WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛОКУСА КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА А. Ю. ХАПЧАЕВ, 8 2003 г. В. П. ШИРИНСКИЙ, А. В. ВОРОТНИКОВ* Институт ...»

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 365

Успехи биологической химии, т. 43, 2003, с. 365—420

СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И

РЕГУЛЯЦИЯ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ

ГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛОКУСА КИНАЗЫ

ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА

А. Ю. ХАПЧАЕВ,

8 2003 г .

В. П. ШИРИНСКИЙ, А. В. ВОРОТНИКОВ*

Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно производственного комплекса МЗ РФ, Москва I. Введение. II. Ультраструктура сократительного аппарата гладких мышц и немышечных клеток. III. Генетический локус КЛЦМ. IV. Киназа легких цепей миозина. V. h КЛЦМ. VI. KRP .

VII. Фосфорилирование белков генетического локуса КЛЦМ .

VIII. Заключение .

I. ВВЕДЕНИЕ В клетках эукариот Са2+ является ключевым компонентом многих сигнальных путей. Связывание различных сигнальных молекул с поверхностными рецепторами клетки вызывает возрастание кон центрации свободного Са2+ в цитоплазме ([Cа2+]i) и инициирует целый ряд внутриклеточных процессов, в том числе зависимых от миозина II типа. В мышечных тканях увеличение [Cа2+]i играет ведущую роль 2+ Принятые сокращения: [Cа ] i – концентрация свободного внутриклеточного 2+ 2+ Са ; СаМ – кальмодулин; СаМК II – Са /кальмодулин зависимая киназа типа II; l КЛЦМ и h КЛЦМ – низкомолекулярная и высокомолекулярная изоформы киназы легких цепей миозина, соответственно; skКЛЦМ – КЛЦМ скелетных мышц; KRP – kinase related protein (телокин); МАР киназа – митоген активи руемая протеинкиназа; РАК – р21 активируемая киназа; РКА – сАМР зависи 2+ мая протеинкиназа; РКG – сGМР зависимая протеинкиназа; РКС – Са /фос фолипид зависимая протеинкиназа; РЛЦ – регуляторные легкие цепи .



*Адрес для корреспонденции: e mail: A.Vorotnikov@cardio.ru; факс: (095)4146719 .

Работа выполненна при поддержке РФФИ (гранты 02 04 49341и 02 04 49417), медицинского института Ховарда Хьюза (ННMI грант 55000335), фондов Генри Веллкома (The Wellcome Trust грант CRIG 059801) и Джона Фогарти (FIRCA грант R03 TW05786) .

366 А.Ю.Хапчаев и др .

в инициации сокращения. В поперечнополосатых скелетных и сер дечной мышцах Са2+ связывается с тропониновым комплексом, расположенным на тонких актин тропомиозиновых филаментах, что «включает» тонкие филаменты и позволяет им активировать сарко мерный миозин и сокращение .

В гладкой мускулатуре и немышечных клетках Са2+ запускает, соответственно, процессы сокращения и клеточной подвижности путе м активации как тонких филаментов, так и несаркомерного мио зина [2, 109, 182, 196]. Первичным акцептором кальциевого сигнала в гладких мышцах и немышечных клетках является низкомолеку лярный белок кальмодулин (CaM). Комплекс Са2+/CaM активирует CaM связывающие белки, в том числе кальдесмон и киназу легких цепей миозина (КЛЦМ). Кальдесмон, аналогично тропонину скелет ных мышц, «включает» тонкие филаменты, но для развития сокра щения и немышечной подвижности главным условием является активация миозина путем фосфорилирования его регуляторных легких цепей (РЛЦ). Основным ферментом, осуществляющим эту функцию, является КЛЦМ. Обратную реакцию дефосфорилирова ния и инактивацию миозина, приводящую к расслаблению гладких мышц, обеспечивает миозин специфичная фосфатаза РЛЦ миозина .

Фосфорилирование РЛЦ миозина происходит и в поперечнопо лосатых мышцах [170, 175]. Однако миозин этих мышц активен конс титутивно и его фосфорилирование играет лишь модуляторную роль, ускоряя развитие и увеличивая силу максимального сокращения [203]. Фосфорилирование повышает сродство миозина к актину и его АТРазную активность [167], что проявляется только в присутст вии связанных с актином тропомиозина и тропонина .



Напротив, в гладкомышечных и немышечных клетках фосфори лирование РЛЦ миозина играет ведущую роль в регуляции актомио зин зависимых процессов. Оно многократно стимулирует актин активируемую Mg2+ АТРазу миозина и запускает сокращение гладких мышц [192, 216] и немышечных клеток [123], ретракцию клеток эндо телия [62, 232], агрегацию тромбоцитов [72], рост ламеллоподий и хемотаксис [118], цитокинез [235], кэпирование мембранных рецеп торов [117] и клеточную секрецию [32] .

В геноме высших позвоночных обнаружено два гена КЛЦМ [71, 177]. Один кодирует КЛЦМ, экспрессирующуюся исключительно в скелетных мышцах и сердечной мышце (skКЛЦМ) [153]. Другой представляет собой сложно организованный генетический локус, кодирующий несколько белковых продуктов, отличающихся по раз меру и функциональным свойствам [5]. Среди них высокомолеку лярная (h КЛЦМ) и низкомолекулярная (l КЛЦМ) изоформы Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 367 КЛЦМ и миозин связывающий белок KRP, не обладающий протеин киназной активностью [225]. Все три продукта генетического локуса КЛЦМ используют единую рамку считывания и общий стоп кодон .

Как следствие такой организации, h КЛЦМ содержит уникальный N концевой домен, тогда как ее С концевая часть полностью вклю чает в себя последовательность l КЛЦМ. С концевые последователь ности обеих КЛЦМ идентичны последовательности белка KRP. Про дукты генетического локуса КЛЦМ по разному экспрессируются в тканях позвоночных и в онтогенезе [24]. l КЛЦМ имеет широкое рас пространение в организме, h КЛЦМ в основном экспрессируется в эмбриональном периоде и в немышечных клетках [57, 219, 220], а экспрессия KRP ограничена гладкой и сердечной мускулатурой [24, 45, 82]. Ключевая роль белковых продуктов генетического локуса КЛЦМ в жизнедеятельности клеток обуславливает наличие тонкой регуляции их активности в дополнение к прямому участию Са2+/CaM .

Целью настоящего обзора является анализ структуры генетичес кого локуса КЛЦМ и его белковых продуктов, биохимических свойств КЛЦМ и KRP в отношении к регуляции активности актомиозина, их внутриклеточных взаимодействий и локализации, а также предпо лагаемых механизмов регуляции их активности. В обзоре меньше внимания будет уделено клеточно физиологическим аспектам, поскольку эти вопросы более полно освещены в обзорах последних лет [2, 5, 88, 169, 200] .

II. УЛЬТРАСТРУКТУРА СОКРАТИТЕЛЬНОГО АППАРАТА

ГЛАДКИХ МЫШЦ И НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

Гладкомышечные клетки не имеют упорядоченных саркомеров, характерных для поперечнополосатых мышц, однако содержат все основные их компоненты: актин, миозин и образования, аналогич ные Z дискам .



Тонкие филаменты состоят из актина и тропомиозина, имеют толщину около 7 нм и окружают состоящие из миозина толстые филаменты диаметром 15 17 нм. В совокупности эти структуры обра зуют миофиламенты, которые ориентированы под углом к продоль ной оси клетки [15]. Через актин концы миофиламентов закреплены в так называемых плотных тельцах, содержащих основной белок Z дисков саркомеров актинин. С помощью этих образований (в таком случае называемых плотными бляшками) миофиламенты прикреплены к клеточной мембране. В цитоплазме плотные тельца контактируют также с системой промежуточных филаментов, постро енных из десмина и виментина, и служащих для связывания миофи ламентов в единую сеть. В силу таких ультраструктурных особен 368 А.Ю.Хапчаев и др .

ностей распределение миофиламентов в дифференцированной глад комышечной клетке практически не изменяется .

В немышечных клетках актомиозин сходным образом организо ван в волокна, в виде пучков, пронизывающих цитоплазму, или рас положенных субкортикально под мембраной. В зонах контакта акто миозиновых пучков с мембраной располагается белок актинин, который также распределяется периодически вдоль волокон, возможно, формируя структуры типа плотных телец [134]. Основное отличие актомиозиновой системы немышечных клеток от гладкомышечного сократительного аппарата – ее динамический характер. Двигатель ные процессы в немышечных клетках протекают локально с частой переменой вектора натяжения или сокращения и сопровождаются постоянной перестройкой актомиозина .

