роль КЛЦМ в физиологических процессах в клетках в основном связывают с активацией миозина II, за счет которой КЛЦМ вовле­ кается в огромное разнообразие клеточных реакций, внешне не имеющих между собой ничего общего, но все они зависят от работы двигательного аппарата клетки. КЛЦМ является Са2+/КаМ­зависи­ мым активатором миозина и сама активируется при повышении Са2+ в клетке за счет действия Са2+­мобилизующих агонистов, таких как гистамин, тромбин, брадикинин, бомбезин, холецистокинин, ацетилхолин, катехоламины, fMet­Leu­Phe, оксиданты и др. Помимо протеинкиназной активности КЛЦМ ее взаимодействия с белками­ партнерами (см. раздел V) могут вносить вклад в общий КЛЦМ­за­ висимый функциональный ответ клетки .

АДГЕЗИЯ И МИГРАЦИЯ

Фундаментальным свойством субстрат­зависимых клеток является адгезия и миграция. КЛЦМ вовлечена в обеспечение обеих этих клеточных реакций. Совместно с киназой фокальных контактов, протеинкиназами с­Src и Erk КЛЦМ играет роль в формировании и разборке адгезивных контактов на переднем краю движущейся клетки, тем самым обеспечивая ее поступательное движение [146] .

Фармакологическое ингибирование КЛЦМ и КаМ в фибробластах, закрывающих рану, вызывает нарушение формирования фокальных адгезий, миграции клеток и сокращения ими коллагеновой сети и раны в целом [147]. Клетки париетальной эндодермы F9 формируют фокальные адгезии и ламеллиподии и мигрируют в культуре под конт­ ролем КЛЦМ, которая в свою очередь регулируется МАП­киназами семейства Erk [148] .

В фибробластах активность КЛЦМ по формированию фокальных адгезий сосредоточена на периферии клетки, в то время как ROCK­за­ 234 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский висимые фокальные адгезии находятся в центре. Избирательное инги­ бирование фосфорилирования миозина этими протеинкиназами при­ водило к разборке либо периферических, либо центральных фокальных адгезий и выражалось в различных изменениях миграции. Так, при ингибировании КЛЦМ фибробласты формировали мембранные протрузии во все стороны, более часто поворачивали и мигрировали менее эффективно, чем клетки с ингибированной ROCK. Последние двигались более быстро и прямолинейно [149]. Положения этой работы о пространственном разделении каталитических функций КЛЦМ и ROCK находят подтверждение в других исследованиях с иными клеточными моделями [150–153] .

В то же время ряд исследователей приводит доказательства того, что для миграции клеток важны некаталитические свойства КЛЦМ, т.е. взаимодействие с актином и другими белками­партнерами [76, 81, 154]. Как было описано выше, КЛЦМ способна выступать в качестве платформы для белок­белковых взаимодействий и обладает возможностями интегрировать цитоскелетные структуры [122–124] .

В ряде случаев, например, при трансмиграции нейтрофилов через эндотелий, связывание L­КЛЦМ нейтрофилов с тирозиновыми кина­ зами c­Src и Pyk2 и рекрутирование Pyk2 к 2­интегринам было, вероятно, достаточным КЛЦМ­зависимым событием, в то время как двигательную активность нейтрофилов опосредовал миозин II, акти­ вированный ROCK [76]. В то же время результаты экспериментов по «замещению» каталитической активности КЛЦМ ее актин­свя­ зывающей активностью, выполненных при гиперэкспрессии КЛЦМ и ее доменов [81, 154], следует интерпретировать с осторожностью .

Очевидно, что эктопическая экспрессия в клетках избытка актин­ связывающих доменов КЛЦМ приведет к стабилизации актинового цитоскелета даже в отсутствие каталитической активности КЛЦМ [122], а двигательную составляющую смогут обеспечить альтерна­ тивные миозин­активирующие протеинкиназы, такие как ROCK, ZIPK, цитрон киназа и др .

ПРОЛИФЕРАЦИЯ

КЛЦМ участвует в контроле клеточного деления. На модели проли­ ферирующих гепатоцитов грызунов с помощью ингибирования каталитической активности КЛЦМ и подавления ее экспрессии методом РНК­интерференции было продемонстрировано, что КЛЦМ контролирует переход клеток из поздней G1 фазы в S фазу, и меха­ низм контроля включает Erk2­зависимую активацию p70S6 киназы [155]. Подавление экспрессии и каталитической активности КЛЦМ Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 235 в различных видах раковых клеток тормозит их пролиферацию [156–158]. С другой стороны, подавление экспрессии КЛЦМ в глад­ комышечных клетках GbaSM­4 увеличивало скорость их пролифе­ рации и сокращало время удвоения популяции [159]. По­видимому, эффекты КЛЦМ на клеточное деление опосредуются состоянием цитоскелета, активностью внутриклеточных сигнальных систем, с которыми она взаимодействует, и уровнем белков­партнеров КЛЦМ .

Эти параметры в нормальных нетрансформированных клетках могут существенно отличаться от таковых в опухолевых клетках .

В делящихся клетках HeLa L­КЛЦМ концентрируется в корти­ кальной цитоплазме в метафазе и в области перетяжки деления в анафазе и телофазе [160]. За такую локализацию отвечают актин­свя­ зывающие DFRxxL мотивы в центральной части молекулы и последо­ вательности в N­концевой ее части. Перетяжка деления – это типичная актомиозиновая структура, и включение в нее L­КЛЦМ представляется логичным. Очевидно, L­КЛЦМ участвует в формировании перетяжки деления и ее констрикции, используя как свой каталитический домен, так и некаталитические домены. В этой же работе был показан и другой эффект N­концевого домена L­КЛЦМ, который нарушал нор­ мальную структуру веретена деления. Авторы предположили, что это может быть новой неожиданной регуляторной функцией L­КЛЦМ при митозе, но нельзя исключить, что это артефакт гиперэкспрессии N­концевого домена L­КЛЦМ, который способен in vitro и в клетках взаимодействовать с тубулином и микротрубочками [122] .

ЭНДОЦИТОЗ

Большое количество экспериментальных данных свидетельствует в пользу активного участия КЛЦМ в эндоцитозе. Эндоцитоз плазма­ тической мембраны используется клеткой для восстановления нор­ мального объема после набухания при гипотоническом стрессе .

КЛЦМ и миозин II накапливались вместе с актином в области воз­ никших при набухании мембранных пузырей перед их ретракцией .

Ингибирование КЛЦМ приводило к персистенции пузырей и замед­ лению восстановления нормального объема клетки. КЛЦМ совместно с актином, с­Src киназой, кортактином и динамином формировала специальные комплексы в области эндоцитируемоей мембраны, и ингибирование КЛЦМ или с­Src влияло на время жизни этих комплексов [161] .

Эндоцитоз синаптических везикул с целью рециклизации везику­ лярных мембран необходим для поддержания синаптической пере­ дачи нервных импульсов. Показано, что в этом процессе участвует 236 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский КЛЦМ и ее каталитическая активность [162]. Ингибирование КЛЦМ и подавление ее экспрессии тормозило эндоцитоз везикул и предотвращало фосфорилирование РЛЦ миозина в бутонах гиппо­ кампа крысы, индуцируемое в норме при деполяризации нейронов .

Аналогичный эффект достигался ингибированием миозина II в этой модели, а также с помощью блокаторов Са2+­каналов и КаМ .

Ранее подобное явление было обнаружено при изучении гигантских синапсов Хелда (calyx of Held synapse) у крыс [163]. Авторы этих работ полагают, что стимулируемое КЛЦМ фосфорилирование мио­ зина и активация эндоцитоза синаптических везикул является универ­ сальным процессом в нервной системе, ускоряющим рециклизацию везикулярных мембран при повышении активности синапсов .

ЭКЗОЦИТОЗ

Участие КЛЦМ в экзоцитозе также давно признано. Так, еще в 1994 г .

была показана существенная роль КЛЦМ в АТФ­зависимой инициа­ ции индуцируемого Са2+ экзоцитоза катехоламинов в хромаффинных клетках надпочечников [164]. В дальнейшем участие КЛЦМ в процессах экзоцитоза / секреции было показано и на других типах клеток. В бета­клетках поджелудочной железы КЛЦМ, активируя немышечный миозин IIA, модулирует транслокацию секреторных гранул и приводит к повышенной секреции инсулина. [165]. В агонист­стимулированных тромбоцитах КЛЦМ кооперирует с ROCK в активации миозина II, индуцируя сокращение тромбоцитов и сек­ рецию плотных гранул [166] .