Структура актиновых филаментов достаточно консервативна для всех типов мышц и немышечных клеток. Поэтому отсутствие разде ления несаркомерных миофиламентов на сократительные единицы определенной длины во многом связано со специфическими особен ностями миозина гладких мышц и его способностью полимеризо ваться в филаменты, отличные от филаментов миозина поперечно полосатых мышц .

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МИОЗИНА

Основным молекулярным мотором всех эукариотических клеток является миозин II типа. Хотя в поперечнополосатых мышцах, глад ких мышцах и немышечных клетках экспрессируются продукты раз ных генов миозина II, все эти белки имеют, в целом, сходную молеку лярную организацию. В то же время, отличия в их первичной струк туре определяют различные способы филаментообразования и регу ляции моторной активности миозинов .

Молекула миозина II типа состоит из двух тяжелых (около 200 кДа) и двух пар легких цепей: существенных и регуляторных с массой 17 и 20 кДа, соответственно (см. обзор [3]). Эти субъединицы фор мируют единую молекулу, состоящую из стержневого хвоста, связан ного через так называемую шейку с двумя глобулярными головками .

Филаменты образуются путем латеральной агрегации хвостовых час тей молекул миозина. В филаментах гладкомышечного и немышеч ным миозинов головки располагаются вдоль боковой поверхности филамента и на разных его сторонах имеют противоположную ориен тацию, образуя филаменты с боковой полярностью [234]. Молекулы миозина поперечнополосатых мышц ассоциируют антипараллельно и формируют биполярные филаменты с концевым расположением Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 369 головок и их противоположной ориентацией, тогда как центральная зона филамента головок не содержит [198] .

Головка молекулы миозина (так называемый субфрагмент S1) образована N концевой частью тяжелой цепи миозина и ассоцииро ванными с ней легкими цепями. В состав S1 входят центры связыва ния Mg2+ АТР и актина и связывание этих лигандов приводит к изме нению конформации головки миозина. Установлено, что S1 является необходимой и достаточной частью молекулы миозина, способной осуществлять движение в присутствии актина и Mg2+ АТР, так как в этой части молекулы сосредоточен ее моторный домен [214]. Обна ружен ряд тканеспецифичных изоформ миозина гладких мышц [13], различающихся Mg2+ АТРазной активностью и скоростью трансло кации актиновых филаментов in vitro [112, 204] .

Лeгкие цепи миозина расположены в области шейки и обвивают тяжелую цепь миозина так, что их N и С концевые участки оказы ваются вблизи друг от друга [174, 233]. По видимому, одной из важ нейших функций легких цепей является стабилизация длинной спирали внутри S1, обеспечивающей передачу сигнала от шейки к апикальной части головки, АТР и актин связывающим центрам .

В дефосфорилированном миозине взаимодействие головок друг с другом препятствует конформационным изменениям и гидролизу Mg2+ АТР в активном центре [228, 229]. КЛЦМ активирует миозин, специфически фосфорилируя остаток Ser19 РЛЦ [94], что изменяет конфигурацию РЛЦ, вышеупомянутой спирали и, по видимому, взаимодействие головок миозина, приводя к экспонированию актин связывающих участков S1, активации Mg2+ АТРазы миозина акти ном и развитию сокращения .

Другой важной функцией фосфорилирования Ser19 РЛЦ является регуляция динамики филаментов миозина. В растворе молекула несаркомерного миозина находится в стабильных свернутой (10S) или развернутой (6S) конформациях. При физиологических концент рациях солей и АТР дефосфорилированный миозин не способен полимеризоваться поскольку приобретает 10S конфигурацию так, что стержневая часть молекулы сложена втрое и загнута в сторону головок, взаимодействуя с областью шейки [217]. Это взаимодейст вие нарушается при фосфорилировании РЛЦ миозина [35, 202] или связывании белка KRP в области шейки (см. ниже) [185], что приводит к разворачиванию молекул миозина и их спонтанной поли меризации в филаменты. Таким образом, фосфорилирование РЛЦ или связывание KRP могут стабилизировать миозин в филаментах, определяя его доступность для актина и участие в силогенерирующих процессах [221] .

370 А.Ю.Хапчаев и др .

Было обнаружено, что при дефосфорилировании миозина в гладкой мускулатуре не происходит глубоких структурных перестроек сократительного аппарата [65, 195]. Таким образом, несмотря на высокую концентрацию АТР (порядка 2–5 мМ), дефосфорилирован ный миозин остается собранным в филаменты, что может объясняться совокупным воздействием таких факторов, как огромная внутрикле точная концентрация миозина (80–90 µМ или 40–45 мг/мл!), нали чием остаточного (базального) уровня фосфорилирования РЛЦ (2–10 %, в зависимости от ткани), уровнем экспрессии KRP (подроб нее см .

ниже) или белка р38, который взаимодействует со стержневой частью молекулы миозина и стабилизирует 6S конформацию миози на и его филаменты по механизму, отличному от действия KRP [155] .

Регуляция полимеризации деполимеризации миозина играет важную роль в немышечных клетках, обеспечивая быструю и ком партментализованную сборку и разборку филаментов миозина. В немышечных клетках KRP не экспрессируется, а концентрация мио зина II ниже, чем в гладких мышцах и до 50% миозина может нахо диться в растворимой, нефиламентарной форме. Принято считать, что фосфорилирование РЛЦ миозина является основным путем регуляции динамики миозиновых филаментов в этих системах .

III. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЛОКУС КЛЦМ

У позвоночных разные гены кодируют КЛЦМ, фосфорилирую щую скелетный и сердечный миозины II (skКЛЦМ), и КЛЦМ, фосфорилирующую гладкомышечный и немышечный миозины II .

Экспрессия skКЛЦМ ограничена поперечнополосатыми мышцами и зонды, селективные к кДНК skКЛЦМ, гибридизуются c 3,3 kb мРНК в этой ткани [79, 83, 177]. Напротив, во многих тканях три класса мРНК гибридизуются с пробами к 3' концу кДНК гладко мышечной/немышечной КЛЦМ. Эти мРНК имеют размер 9,0, 5,5 и 2,7 kb и кодируют три семейства белков [24, 225]. Все они экспрес сируются с единого участка в геноме позвоночных, получившего название генетический локус КЛЦМ [24] .

До определения генетической организации локуса КЛЦМ в литературе существовало несколько классификаций КЛЦМ гладко мышечных и немышечных клеток, противоречивших друг другу .

Считалось, что гладкие мышцы содержат специфичную низкомолек улярную изоформу (smooth muscle, smКЛЦМ), а в немышечных и эмбриональных тканях экспрессируется другая изоформа с большей молекулярной массой (non muscle, nmКЛЦМ) [51, 57, 186]. В даль Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 371 нейшем оказалось, что smКЛЦМ также экспрессируется в немышеч ных клетках, а nmКЛЦМ может экспрессироваться в гладкомышеч ных клетках. Были сделаны попытки классифицировать КЛЦМ по молекулярной массе. Однако у различных видов низкомолекулярная изоформа КЛЦМ имеет расчетную массу от 108 до 130 кДа, а высо комолекулярая изоформа – 210–230 кДа. Флуктуации молекуляр ной массы в результате альтернативного сплайсинга изоформ КЛЦМ (см. ниже) создали дополнительные трудности для этой классифи кации. В качестве выхода из положения было предложено обозначать семейство высокомолекулярных изоформ КЛЦМ как «большие» или «длинные» КЛЦМ (big or long), а низкомолекулярные КЛЦМ, как «малые» или «короткие» КЛЦМ (small or short) .

По нашему мнению, более объективной представляется класси фикация на основе структурно функциональных свойств КЛЦМ, чем по размерам молекул, которые еще окончательно не установ лены. Поэтому мы будем далее использовать термины l КЛЦМ (от англ. light – «легкая») и h КЛЦМ (от англ. heavy – «тяжелая») для обозначения групп низко и высокомолекулярных изоформ КЛЦМ, соответственно. Подобная классификация была ранее введена и успешно используется для изоформ актин связывающего белка кальдесмона [141] .

Анализ структуры генетического локуса КЛЦМ впервые проде монстрировал новый для эукариот тип геномной организации .