На примере экзоцитоза ламеллярных гранул альвеолоцитами II типа показано, что КЛЦМ и ROCK транслоцируются на покрытые актином ламеллярные гранулы вблизи плазматической мембраны и активируют миозин на их поверхности. Для эффективного сокращения актиновой оболочки на поверхность гранул дополнительно привлекаются кофилин­1 и ­актинин, совместно вызывая секреторный ответ клеток [167]. Можно предполагать, что деполимеризация с участием кофилина­1 происходит в зоне контакта ламеллярных гранул с мембраной, где нужно устранить препятствия для их слияния, а КЛЦМ­зависимое и ROCK­зависимое сокращение других частей актомиозиновой оболочки гранул способствует опорожнению содер­ жимого гранул (компонентов сурфактанта) в образовавшуюся пору .

Приведенная схема событий на поздних этапах экзоцитоза согла­ суется с экспериментальными данными и, таким образом, может быть приложима к различным вариантам экзоцитоза, будь то секреция катехоламинов и инсулина, экстернализация рецепторов и глюкозных транспортеров, телец Вейбеля­Паладе и ламеллярных гранул и т.д .

Во всех случаях роль КЛЦМ, вероятно, состоит в активации сокра­ Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 237 тительной активности миозина на поверхности экзоцитируемого объекта. Нельзя исключить, что скаффолдная активность КЛЦМ также принимает участие в экзоцитозе .

РЕГУЛЯЦИЯ МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТКИ

Все клетки обладают определенной жесткостью, которая в нормоос­ мотических условиях определяется, в основном, их цитоскелетом и его перестройками. При гиперэкспрессии конститутивно активной s­КЛЦМ в фибробластах механическая прочность клеток возрастала вдвое, а при деполимеризации микрофиламентов цитохалазином D вновь снижалась [168]. В недавнем исследовании у L-КЛЦМ –/– мышей было продемонстрировано, что резистивные сосуды, в эндотелии которых не было L­КЛЦМ, не отвечали NO­зависимым расслабле­ нием на поток. Такой же эффект достигался при ингибировании КЛЦМ в эндотелии сосудов мышей дикого типа [169]. Таким образом, удаление / ингибирование КЛЦМ приводило к нарушению механо­ чувствительности NO­синтазы в сосудистом эндотелии .

В работе Dudek et al. с помощью метода атомной силовой мик­ роскопии (АСМ) обосновывается важная роль белкового комплекса, состоящего из тирозиновой протеинкиназы с­Abl, кортактина и L­КЛЦМ, в реорганизации кортикального цитоскелета эндотелиаль­ ных клеток и 30% увеличении жесткости их цитоплазмы при воз­ действии на них сфингозин­1­фосфата [139]. Прямых указаний на участие L­КЛЦМ в регуляции жесткости эндотелиальной цитоплазмы в этой работе не содержится, но они были получены в дальнейших исследованиях. Методом АСМ было показано, что эндотелиальные клетки из L-КЛЦМ –/– мышей, действительно, мягче, чем эндотелий дикого типа, и что помимо L­КЛЦМ протеинкиназа ROCK участвует в поддержании жесткости эндотелиальных клеток [170, 171]. Вопрос о роли некаталитических доменов L­КЛЦМ в регуляции жесткости цитоплазмы клеток остается неизученным. При этом наличие в струк­ туре L­КЛЦМ нескольких участков связывания актина, в том числе с регулируемой фосфорилированием аффинностью [121], позволяет ожидать проявления сшивающих свойств у этого белка, которые могут отразиться на жесткости актинового цитоскелета и модуле упругости клетки .