Оказалось, что ген КЛЦМ содержит внутри себя другой ген, кодиру ющий некиназный С концевой фрагмент КЛЦМ [24, 33, 58, 225, 240]. Этот короткий белок, открытый и описанный параллельно двумя группами исследователей, получил два независимых названия .

Первое из них, телокин, является комбинацией греческого слова telos (хвост) и английского kinase, буквально означая «хвост киназы» [104] .

Второе название, KRP, представляет собой английскую аббревиатуру от «kinase related protein» (белок, родственный киназе), что отражает его генетическую связь с КЛЦМ [33]. Хотя в настоящее время оче видно, что телокин и KRP идентичны и оба названия одинаково упот ребимы в литературе, мы будем использовать второе название .

KRP кодируется 2,7 kb мРНК, транскрипция которой опреде ляется независимым промотором, расположенным в интроне гена КЛЦМ, между экзонами 28 и 29, кодирующими СаМ связывающий участок. В этом интроне были найдены мотив..ССААТ…ТАТАА.., кодирующий участок посадки рибосом, участок инициации транс крипции, и первые 109 нуклеотидов 5' некодирующей последова тельности мРНК KRP [33, 58] (рис. 1, см. цветную вкладку, стр. 385) .

372 А.Ю.Хапчаев и др .

Последующие исследования выявили подобную организацию и других генетических локусов позвоночных. Так, белок FRNK (FAK related nonkinase) автономно экспрессируется с гена, находя щегося внутри гена киназы фокальных контактов (FAK) [181], а некаталитический и не связывающий Са2+/CaM белок экспресси руется с гена Са2+/CaM зависимой киназы II типа [22]. Были также описаны гены коллагена, содержащие внутри себя меньшие гены, про моторы которых расположены внутри интронов гена коллагена [241] .

Генетический локус КЛЦМ простирается приблизительно на 100 kb ДНК и включает 31 экзон. h КЛЦМ кодируют все 31 экзона [24], причем возможны варианты альтернативного сплайсинга пре мРНК [133]. Экзоны 15 31 и 29 31 кодируют, соответственно, l КЛЦМ и KRP (рис. 1). При этом мРНК l КЛЦМ и h КЛЦМ транскрибируется с использованием экзона 29А, представляющего собой 3' часть экзона 29 [24]. Генетический локус КЛЦМ человека, названный MYLK, расположен в области 3qcen q21 третьей хромосомы [173]. В области 3р13 этой же хромосомы обнаружен псевдоген КЛЦМ (MYLKP) [28] .

Все три класса мРНК, транскрибируемых с гена КЛЦМ, обладают идентичными 3' концевыми участками [225]. Пока остается неяс ным, образуются ли мРНК для l КЛЦМ и h КЛЦМ в результате альтернативного сплайсинга материнской пре мРНК или, аналогично KRP, их транскрипция происходит с разных промоторов. Также выс казано предположение о существовании четвертого класса мРНК, транскрибирующегося с локуса КЛЦМ [226] .

Таким образом, структурная организация белковых продуктов генетического локуса КЛЦМ по принципу «один в другом» сходна с устройством выдвижной антенны. Все они имеют общее основание (С конец в KRP, l КЛЦМ и h КЛЦМ), одинаковые звенья (перекры вающиеся последовательности), но вариабельный размер вследствие дискретного количества дистальных (N концевых) сегментов. Такая организация позволяет каждому большему из белков сохранять все свойства меньшего, а также приобретать новые, связанные с функ ционированием уникальных N концевых доменов. Интересно предположить, что возникновение в природе этого феномена имеет большее значение, чем простое расширение функциональных воз можностей исходного белка. Представленный в настоящем обзоре сравнительный анализ строения генетического локуса КЛЦМ, структуры его белковых продуктов и их внутриклеточных функций, а также расположения регуляторных участков, включая фосфори лируемые кластеры, позволяет предположить, что каждый уникаль ный домен определяет основную функцию данного белка, экспрес сируемого генетическим локусом КЛЦМ. Так, известная к настоя Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 373 щему времени главная функция KRP заключается в связывании и регуляции миозина, l КЛЦМ – в активации миозина путем фосфо рилирования РЛЦ, а h КЛЦМ – в модуляции взаимодействия раз личных компонентов цитоскелета. В дополнение к своей опреде ляющей функции, каждый больший по размеру белок только допол нительно использует все свойства более короткого. Такая картина была бы наиболее характерна для клеток, экспрессирующих все компоненты генетического локуса КЛЦМ. Однако, в случаях, связан ных с их избирательной экспрессией, можно ожидать, что один белок может принимать на себя функцию отсутствующего компонента или функция последнего рудиментарна для данного типа клеток .

В связи с такой гипотезой интересен эволюционный аспект функ циональной геномики КЛЦМ, который указывает на двунаправлен ность структурно функциональных изменений исходного белка, которым, по видимому, является l КЛЦМ. Геном таких ранних эука риот, как дрожжи, не несет гена КЛЦМ, а микроорганизм Dictyoste lium discoideum экспрессирует КЛЦМ, регулируемую автофосфорили рованием, но не Са2+/СаМ [206]. Возможно, что изменение способа активации КЛЦМ путем замены автофосфорилирования на связы вание Са2+ СаМ произошло эволюционно и не потребовало значи тельных структурных изменений. Так, вставка всего лишь из пяти аминокислот из области фосфорилирования РЛЦ, в регуляторный участок smКЛЦМ приводит к внутримолекулярному автофосфори лированию и CaM независимой активации l КЛЦМ [18], аналогично активации КЛЦМ Dictyostelium. У краба Limulus также обнаружена короткая форма КЛЦМ (34 кДа), однако этот фермент уже Са2+ СаМ зависим и может фосфорилировать РЛЦ гладких мышц позвоночных [183]. КЛЦМ плодовой мушки Drosophila содержит и Са2+/СаМ свя зывающий участок, и структуру, сходную с N концевой частью h КЛЦМ, но не содержит актин связывающего участка и KRP домена, взаимодействующего с миозином [211]. Кроме того, Drosophila не имеет skКЛЦМ, но использует альтернативный сплайсинг для экспрессии различных изоформ КЛЦМ с одного гена, по видимому, для выпол нения различных клеточных функций. Напротив, позвоночные имеют две группы филогенетически и генетически разных СаМ регулируе мых КЛЦМ (l КЛЦМ/h КЛЦМ и skКЛЦМ). При этом у первой груп пы ферментов появляются миозин связывающий KRP домен и актин связывающий участок, а также усложняется устройство гене тического локуса, давая начало новому у эукариот принципу геном ной организации по типу «ген внутри гена» [24]. Вероятно, феномен «ген внутри гена» возник на поздних этапах эволюции позвоночных и связан со спецификой программирования развития и гомеостаза .

374 А.Ю.Хапчаев и др .

IV. КИНАЗА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА

Как фермент, специфически фосфорилирующий РЛЦ миозина, КЛЦМ была впервые обнаружена в скелетных мышцах [170]. Позже КЛЦМ была выделена из гладких мышц [7, 38]. Ген КЛЦМ клони рован из гладкомышечных тканей курицы [156], кролика [59], быка [121], а также из мозга человека [173], фибробластов куриных эмбрио нов [225] и слизневика Dictyostelium [206] .

КЛЦМ различных видов животных различаются по молекуляр ной массе и обладают аномальной электрофоретической подвиж ностью. Кажущаяся молекулярная масса, определенная этим мето дом, составляет 75–90 кДа для skКЛЦМ [29, 153, 171, 238] и 130–160 кДа для l КЛЦМ, что всегда выше расчетной и определенной мето дами седиментации или гель фильтрации [9, 12, 59]. Молекула l КЛЦМ асимметрична: соотношение осей молекулы составляет 18,9, а радиус o Стокса равен 68,5 А12], однако, по данным электронной микроско пии молекула l КЛЦМ может принимать сложенную конформацию в растворе [152]. Согласно другим данным, в физиологических раст ворах in vitro l КЛЦМ существует как смесь олигомерной (2%), димер ной (53%) и мономерной (45%) форм, но связывание Са2+/CaM сдви гает равновесие в сторону образования димеров [14, 49]. Вероятно, олигомеризацию обеспечивает С концевой домен l КЛЦМ, посколь ку в присутствии KRP олигомеризация нарушается [149] .

Установление доменной организации КЛЦМ началось с анализа продуктов ограниченного протеолиза l КЛЦМ [46, 54, 55, 101, 161, 224]. Последующее получение кДНК skКЛЦМ [85, 177] и l КЛЦМ [59, 71, 156, 186] позволило более детально картировать функцио нальные участки в первичной структуре различных КЛЦМ (рис. 2, см. цветную вкладку, стр. 386) .

Каталитические домены skКЛЦМ и l КЛЦМ в высокой степени гомологичны друг другу и каталитическим центрам других протеин киназ [71, 205]. Хотя их трехмерная организация не определена, она считается крайне сходной с таковой у других протеинкиназ [210] .



Были установлены кристаллические структуры каталитического домена твитчин киназы [90] и Са2+/СаМ зависимой протеинкиназы I типа [67], наиболее родственных КЛЦМ, а также протеинкиназы А [120], циклин зависимой киназы II [41], МАР киназы [230] и других. Ката литический домен этих протеинкиназ состоит из двух долей с актив ным центром в пределах линкерной последовательности. В КЛЦМ мень шая по размеру доля связывает MgATP так, что фосфат направлен внутрь активного центра, где он переносится на остаток Ser19 РЛЦ миозина, который, в свою очередь, ориентирован многоточечным связыванием РЛЦ большей долей каталитического домена .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 375 К С концу от каталитического ядра располагается регуляторный сегмент КЛЦМ, состоящий из автоингибиторного и CaM связываю щего участков. Регуляторные сегменты skКЛЦМ и l КЛЦМ также высоко гомологичны. С концевой KRP домен l КЛЦМ включает участок, ответственный за связывание с миозином вблизи зоны свя зывания РЛЦ [142, 185, 187]. К N–концу от каталитического центра расположены повторяющиеся структурные элементы, отсутствую щие в skКЛЦМ и КЛЦМ беспозвоночных. N–конец l КЛЦМ содер жит актин связывающий участок, на 100% гомологичный и более 95% идентичный в l КЛЦМ разных видов [191]. l КЛЦМ взаимо действует с филаментами нефосфорилированного миозина II типа и актина in vitro [184], а в клетках ассоциирована с актомиозин содер жащими волокнами [42, 70] .

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ КЛЦМ И КИНЕТИКА

ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РЛЦ

КЛЦМ (ATP:protein phosphotransferase, EC 2.7.1.37) является серин/треониновой протеинкиназой и проявляет высокую специ фичность к РЛЦ миозина [75, 171], тогда как активность по отноше нию ко всем другим исследованным субстратам меньше 1% по срав нению с РЛЦ [21]. l КЛЦМ фосфорилирует миозин и изолированные РЛЦ гладких мышц и немышечных тканей, однако практически не фосфорилирует миозин поперечнополосатых мышц [9, 21, 40, 81, 138]. Скорость фосфорилирования изолированных РЛЦ l КЛЦМ in vitro на порядок выше таковой для целого миозина [147]. Это может быть связано с конформационными особенностями гладкомышеч ного миозина и экранированием участка фосфорилирования, распо ложенными вблизи головками миозина. Так, в сложенной 10S кон формации миозин является плохим субстратом l КЛЦМ [36], но переход миозина в развернутую 6S конформацию вследствие увели чения ионной силы приводит к повышению скорости реакции [147] .

Напротив, skКЛЦМ фосфорилирует РЛЦ всех миозинов II типа [81] и ее активность по отношению к изолированным РЛЦ и целому мио зину сопоставима [171] .

Фосфорилирование гладкомышечного миозина l КЛЦМ является организованным процессом. In vitro l КЛЦМ сначала фосфорилирует РЛЦ одной из головок миозина, т.е. при включении 0,5 моль фосфата на 1 моль связанных с миозином РЛЦ каждая молекула миозина будет иметь одну фосфорилированную головку [165, 166]. Интересно, что skКЛЦМ может фосфорилировать обе головки миозина независимо [167]. Такое различие в механизме фосфорилирования, по видимому, связано с функционированием миозин связывающего KRP–домена 376 А.Ю.Хапчаев и др .

в l КЛЦМ (см. ниже), отсутствующего в skКЛЦМ. Скорее всего связывание KRP–домена с миозином координирует каталитический центр l КЛЦМ по отношению к РЛЦ только одной головки. Фосфо рилирование РЛЦ приводит к нарушению связывания KRP–домена с миозином и его диссоциации [185]. Поэтому, скорее всего, РЛЦ вто рой головки миозина фосфорилируется только из раствора с меньшей эффективностью .

l КЛЦМ фосфорилирует РЛЦ миозина гладких мышц по остат кам Ser19 и Thr18 in vitro, при этом преимущественно фосфорилируется Ser19 [91,93,94]. Фосфорилирование Ser19 абсолютно необходимо для активации миозина [94], что подтверждается активирующим эффек том имитирующей мутации Ser19 Asp [108]. Дополнительное фосфо рилирование Thr18 еще более стимулирует актин активируемую Mg2+ АТРазу миозина, однако протекает медленнее и требует более высоких концентраций l КЛЦМ in vitro. Модификация Thr18 под действием l КЛЦМ in vivo считается маловероятной, но, возможно, происходит при участии других протеинкиназ [91, 208] .

Важная роль основных аминокислотных остатков, расположен ных к N концу от Ser19 РЛЦ и служащих детерминантами узнавания субстрата для l КЛЦМ, была показана в ряде работ [97, 100, 115] .

Так, если удаление десяти N концевых аминокислотных остатков РЛЦ незначительно влияет на кинетические параметры l КЛЦМ, то замена последовательности Lys11 Lys12 Arg13 на кислые или нейтраль ные остатки снижает Vmax, а удаление этой последовательности пол ностью подавляет реакцию фосфорилирования [100]. В то же время этот кластер аминокислот оказывает меньшее влияние на фосфори лирование РЛЦ в составе миозина при удалении Lys11 Lys12 способ ность l КЛЦМ фосфорилировать и активировать миозин сохраняется [97]. Это еще раз указывает на возможную роль взаимодействия KRP домена l КЛЦМ с миозином в модуляции субстратной специфич ности l КЛЦМ .

Остаток Arg16 РЛЦ играет ключевую роль в субстратном узнавании l КЛЦМ. Перенос Arg16 в положение 15 смещает фосфорилирование с Ser19 на Thr18 [113], удаление Arg16 полностью подавляет фосфори лирование [97], а замена Arg16 Asp приводит к значительному сни жению Vmax реакции фосфорилирования [100]. Предполагается, что гуанидиновая группа Arg16 участвует в переносе остатка фосфорной кислоты. Кроме этого, остатки Val21 и Phe22 обеспечивают высокую скорость реакции, не оказывая существенного влияния на сродство [162]. Критичность остатков Arg16, Val21 и Phe22 РЛЦ как важных суб стратных детерминант для l КЛЦМ, была подтверждена сайт направ ленным мутагенезом и созданием химерных РЛЦ [242]. Таким образом, Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 377 консенсус субстратного узнавания l КЛЦМ можно определить пос ледовательностью Х Lys Lys Arg Х Х Arg Х Х Ser(P) Х Val Phe .

Определенные разными авторами кинетические константы реак ции переноса остатка фосфорной кислоты незначительно отлича ются в зависимости от источника фермента .

KmАТР для skКЛЦМ сос тавляет 0,15–0,28 мМ, тогда как l КЛЦМ обладает более высоким сродством (0,05–0,12 мМ). По разным данным, KmРЛЦ для обеих КЛЦМ варьирует от 5 до 24 µМ [9, 63, 75, 92, 238]. l КЛЦМ катали зирует перенос фосфата по последовательному механизму, при кото ром фермент сначала связывает Mg2+ АТР, а затем РЛЦ. Высвобож дение продуктов реакции происходит также последовательно, но в обратном порядке [193]. Продукты реакции фосфорилирования являются конкурентными ингибиторами l КЛЦМ (KiMgАDP равна 140 µM [92]) и skКЛЦМ (Kiфосфо РЛЦ равна 1,4 µМ [63]) .

В условиях in vitro l КЛЦМ способна катализировать обратную реакцию синтеза АТР из АDР в присутствии фосфорилированного миозина и Са2+/CaM [92]. Однако поскольку синтез АТР протекает значительно медленнее гидролиза, а АТР является сильным конку рентным ингибитором, эта реакция вряд ли реализуется in vivo .

КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ДОМЕН

По результатам исследований протеолитической деградации КЛЦМ каталитический домен был локализован ближе к С концевой части молекулы КЛЦМ. Было обнаружено, что последовательный протеолиз фермента приводит к отщеплению различных по длине N и С концевых частей и накоплением относительно устойчивого фрагмента размером 61 кДа. Этот фрагмент сохраняет каталитичес кое ядро и обладает активностью, параметры которой сопоставимы с таковыми полноразмерной КЛЦМ [101, 205]. Каталитическое ядро КЛЦМ состоит из 240 аминокислотных остатков, проявляющих высокую степень гомологии с каталитической субъединицей киназы фосфорилазы b и cGMP зависимой киназы [71]. По видимому, свя зывание Mg2+ АТР и создание условий для переноса фосфата ATP на модифицируемый остаток белка субстрата требует консерва тивной структуры, общей для всех протеинкиназ. В каталитическом ядре КЛЦМ такой консенсусной последовательностью является Gly Х Gly Х Х Gly (Х)14 Lys [71, 124]. Конформация Mg2+ АТР свя зывающего участка не подвергается заметным перестройкам и он постоянно доступен для связывания Mg2+ АТР [116, 124] .

К N концу от участка связывания Mg2+ АТР был выявлен клас тер, богатый кислыми остатками и высоко консервативный среди разных КЛЦМ. Мутации в этой области приводят к значительному 378 А.Ю.Хапчаев и др .

повышению КmРЛЦ, не влияя на Vmax фосфорилирования РЛЦ [80, 85] .

Аналогично, мутация Glu599 или Glu643 в каталитическом ядре l КЛЦМ птиц1 повышает КmРЛЦ соответственно в 35 и 100 раз [81]. Скорее всего, кислый участок к N–концу от области связывания Mg2+ АТР взаимо действует с кластером основных остатков Lys11 Lys12 Arg13 в РЛЦ. При этом происходит прочное удержание субстрата, а остатки Glu599 и Glu643 в каталитическом центре взаимодействуют с Arg16 РЛЦ, стаби лизируя фермент субстратный комплекс и координируя перенос фосфата на Ser19 РЛЦ. По видимому, такое многоточечное взаимо действие фермента с субстратом и обеспечивает высокую субстрат ную специфичность КЛЦМ и скорость фосфорилирования РЛЦ миозина .

РЕГУЛЯТОРНЫЙ СЕГМЕНТ

Наличие регуляторного сегмента в молекуле КЛЦМ было перво начально показано с помощью ограниченного протеолиза как skКЛЦМ, так и l КЛЦМ. Так, деградация l КЛЦМ сопровождается образованием неактивного 64 кДа фрагмента, который далее расщеп ляется до 61 кДа фрагмента с восстановлением киназной активности, уже не зависящей от Са2+/CaM [46, 54, 101, 224]. Была установлена идентичность N концевых последовательностей 64 и 61 кДа фраг ментов [46, 96], что послужило основанием для локализации регуля торного сегмента l КЛЦМ к С концу от каталитического домена .

Был предложен механизм деградации l КЛЦМ, согласно которому на первой стадии происходит отщепление как N концевой части, так и С концевого домена l КЛЦМ, включая CaM связывающий учас ток. Образующийся 64 кДа фрагмент неактивен вне зависимости от присутствия Са2+/CaM благодаря наличию автоингибиторной С кон цевой последовательности. Дальнейший протеолиз приводит к отщеп лению автоингибиторного пептида и образующийся 61 кДа фрагмент приобретает конститутивную активность [101]. Последующие иссле дования с применением синтетических пептидов, соответствующих определенным участкам skКЛЦМ и l КЛЦМ [26, 53, 114, 161], про теолитического расщепления l КЛЦМ [46, 96, 101, 163] и мутацион ного анализа [105, 186] позволили доказать существование автоинги биторной последовательности, картировать регуляторный сегмент и сформулировать гипотезу псевдосубстратного ингибирования .

С помощью направленного мутагенеза было показано, что авто ингибиторной является N концевая часть регуляторного сегмента [31], тогда как С концевая часть ответственна за связывание Са2+/CaM В данном обзоре единая нумерация остатков l КЛЦМ курицы используется для всех изоформ КЛЦМ, если не оговорено отдельно .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 379 [53, 186]. Частично перекрываясь, эти последовательности вместе формируют регуляторный сегмент КЛЦМ.

Так, в структуре l КЛЦМ курицы, регуляторной является следующая последовательность:

…787SKDRMKKYMARRKWQKTGHAVRAIGRLSS815…, где остатки, важные для автоингибирования выделены жирным шрифтом, Са2+/CaM связывающий участок подчеркнут, а остатки, принципиальные для связывания Са2+/CaM, выделены курсивом .

Первоначально ингибиторный участок был локализован в после довательности Lys786 Arg808, поскольку Arg808 был идентифицирован как С концевой остаток неактивного CaM нерегулируемого 64 кДа фрагмента, а Lys786 – как С концевой остаток конститутивно актив ного 61 кДа фрагмента [156, 163]. Кроме того, синтетические пептиды Ala783 Gly804 и Ser787 Val807 являются значительно более сильными конкурентными ингибиторами l КЛЦМ [114, 161], чем короткие пептиды Ala783 Ala796 и Arg797 Val807 [53]. Наконец, киназная актив ность мутанта l КЛЦМ, ограниченного с С конца по остатку Trp800, существенно ниже по сравнению с активностью мутантов, ограни ченных по Thr778 или Lys793, а наличие Arg797 и Arg798 является критич ным для ингибирования активности l КЛЦМ [97, 99] .

Анализ первичной структуры автоингибиторного участка l КЛЦМ показывает, что количество и расположение основных аминокислот крайне сходно с таковым в последовательности РЛЦ, окружающей фосфорилируемый Ser19. На этом основании было сделано предполо жение о том, что этот участок представляет собой псевдосубстратную последовательность. Согласно модели псевдосубстратного ингиби рования, автоингибиторный участок l КЛЦМ взаимодействует с активным центром фермента, имитируя связывание субстрата, тогда как связывание Са2+/CaM происходит в непосредственной близости и нарушает это взаимодействие [114, 163]. В подтверждение этой модели, в регуляторном участке были обнаружены две спиральные структуры Asp777 Lys785 и Arg790 Trp800, разделенные петлей, обеспечи вающей относительную подвижность каталитического домена и регу ляторного сегмента l КЛЦМ (рис. 3, см. цветную вкладку, стр. 387) .

Эта петля может служить гибким шарниром, позволяющим молекуле l КЛЦМ складываться так, что С концевая спираль взаимодействует с активным центром и ингибирует фермент. Связывание Са2+/CaM активирует l КЛЦМ благодаря отведению этой спирали в сторону от каталитического центра [20, 114] .

Последующие экспериментальные данные позволили пересмот реть псевдосубстратную модель. Так, было установлено, что основные остатки КЛЦМ, являющиеся предполагаемыми аналогами субстрат 380 А.Ю.Хапчаев и др .

ных детерминант РЛЦ, не критичны для автоингибирования фермента [78]. Напротив, наиболее важной для автоингибирования является область Tyr794–Met–Ala796 l КЛЦМ [207]. Более того, замена тех отрицательно заряженных остатков в каталитическом ядре l КЛЦМ, которые, согласно псевдосубстратной гипотезе, должны были бы взаимодействовать с основными остатками в псевдосубстратном участке, влияла на связывание автоингибиторной последователь ности, но не РЛЦ [128]. Интересно, что шесть из таких остатков кон сервативны и в других Са2+/CaM зависимых киназах, а их мутации ослабляют связывание автоингибиторной последовательности и по вышают способность Са2+/CaM активировать l КЛЦМ в 2–100 раз [60] .

Таким образом, хотя автоингибирование участвует во внутримо лекулярной регуляции активности l КЛЦМ, его механизм отличен от простой мимикрии РЛЦ. Эти и другие данные по пространствен ной структуре комплексов Са2+/CaM с CaM связывающими пепти дами skКЛЦМ [77, 102] и l КЛЦМ [144], позволили сформулировать более широкую концепцию о внутристерическом механизме регуля ции активности КЛЦМ (intrasteric autoregulation). Однако несмотря на постоянный интерес и непрекращающиеся исследования в этой области, до сих пор нет полного понимания структурных аспектов этого механизма .