БАРЬЕРНАЯ ФУНКЦИЯ ЭПИТЕЛИЯ И ЭНДОТЕЛИЯ

Эпителий и эндотелий образуют плотные монослои, через который в норме проходят низкомолекулярные вещества, но не белковые молекулы [172]. С цитоплазматической стороны клетки белки меж­ клеточных контактных комплексов взаимодействуют с актиновым 238 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский цитоскелетом и могут испытывать на себе тянущее усилие, развивае­ мое актомиозином. Многие естественные стрессорные агенты (гис­ тамин, тромбин, VEGF, TNF, бактериальный липополисахарид, активные формы кислорода, избыточная механическая деформация и др.) вызывают нарушение контактных взаимодействий эндотелия и эпителия и активируют актомиозиновое сокращение. В ряде случаев активация актомиозина в этих клетках опосредуется каталитической активностью L­КЛЦМ [1, 173]. Сокращение клеток отводит их друг от друга и не позволяет им быстро восстановить физический контакт за счет распластывания. Кроме этого, накопление КЛЦМ и миозина II в ламеллоподиях сокращает время жизни ламеллоподий и их размер, стимулируя их ретракцию [153]. Таким образом, L­КЛЦМ в эндоте­ лии и эпителии участвует в дестабилизации клеточного барьера и повышении его проницаемости .

С другой стороны, L­КЛЦМ может образовывать комплекс с тирозиновой протеинкиназой с­Abl и кортактином, участвуя в реорганизации кортикального актинового цитоскелета эндотелия при стимуляции клеток сфингозин­1­фосфатом, секретируемым тромбоцитами и укрепляющим барьер [139]. Возможно, в последнем случае играет роль не каталитическая активность L­КЛЦМ, а скаф­ фолдная и сшивающая активности, которые и обеспечивают укрепле­ ние эндотелиального барьера, однако, детальных исследований в этом направлении не проводилось. Известно, что L-КЛЦМ –/– мыши менее подвержены нарушению барьерной функции эндотелия и эпителия при стрессе [102, 105, 174, 175], в то время как гипер экспрессия L­КЛЦМ в эндотелии у мышей делает его более проницаемым для макромолекул [176] .

СОКРАЩЕНИЕ ГЛАДКИХ МЫШЦ

В отличие от s­КЛЦМ, которая запускает сокращение гладких мышц, активируя гладкомышечный миозин, KRP/телокин, вероятно, выполняет противоположную функцию. Локализуясь на миозине в области регуляторных легких цепей, он стерически препятствует активирующим миозин протеинкиназам фосфорилировать миозин [112]. С другой стороны, KRP/телокин, вероятно, способен активиро­ вать ФЛЦМ. У KRP/телокин –/– мышей на 30% снижена активность ФЛЦМ в гладких мышцах кишечника и повышено фосфорилирова­ ние РЛЦ миозина [30]. Таким образом, независимо от молекулярного механизма действия KRP/телокин подавляет активацию миозина в гладких мышцах и стимулирует их расслабление. Играет ли анало­ гичную роль соответствующий KRP/телокину домен КЛЦМ остается неизвестным .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 239

VIII. УЧАСТИЕ КЛЦМ

В ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

ДИСФУНКЦИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО / ЭПИТЕЛИАЛЬНОГО БАРЬЕРА

Дисфункция эндотелиального / эпителиального барьера наблюдается при многих патологических состояниях у человека, в том числе, при сепсисе, инфаркте миокарда, инсульте, влажной форме макуло­ дистрофии, травматическом повреждении мозга, панкреатите. К нарушению сосудистой проницаемости и развитию отека легких и могза может приводить агрессивная терапия онкологическими пре­ паратами, отравление пульмонотоксическими ядами, термические ожоги тела, разможжение тканей, высотная гипоксия и другие при­ чины. Нарушение проницаемости кишечного эпителия наблюдается при болезни Крона, целиакии, аутоиммунных и воспалительных про­ цессах в желудочно­кишечном тракте, инфекционных заболеваниях, кишечной непроходимости, отравлениях .

При воздействии на мышей фактора некроза опухолей TNF в их кишечном эпителии происходит активация КЛЦМ, которая запускает кавеолин­1­зависимый эндоцитоз окклюдина, важного компонента плотных контактов кишечного эпителия [177]. Предполагается, что это один из механизмов повышения проницаемости кишечного эпи­ телия при действии различных стрессорных агентов, вызывающих повышение TNF в организме .

По КЛЦМ­зависимому механизму, вероятно, происходит проник­ новение комменсальных бактерий в кишечные энтероциты на фоне воздействия INF. В клетках усиленно фосфорилируется миозин II в области терминальной сети, формируются т.н. арки, происходит разрыхление щеточной каемки и затем наблюдается трансцитоз бактериальных клеток. Введение в полость кишечника ингибитора КЛЦМ или использование антител к INF подавляет проникновение бактерий в энтероциты. Бактериальной транслокации под действием INF не наблюдается у L-КЛЦМ –/– мышей, что подтверждает участие КЛЦМ в этом процессе [178] .

В ряде исследований с использованием L-КЛЦМ –/– мышей и инги­ биторов КЛЦМ, в том числе малых органических молекул и прони­ кающих в клетки пептидов, сообщается о положительных эффектах подавления активности КЛЦМ с целью поддержания целостности эндотелиального / эпителиального барьера, ограничения трансмигра­ ции клеток иммунной системы в ткани и минимизации клинических признаков патологии [1, 76, 104, 105, 174, 179–182] .

Выявлены ассоциации полиморфизмов в гене mylk1 c предрас­ положенностью различных популяций людей (афроамериканцы, 240 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский потомки испанцев, европеоиды, жители Карибов и др.) к развитию острого повреждения легких, сепсиса и астмы [5]. Эти генетические вариации могут отражаться на уровне экспрессии КЛЦМ в эндотелии и эпителии легких и отвечать за повышенное содержание этого белка в гладких мышцах воздухоносных путей у астматиков [183]. Ряд поли­ морфизмов в гене mylk1 ассоциирован с расслоением и аневризмами грудной аорты у человека [66] .

АТЕРОСКЛЕРОЗ

У мышей АпоЕ /L-КЛЦМ, получавших жирную пищу, уменьшается

–/– –/– размер бляшек в аорте и содержание в них липидов и макрофагов [77], связываемые авторами со сниженной проницаемостью эндотелия аорты, что подтверждается прямыми экспериментами. Вместе с тем, авторы отмечают снижение фосфорилирования с­Src в L-КЛЦМ –/– эндотелии при его стимуляции тромбином [77] и связывают это с некаталитической активностью L­КЛЦМ. Подтверждая более ранние исследования [76], авторы показывают, что трансмиграция моноцитов через эндотелий замедляется в отсутствие у них L­КЛЦМ, что также связывается со скаффолдной активностью L­КЛЦМ .

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ИНСУЛИНУ И ДИАБЕТ

КЛЦМ играет важную роль в инсулиновой сигнализации, развитии резистентности к инсулину и при диабете. Ингибирование миозина II и КЛЦМ снижало стимулируемую глюкозой секрецию инсулина бета­ клетками поджелудочной железы, что сопровождалось укорочением в них периферических пучков актиновых филаментов, снижением числа фокальных адгезий и инсулиновых гранул вблизи базальной мембраны [165]. Таким образом, каталитическая активность КЛЦМ необходима для модуляции секреции инсулина поджелудочной железой .

Взаимодействие инсулина с инсулиновыми рецепторами на клетках скелетных мышц и жировой ткани предполагает выход инсулина из кровотока сквозь эндотелиальный барьер. Транспорт инсулина через эндотелий микрососудов осуществляется трансцитозом посредством везикул, окаймленных клатрином [184]. Известно, что в экзоцитозе таких везикул участвует миозин II типа [185], активность которого может регулироваться КЛЦМ. Ограничение экзоцитоза инсулиновых гранул эндотелием при нарушениях в системе КЛЦМ­миозин II может быть одним из факторов развития резистентности к инсулину за счет снижения концентрации инсулина у поверхности клеток, депонирующих глюкозу, повышения содержания глюкозы в крови и развитию реактивной гиперинсулинемии .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 241 В норме инсулин стимулирует встраивание транспортеров глю­ козы GLUT4 в мембрану адипоцитов и скелетных миоцитов. Этот процесс представляет собой вариант экзоцитоза и также зависит от КЛЦМ и активируемого ею миозина IIA. Активный (акто)миозин необходим для слияния GLUT4 везикул с плазматической мембраной, и для поддержания активности GLUT4 [83, 186, 187]. Снижение эффективности работы GLUT4 в адипоцитах ведет к гипергликемии и развитию резистентности к инсулину .