Активация l КЛЦМ происходит при эквимолярном связывании Са2+/CaM [27, 37]. Структурные элементы CaM связывающих участ ков одинаковы для skКЛЦМ и l КЛЦМ, поскольку замена CaM свя зывающего участка skКЛЦМ эквивалентной последовательностью l КЛЦМ не изменяет способности Са2+/CaM активировать фермент [135]. Направленным мутагенезом было показано, что для прочного связывания Са2+/CaM важны остатки Arg 797 Lys799 и Gln801 Lys802 l КЛЦМ [52] (см. рис. 3), а гомологичные остатки skКЛЦМ выпол няют ту же функцию [78]. Удаление С концевой последовательности l КЛЦМ начиная от Ser815 не изменяет ни связывания Са2+/CaM, ни его способности регулировать активность l КЛЦМ. Однако после дующее удаление еще пяти С концевых остатков полностью нару шает связывание Са2+/CaM и приводит к образованию автоингибиро ванного фрагмента, активность которого восстанавливается только путем дальнейшего протеолиза. Вместе с тем с помощью сайт специ фического мутагенеза показано, что остатки Glu811 и Arg812 важны для CaM зависимой активации l КЛЦМ, а мутации гидрофобных остат ков Gly804, Ile810 и Leu813 приводят к значительному снижению или пол ной потере связывания Са2+/CaM [16,17] .

Таким образом, область вокруг Trp800 имеет крайне важное регу ляторное значение поскольку вовлечена как в автоингибирование Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 381 l КЛЦМ, так и в связывание Са2+/CaM. Интересно также, что нали чие именно остатка Trp достаточно характерно для CaM связываю щих последовательностей многих белков, включая и актин связы вающий белок кальдесмон [141]. Замена Trp800 l КЛЦМ на ряд других остатков (Gly, Met, Leu или Tyr) приводит к существенному сниже нию или полному ингибированию активности фермента даже в при сутствии насыщающих концентраций Са2+/CaM [143] .

Важную регуляторную функцию может выполнять фосфорили рование внутри регуляторного сегмента КЛЦМ. Так, КЛЦМ из слиз невика Dictyostelium гомологична l КЛЦМ высших эукариот, но зна чительно короче и, в том числе, не содержит С концевого KRP домена (см. рис. 2). Этот фермент не регулируется связыванием Са2+/CaM, но содержит автоингибиторную последовательность, удаление которой повышает активность КЛЦМ Dictyostelium в 10 раз [206]. Активация фермента достигается путем внутримолекулярного автофосфорили рования по остатку Thr289, который гомологичен остатку His805 l КЛЦМ, а также при фосфорилировании Thr166 неизвестной киназой [188] .

Гипотеза о том, что связывание Са2+/CaM и автофосфорилирова ние активируют КЛЦМ, нарушая взаимодействие автоингибитор ной последовательности с активным центром, подтверждается еще и тем, что моноклональные антитела против последовательности 808–815 l КЛЦМ активируют фермент в отсутствие Са2+/CaM [11] .

Таким образом, прочное связывание лиганда (в качестве которого может выступать комплекс Са2+/CaM, антитело или фосфат) в опре деленной области регуляторного сегмента l КЛЦМ приводит к дис социации автоингибиторной последовательности от каталитического центра, освобождая его для связывания субстрата [11, 18, 127]. Вполне вероятно, что отмеченная выше шарнирная петля, ограниченная остатками 785–790 l КЛЦМ, а также длина спирали, расположенной к С концу от этой петли, могут определять степень отведения автоин гибиторного участка от каталитического центра. В этом случае регу ляторный сегмент должен обладать определенной жесткостью. Дейст вительно, мутация Ala806 Pro приводит к стерическому излому пер вичной структуры и существенному подавлению связывания СаМ [158] .

Связывание Са2+ с CaM абсолютно необходимо для активации КЛЦМ, а сродство Са2+/CaM к l КЛЦМ очень высоко и составляет 1 нМ [9, 27, 106]. При этом ассоциация Са2+/CaM с КЛЦМ проис ходит значительно быстрее (kon меньше 0,002 s 1), чем диссоциация (koff = 0,03 s –1), которая возрастает в 100 раз при потере последним ионов Са2+ [106, 107]. Ряд исследований показал сложный и, возможно, ступенчатый механизм этих взаимодействий. Кроме того, что форми рование комплекса требует конформационных изменений в обоих 382 А.Ю.Хапчаев и др .

белках, исследование структуры кристалла комплекса Са2+/CaM с CaM связывающим пептидом КЛЦМ также выявило нетривиальность этого взаимодействия (см. ниже) .

В молекуле кальмодулина длинная центральная спираль прост ранственно разделяет два концевых глобулярных домена, каждый из которых содержит два Са2+ связывающих участка EF типа и вступает во взаимодействие с КЛЦМ. При этом, N концевой домен содержит участки низкого сродства, тогда как С концевой домен связывает Са2+ с высоким сродством. Таким образом, при изменении концент раций Са2+ в физиологических диапазонах насыщение СаМ ионами Са2+ и его связывание с КЛЦМ может происходить в два этапа. Более того, как показывает расчет, в нестимулированных клетках до 50–80% CaM может постоянно содержать Са2+ в С концевых Са2+ связываю щих участках и, таким образом, быть практически постоянно свя занным с КЛЦМ своим С концевым доменом [107]. Такого взаимо действия, однако, недостаточно для активации КЛЦМ, которая требует насыщения ионами Са2+ N концевого домена CaM и его последующего связывания с КЛЦМ .

С концевой домен CaM взаимодействует с l КЛЦМ электроста тически [218], что замедляет диссоциацию Са2+ из СаМ [111] .

В сис теме, содержащей Са2+, CaM и l КЛЦМ, все взаимодействия компо нентов происходят кооперативно. При этом, степень кооператив ности зависит от концентраций компонентов, а также от наличия субстрата l КЛЦМ – РЛЦ [157]. Экспериментально показано, что связывание РЛЦ вызывает переориентацию Са2+/CaM по отноше нию к l КЛЦМ, приводя к компактизации структуры l КЛЦМ и усилению связывания N концевого домена CaM с l КЛЦМ [129] .

Можно считать, что аналогичные изменения конформации белко вого комплекса могут происходить и в обратной последовательности при активации фосфорилирования РЛЦ. Другими словами, связыва ние С концевого домена СаМ с КЛЦМ возможно при низкой [Са2+]i, тогда как повышение уровня Са2+ приводит к усилению кооператив ных взаимодействий между Са2+ и СаМ, СаМ и КЛЦМ, последующей ассоциации N концевого домена СаМ с КЛЦМ, изомеризации моле кулы КЛЦМ с освобождением активного центра, связыванию и фос форилированию РЛЦ .

Описанная гипотеза имеет экспериментальные подтверждения в двух отношениях. Во первых, кинетический анализ взаимодействия изолированных С и N концевых доменов CaM с КЛЦМ действи тельно показывает их последовательное связывание, причем С концевой домен связывается первым [168]. Во вторых, простого связывания CaM оказывается недостаточно для активации КЛЦМ, так как Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 383 замена четырех остатков Met на Leu в CaM не изменяет сродства, но снижает способность такого мутанта активировать l КЛЦМ [47] .

Определенные мутации в регуляторном участке l КЛЦМ также приводят к появлению конститутивно активного фермента, но не изменяют связывания Са2+/CaM [186]. Хотя N конец CaM не кри тичен для образования комплекса CaM с пептидом, соответствую щим CaM связывающей области l КЛЦМ, способность CaM акти вировать l КЛЦМ зависит от наличия кислых N концевых остатков Glu6 Glu Glu8 [164]. Аналогично, мутант CaM с удаленными остат ками 2 8 связывается, но не активирует skКЛЦМ [126, 164]. Наконец, N конец CaM играет существенную роль в его ориентации отно сительно каталитического центра целой молекулы l КЛЦМ [126] .

Таким образом, специфические межбелковые контакты и их пра вильная ориентация относительно друг друга могут играть важную роль в активации КЛЦМ. Локализованные изменения элементарных взаимодействий могут не находить существенного отражения в таких измеряемых стандартными биохимическими методами параметрах связывания, как сродство, стехиометрия и даже скорость ассоциа ции диссоциации компонентов белкового комплекса. Как следствие, любые интервенции в субмолекулярную структуру компонентов таких комплексов с помощью молекулярно биологических и биохи мических модификаций могут давать весьма неожиданные резуль таты и приводить к неадекватным интерпретациям при отсутствии четкого понимания структурных основ взаимодействия .