Персистирующая гипергликемия при диабете вызывает накопление т.н. конечных продуктов гликирования (АGE), например, альбумина и гемоглобина, неферментативно модифицированных глюкозой. AGE связываются со своими рецепторами RAGE на эндотелии сосудов и стимулируют его гиперпроницаемость. Поскольку КЛЦМ вовлечена в нарушение барьерной функции эндотелия, ее ингибирование или подавление экспрессии ослабляет эдемагенные эффекты AGE и тормозит развитие васкулопатий, характерных для диабета [188] .

Дополнительно, гипергликемия и гиперлипидемия усиливают экспрессию КЛЦМ и накопление фосфорилированной (ингибирован­ ной) MYPT1 в аортальном эндотелии крыс со стрептозотоциновым диабетом, что способствует сократительному фенотипу эндотелия и гиперпроницаемости. Эти эффекты в значительной мере обращаются при введении крысам мелатонина [189]. Инсулин, напротив, восста­ навливает подавленную экспрессию КЛЦМ в желудке и кишечнике крыс со стрептозотоциновым диабетом. Снижение содержания КЛЦМ в этих органах – возможная причина задержки пассажа пищи у крыс с диабетом [190] .

Наконец, в недавней работе утверждается, что в сыворотке крови больных диабетом 2 типа содержание КЛЦМ существенно выше, чем у здоровых доноров. Таким образом, КЛЦМ может вскоре стать новым биомаркером диабета 2 типа [191]. Нельзя исключить, что иммуно­ реактивность к КЛЦМ появляется у больных диабетом в результате постоянного повреждения сосудистого эндотелия под действием оксидативного стресса, который может усиливаться эндотелиальной L­КЛЦМ за счет модуляции взаимодействия кортактина и p47(phox), необходимого для сборки и активации эндотелиальной NADPH оксидазы [192] .

РАК Поскольку КЛЦМ активно вовлечена в физиологические процессы клеточной адгезии, миграции и пролиферации, нарушение ее экспрессии и регуляции активности при раковой трансформации 242 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский клеток во многом будет определять миграционный и инвазивный потенциал этих клеток и, следовательно, динамику онкологического заболевания и тактику его лечения. Как показывают исследования, КЛЦМ acсоциирована с различными видами рака, включая рак молочной железы, легких, простаты, толстого кишечника и др. [5] .

Снижение содержания КЛЦМ в нормальных эпителиальных клетках молочной железы ведет к нарушению межклеточных взаимодействий и активирует инвазивное поведение этих клеток. В инвазирующих клетках рака молочной железы содержание КЛЦМ ниже, чем в неинвазирующих, и низкие уровни КЛЦМ коррелируют с плохим прогнозом у HER2­положительных пациентов с раком молочной железы [85]. В то же время в других работах указывается на противоположное соотношение содержания/активности КЛЦМ и инвазивности раковых клеток [60, 193], что может отражать специ­ фические отличия клеток, исследуемых в разных работах. Профили экспрессии генов в различных раковых клетках даже из одного органа могут существенно различаться, соответственно, могут различаться и клеточные реакции. Ацетилирование Lys608 L­КЛЦМ ацетил­ трансферазой hARD1 инактивирует L­КЛЦМ и ведет к снижению фосфорилирования РЛЦ миозина в раковых клетках, ингибируя их миграцию и инвазию [133] .

L­КЛЦМ активируется локально в эндотелиальных клетках сосу­ дов, через которые происходит инвазия раковых клеток в сосудистое русло, и активирует актомиозиновое сокращение. Блокирование фосфорилирования миозина в эндотелии ослабляет трансэндоте­ лиальную, но не парацеллюлярную инвазию раковых клеток [194] .