Получение кристаллов комплекса Са2+/CaM с CaM связываю щим пептидом l КЛЦМ позволило установить молекулярную струк туру этого комплекса с высоким разрешением и выявить роль отдель ных остатков КЛЦМ в связывании Са2+/CaM [102, 144]. Шарнирная петля разделяет центральную спираль молекулы CaM на две части (остатки 65–93 и 74–82), обеспечивая относительную подвижность концевых глобулярных доменов CaM. Связывая пептид l КЛЦМ, Са2+/CaM значительно изменяет конформацию, складывается и обвивает одиночную спираль пептида так, что формирует туннель, в котором пептид располагается в антипараллельной ориентации, т.е .

С концевой домен CaM связывает N конец пептида, а N концевой домен CaM взаимодействует с С концом пептида. Между CaM и пептидом образуется около 185 контактов, но два гидрофобных остатка CaM связывающего пептида l КЛЦМ (Trp800 и Leu813) играют принципиальную якорную роль. Более того, одна сторона туннеля, образованного CaM, выстлана гидрофобными остатками, которые взаимодействуют с гидрофобной стороной спирального пептида .

Положительно заряженные остатки другой стороны пептида обра 384 А.Ю.Хапчаев и др .

зуют множественные солевые мостики с противоположной стороной туннеля, формируемой С концевым доменом CaM [144]. Жесткость спирали CaM связывающего пептида имеет важное значение и ее нарушение мутацией Ala806 Pro приводит к существенному сниже нию связывания CaM [158] .

Эти структурные данные и описанная выше последовательность взаимодействия С и N концевых доменов CaM с КЛЦМ позволяют предложить следующую модель активации КЛЦМ. Регуляторный сегмент КЛЦМ загнут в сторону каталитического ядра так, что его N концевой домен расположен дистально по отношению к активному центру фермента и сначала связывает С концевой домен Са2+/CaM за счет электростатических взаимодействий. Повышение уровня Са2+ сопровождается насыщением N концевых Са2+ связывающих участ ков CaM и экспонированием гидрофобных остатков в N концевом домене CaM. Это позволяет установление гидрофобных контактов и обеспечивает кооперативность процесса. Складываясь, молекула CaM обвивает регуляторный сегмент вдоль по направлению к его С концу, наиболее приближенному к активному центру КЛЦМ и, тем самым, блокирует взаимодействие автоингибиторной последо вательности КЛЦМ с активным центром, отводя ее в сторону. Вполне вероятно, что в пространстве и времени этот процесс напоминает застегивание молнии, где Са2+ играет роль поводка, а скорость про цесса обеспечивается описанной выше кооперативностью взаимо действий внутри этого белкового комплекса .

УЧАСТКИ СВЯЗЫВАНИЯ АКТИНА И МИОЗИНА

КЛЦМ взаимодействует с актином in vitro и in vivo. Сродство изолированной l КЛЦМ к F актину составляет 0,5–1 µМ, а стехио метрия связывания – 1 моль на 12–13 моль актина [237], что соответ ствует связыванию одной молекулы l КЛЦМ на полный оборот спирали актинового филамента. Сродство l КЛЦМ к актин тропо миозину выше в 2–3 раза, хотя прямого взаимодействия l КЛЦМ с тропомиозином не показано. По видимому, связывание тропомио зина приводит к конформационным перестройкам или стабилизации F актина, усиливая связывание l КЛЦМ. В клетках l КЛЦМ также колокализуется с актин содержащими миофиламентами [42, 136, 237] .

Работы с использованием изолированных рекомбинантных фраг ментов и делеционных мутантов l КЛЦМ, экспрессированных в клетках, убедительно доказывают, что актин связывающий участок l КЛЦМ расположен непосредственно в N конце молекулы, в пределах первых 63 остатков [61, 110, 190, 191, 239]. Этот участок крайне консервативен (95%) среди различных l MLCK. Последова Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 385 386 А.Ю.Хапчаев и др .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 387 388 А.Ю.Хапчаев и др .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 389 тельности 2–7, 30–35 и 58–63 представляют собой три мотива Asp Phe Arg Х Х Leu, формирующих контакты с актином (рис. 3). Как и для актин связывающих участков некоторых других белков, напри мер, кальдесмона, для этой последовательности характерно наличие ароматического остатка, в данном случае, фениаланина. Направ ленная замена любого из этих мотивов на остатки Ala существенно понижает, а замена двух мотивов полностью подавляет связывание l КЛЦМ с актином [190, 191]. Анализ кругового дихроизма показал линейную ориентацию актин связывающего домена l КЛЦМ и расчетное расстояние между Asp Phe Arg Х Х Leu мотивами соста вило 12 нм, что сопоставимо со средним радиусом мономера актина (9, 0–9,5 нм). На основании этих данных была предложена гипотеза, согласно которой N концевой участок l КЛЦМ взаимодействует с актиновым филаментом продольно и каждый Asp Phe Arg Х Х Leu мотив связывается с отдельным мономером актина [190]. Возможно, именно такое связывание обеспечивает более прочное взаимодейст вие КЛЦМ с нативными миофиламентами по сравнению с реконст руированным F актином [136] .

Если l КЛЦМ связывается с несколькими мономерами актина одновременно, то возникает вопрос о стерических возможностях этого взаимодействия, если тонкий филамент декорирован другими актин связывающими белками .

Ответ на этот вопрос был получен с помощью трехмерной реконструкции электронномикроскопических изображений комплекса 147 членного N концевого фрагмента l КЛЦМ с филаментами актина [74]. Оказалось, что этот фрагмент связывается в области актина, определенно отличной от областей связывания тропомиозина, кальдесмона, кальпонина и головок миозина. Более того, карты электронной плотности показывают, что во взаимодействие вовлечены два соседних мономера актина .

Поскольку этот метод не позволяет определить отрезок филамента актина, перекрываемый одной молекулой фрагмента, то эти данные не только не противоречат, но и отчасти подтверждают гипотезу о продольном связывании l КЛЦМ с актином [136]. Еще одним подтверждением такой гипотезы является способность l КЛЦМ сшивать актиновые филаменты и собирать их в толстые пучки in vitro [76, 239]. Вероятно, это является результатом взаимодействия актин связывающих центров l КЛЦМ с мономерами актина, расположен ными в разных филаментах .

Взаимодействие l КЛЦМ с миозином не ограничивается только связыванием РЛЦ как субстрата в процессе катализа. Было обнару жено, что препараты гладкомышечного миозина содержат прочно связанную l КЛЦМ, диссоциация которой достигается при переходе 390 А.Ю.Хапчаев и др .

миозина в сложенную 10S конформацию. Кроме того связывание l КЛЦМ ослабляется при фосфорилировании миозина [36] .

Если РЛЦ связывающий участок локализован в каталитическом центре фермента, то участок некаталитического взаимодействия расположен в С концевом KRP домене КЛЦМ [185, 187], который экспрессируется в гладкой мускулатуре и сердце как индивидуальный белок. Поскольку константы связывания как l КЛЦМ [184], так и KRP [187] с миозином составляют около 5 µМ, KRP можно исполь зовать для характеристики этого взаимодействия in vitro. Делеция различных по длине N и С концевых последовательностей KRP приводит к градуальному уменьшению сродства KRP к миозину, но наиболее существенными являются 20 С концевых, преимущест венно, отрицательно заряженных остатков, удаление которых приво дит к снижению сродства почти на порядок [187]. Таким образом, хотя весь Ig домен KRP вовлечен в связывание миозина, высокое сродство этого взаимодействия обеспечивает его уникальная С концевая последовательность, гомологичная Gly953 Asp966 l КЛЦМ птиц (рис. 2 и 3) .

Отличительной особенностью связывания KRP и, по всей вероят ности, l КЛЦМ с миозином является их взаимодействие только с нефосфорилированными гладкомышечным и немышечным миози нами [185]. Ни фосфорилированный по Ser19 миозин, ни миозин поперечнополосатых мышц не способны связывать KRP или С кон цевой домен l КЛЦМ. Стехиометрия взаимодействия составляет 1:1 [185], а участок связывания KRP расположен в области шейки миозина, т.е. в зоне раздвоения тяжелых цепей и в непосредственной близости от участка связывания РЛЦ [142, 152, 187]. Скорее всего, именно этим объясняется негативный эффект фосфорилирования РЛЦ на связы вание KRP и l КЛЦМ .