КЛЦМ КАК МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИШЕНЬ

ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВ

В связи с вовлеченностью КЛЦМ в развитие важнейших патологичес­ ких состояний она рассматривается многими исследователями как перспективная молекулярная мишень для создания лекарственных средств с широким диапазоном применения. Вместе с тем, разработка таких препаратов может встретить существенные трудности, свя­ занные с потенциальным негативным воздействием этих соеди­ нений на физиологические процессы, регулируемые КЛЦМ. Так, ингибирование каталитической активности L­КЛЦМ в эндотелии / эпителии может подавлять активность гладкомышечной s­КЛЦМ и других киназ РЛЦ миозина (скелетной, сердечной) в отсутствие техно­ логий направленной доставки ингибитора. Избирательная модуляция экспрессии КЛЦМ в определенном типе клеток потребует знаний об Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 243 особенностях тканеспецифической регуляции множественных про­ моторов гена mylk1, а селективное воздействие на некаталитические активности КЛЦМ потребует детальной характеристики участков связывания КЛЦМ с белками­партнерами и также будет критически зависеть от эффективных методов направленного транспорта .

IX. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неослабевающий в течение нескольких десятилетий интерес к КЛЦМ говорит о ее признанном биомедицинском значении и одновременно свидетельствует о больших пластах непонятого в плане организации и регуляции гена mylk1, структурно­функциональных свойств его продуктов и их роли в (пато)физиологии клетки и организма в целом .

Сегодня довольно много известно о дифференциальной регуляции экспрессии гена mylk1, но практически отсутствуют механистические исследования роли его полиморфизмов в предрасположенности к заболеваниям, равно как и сам список патологических состояний, ассоциированных с полиморфизмами КЛЦМ, представляется далеко не полным .

Сделаны лишь первые шаги в исследовании взаимодействий L­КЛЦМ, s­КЛЦМ и KRP/телокина с белками­парнерами, которые могут модулировать их ферментативные и неферментативные свойства. В случае L­КЛЦМ белок­белковые взаимодействия уни­ кальной N­концевой области L­КЛЦМ могут определять ее внутри­ клеточную локализацию и участие в различных клеточных процессах .

Учитывая подтвержденное участие L­КЛЦМ во многих физиоло­ гических процессах в клетках и тканях, расшифровка белок­белковых взаимодействий L­КЛЦМ, их функциональной роли и механизмов регуляции является актуальной фундаментальной задачей с много­ обещающими прикладными результатами .

Несмотря на общепризнанное значение посттрансляционных модификаций в регуляции структуры и функций белков в клетках, в случае L­КЛЦМ и других продуктов гена mylk1 регуляторная роль ПТМ практически не изучена, а имеющиеся сообщения, связывающие ПТМ и свойства белка, ставят больше вопросов, чем дают ответов .

В частности, это связано с недостаточным пониманием организации самой КЛЦМ и ее взаимодействий с другими белками. Определение участков внутримолекулярных и белок­белковых взаимодействий в первичной структуре КЛЦМ даст ключ к пониманию роли ПТМ в этом белке. И наоборот, распределение ПТМ в КЛЦМ, по­видимому, указывает на те участки в ее первичной структуре, которые вовле­ чены в различные взаимодействия и потому подвергаются регуляции 244 А.Ю.Хапчаев, В.П.Ширинский in vivo. Таким образом, решение проблемы ПТМ L­КЛЦМ пред­ ставляет собой актуальное направление исследований этого белка, позволяющее глубже понять его роль в (пато)физиологии клетки .

Движение в этом направлении во многом зависит от прогресса в изучении молекулярной анатомии КЛЦМ и идентификации участков связывания ее партнеров .

Исследования роли КЛЦМ в жизнедеятельности клетки и целого организма, выполненные с помощью молекулярно­генетических и фармакологических методов управления содержанием и актив­ ностью этого белка, позволили обозначить ареал КЛЦМ­зависи­ мых клеточных реакций .

Как и предполагалось, в него вошли различные аспекты клеточной подвижности. В дальнейшем удалось показать, что при сердечно­сосудистых, онкологических, инфек­ ционных и других заболеваниях, диабете и травмах нарушения двигательных реакций клеток, лежащие в основе этих патологий, также зачастую связаны с нарушениями в молекулярной системе КЛЦМ­белки партнеры. Это дает основания рассматривать КЛЦМ как перспективную молекулярную мишень при создании новых лекарственных препаратов. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. Однако предстоит преодолеть еще много объективных сложностей, связанных с широким распространением КЛЦМ и ее вовлеченностью в важнейшие физиологические процессы в организме. Критическим для успеха здесь становится понимание механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии гена mylk1, взаимодействий и посттрансляционных модификаций КЛЦМ, а также разработка методов направленной доставки специфичных к КЛЦМ реагентов (синтетические ингибиторы, интеркалирующие пептиды, молекулярно­биологические конструкции и т.д.) in vivo. Дальнейшие исследования в этих направлениях позволят осуществить трансляцию фундаментальных знаний о КЛЦМ в технологии и продукты, в кото­ рых остро нуждается практическая медицина .

Примечание при корректуре .

Когда обзор был готов к публикации, Gaceb et al.* сообщили о том, что цирку­ лирующие микровезикулы из L-КЛЦМ –/–мышей оказывают защитное дейст­ вие в случае воспалительных реакций, вызванных липополисахаридом in vivo и в культуре эндотелия аорты .

* Gaceb, A., Vergori, L., Martinez, M.C., Andriantsitohaina, R. (2016) Acti­ vation of endothelial pro­resolving anti­inflammatory pathways by circulating microvesicles from non­muscular myosin light chain kinase­deficient mice, Front .

Pharmacol., 7, 322. doi: 10.3389/fphar.2016.00322) .

Киназа легких цепей миозина: обзор свойств 245

ЛИТЕРАТУРА

–  –  –






Похожие работы:

«1 www.esa-conference.ru\ Проблема "сохранения населения и сбережения народа": социальные аспекты Реутов Валентин Палладиевич, доктор биологических наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Р...»

«Problemy istorii, lologii, kul’tury Проблемы истории, филологии, культуры 2 (2016), 356–363 2 (2016), 356–363 © The Author(s) 2016 ©Автор(ы) 2016 ВАРИАТИВНОСТЬ СВЯЗИ "КУКЛА РОК" В ХУДОЖЕСТВЕННЫХ ТЕКСТАХ Н.М. Солнцева Московский государственный университет им. М. В. Ломоносо...»

«ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 139 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ 2008. Вып. 2 УДК 581.9 (471.51) А.Н. Пузырев ДОПОЛНЕНИЕ К АДВЕНТИВНОЙ ФЛОРЕ ШОССЕЙНЫХ ДОРОГ УДМУРТИИ Сообщаются сведения о находках 56 адвентивных видов растений,...»

«УДК 551.465 Расчет средних характеристик стратификации водной среды © 2015 А.Е. Погребной Морской гидрофизический институт РАН, Севастополь, Россия E-mail: pogrebok57@mail.ru Поступила в редак...»

«BY0200199 целиком (85-95 %) находится в ионной форме (Глаголева, 1959). Нами установлено, что удельна(га1тивностьстронцйя-90 в мокрых выпадениях над акваторией озера сильно варьирует ( от 15,5 до 314 Бк/м3) и связана с метеорологическими условиями, т.е. с мощностью и продолжительностью выпадений (Душэускене-Дуж, Ясюле...»

«IX МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНАЯ МОЛОДЕЖНАЯ ШКОЛА ПО ПАЛЕОПОЧВОВЕДЕНИЮ "ПАЛЕОПОЧВЫ – ХРАНИТЕЛИ ИНФОРМАЦИИ О ПРИРОДНОЙ СРЕДЕ ПРОШЛОГО" 2018 год ПЕРВОЕ ИНФОРМАЦИОННОЕ ПИСЬМО Институт почвоведения и агрохимии СО РАН, Институт водных и экологических проблем СО РАН, Национальный Исследовательский Томский Государственный университет, Новос...»

«ВСЕРОССИЙСКИЙ КОНКУРС ЮНЫХ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ГБОУ СОШ "ОЦ" с. Богатое Муниципальный район Богатовский Самарская область Номинация: "Юные исследователи"БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ ВРЕДИТЕЛЯМИ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР (НА ПРИМЕРЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ЗЛАТОГЛАЗКИ И ТЛИ) Автор: Мар...»

«ПОТЕРИ НАУКИ Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 230-236. УДК 59(092)+597.6+598.1 ВАЛЕРИЙ ИОСИФОВИЧ ВЕДМЕДЕРЯ (1946–2008) © 2009 А.И. Зиненко Музей природы Харьковского Национального Университ...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.