С концевой домен, скорее всего, выполняет функцию координа ции активного центра l КЛЦМ по отношению к одной из РЛЦ, с чем связана вышеупомянутая организованность процесса фосфори лирования миозина. Интересна организация миозин связывающей последовательности KRP домена: она преимущественно образована чередующимися остатками Gly и Glu. Принимая во внимание взаим ное отталкивание боковых групп остатков Glu и то, что присутствие остатка Gly значительно повышает свободу вращения вокруг пептид ной связи, можно предположить, что этот участок молекулы l КЛЦМ имеет вытянутую структуру. Возможно, взаимодействие этой струк туры с положительно заряженным кластером на тяжелой цепи вблизи участка связывания РЛЦ и обеспечивает удержание l КЛЦМ на миозине .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 391 Другой функцией KRP домена l КЛЦМ может быть выполнение роли мостика, соединяющего филаменты актина и дефосфорилиро ванного миозина. Так, l КЛЦМ может «сшивать» актин с миозином и тормозить АТР зависимое движение актиновых филаментов по фиксированному на стекле гладкомышечному миозину в системе искусственных нитей (in vitro motility assay) [122, 154, 239]. Важную роль в этом ингибировании играл именно актин связывающий учас ток l КЛЦМ [122, 239], тогда как взаимодействие с фосфорилиро ванным миозином опосредовал каталитический домен l КЛЦМ [154]. Таким образом, если KRP домен связывает l КЛЦМ с нефос форилированным миозином, то в случае фосфорилированного миозина главную роль играет взаимодействие РЛЦ связывающего участка l КЛЦМ .

Отмечено, что Са2+/CaM ингибирует связывание l КЛЦМ с акти ном и миозином [184], а также ослабляет ингибиторный эффект l КЛЦМ на движение актина вдоль миозина [239]. Аналогичное действие оказывает Са2+/CaM и на способность l КЛЦМ пучковать актин [76]. Однако вероятнее всего, эти эффекты характерны для условий in vitro, поскольку Са2+/CaM не вызывает диссоциации l КЛЦМ от филаментов в клетках [136]. Таким образом, l КЛЦМ может взаимодействовать с филаментами актина независимо от других актин связывающих белков и ее диссоциация не является необходимой для фосфорилирования миозина in vivo .

ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Анализ структуры l КЛЦМ разных видов показывает их крайне сходную доменную организацию и высокую гомологию (рис. 2). В то же время, КЛЦМ существенно различаются по молекулярной массе .

Это обусловлено наличием или отсутствием двух типов тандемных повторов, разных по длине и расположенных в N концевой части молекул КЛЦМ. Под термином «тандемный повтор» принято пони мать последовательность, которая содержит два четко выделяемых консервативных элемента (тандем) и повторяется некоторое коли чество раз. Непосредственно в N конце l КЛЦМ располагаются три 28 членных тандемных повтора, включающих актин связывающие участки. Сразу вслед за ними начинаются тандемные KPV/A пов торы, состоящие из 12 остатков. Тандемные повторы этого типа пока найдены только у КЛЦМ млекопитающих и отсутствуют в КЛЦМ птиц. Различия в величине молекул l КЛЦМ разных видов объясня ются наличием разного числа именно этих повторов .

392 А.Ю.Хапчаев и др .

В первичной структуре N концевых повторов действительно консервативны только остатки Asp Phe Arg Х Х Leu, вовлеченные в связывание актина [191]. Что касается остальной части тандема, то ее консервативность выражена довольно слабо.

В то же время, необхо димо отметить наличие трех областей, богатых остатками Pro, Arg/Lys и Thr (последовательности приведены по структуре l КЛЦМ кролика):

(1) Val Lys Pro Lys Thr Val16 (2) Thr Pro Lys Thr Pro Val Pro46 (3) Pro Pro Pro Lys Pro Ala Thr Pro57 В настоящее время функция этих последовательностей неясна, однако, можно сделать интересные наблюдения и предположения .

Во первых, остатки Pro как правило определяют специфические особенности вторичной структуры полипептидов. Они часто входят в состав консенсусных последовательностей, узнаваемых молекулами сигнальных белков, содержащих модульные домены SH3, WW, EVH1 и др. В их числе недавно описаны несколько типов WW доменов, свя зывание которых очень чувствительно к положению и/или ориентации остатка Pro [103, 201]. Так, структура (3) полностью отвечает консен сусным требованиям для связывания с WW доменами III типа. Воз можно, существуют и другие модульные структуры, способные взаи модействовать с этими последовательностями, модулировать связы вание КЛЦМ с актином и переопределять внутриклеточное располо жение КЛЦМ. С этой точки зрения интересно первое сообщение о возможной роли этих последовательностей во взаимодействии l КЛЦМ и h КЛЦМ с актин связывающим белком кортактином, которое еще более усиливается при фосфорилировании кортактина по остаткам Tyr [44]. Поскольку кортактин локализуется в ламеллоподиях и вовлечен в процессы перестройки кортикального цитоскелета [227], он может служить для приведения КЛЦМ в примембранную область для участия, например, в регуляции динамики стресс фибрилл при адгезии и миграции клеток .

Во вторых, последовательности (2) и (3) содержат остатки Thr, потенциально узнаваемые пролин направленными киназами (т.е., МАР киназами, р34cdc2 циклин зависимой киназой и др.). Более того, МАР киназа действительно фосфорилирует Thr43 и, возможно, Thr40 l КЛЦМ2. В 1996 году были впервые описаны белки, содержащие WW домены IV типа, которые специфически связывают остатки, фосфорилированные пролин направленными киназами [137]. Воз можно, фосфорилирование КЛЦМ в пределах последовательности (2) может выполнять сходную функцию и обеспечивать ее внутри Хапчаев А.Ю., Воротников А.В., неопубликованные данные .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 393 клеточную локализацию или регуляцию в процессе клеточного цикла (см. раздел «Фосфорилирование») .

В третьих, в связи со множеством выполняемых КЛЦМ внутри клеточных функций, сама идея о наличии модульных структур в этом белке приобретает большое значение. Недавно было показано, что одна из изоформ h КЛЦМ способна фосфорилироваться in vitro Src киназой по остатку тирозина и высказано предположение, что такое фосфорилирование может играть роль в компарментализован ной внутриклеточной активации h КЛЦМ [23]. Анализ первичной структуры l КЛЦМ также позволяет выявить дополнительные участки потенциального взаимодействия с модульными доменами других белков. К ним относятся последовательности Pro Lys Thr Pro, гомо логичные представленной выше в структуре (2) и расположенные с N конца от второго и третьего иммуноглобулин подобных повторов l КЛЦМ (см. ниже). Эти участки фосфорилируются пролин направ ленными протеинкиназами [1, 146] и, следовательно, могут быть мишенями белков, содержащих WW домены IV типа. Кроме того, в l КЛЦМ птиц, в отличие от белка млекопитающих, присутствуют другие участки потенциального узнавания модульными доменами .

Они расположены в короткой области, заменяющей тандемные KPV/A повторы в КЛЦМ млекопитающих, и представлены участ ками PAPKPV103 и KPTPPP144, тогда как гомологичными последова тельностями в КЛЦМ млекопитающих являются NEKPP и ETLKPV, соответственно .

Таким образом, с нашей точки зрения, повторяющиеся N конце вые последовательности КЛЦМ вряд ли можно рассматривать как тандемные. Скорее всего, они содержат гомологичные участки свя зывания актина, между которыми, как мы предполагаем, располо жены области связывания модульных доменов сигнальных или скаф фолдинговых белков (т.е., составляющих каркас для сборки белковых комплексов). Однако эта гипотеза нуждается в экспериментальном подтверждении .

KPV/A повторы содержат 12 аминокислотный модуль TLKPVGNIKPAE, последовательно повторяющийся несколько раз .

Так, l КЛЦМ кролика содержит 18 таких повторов [59], человека – 5 [173], а быка – 20 [121]. Интересно, что этот модуль и его субповтор (KPV/A) также обнаруживаются и в других белках, некоторые из которых взаимодействуют с хроматиновыми структурами [59] .

Функции KPV/A повторов до сих пор неизвестны. В их структуре выявляется некоторое сходство (но не гомология) с недавно описан ными РРАК участками саркомерного белка титина, консенсусной особенностью которых является наличие нескольких KVP и KPV 394 А.Ю.Хапчаев и др .

повторов. РРАК последовательности входят кластерами в состав так называемого PEVK домена титина (т.е., богатого остатками Pro, Glu, Val и Lys), где они, по видимому, разделены спирализоваными поли Glu сегментами [68]. Ни вторичная, ни пространственная структуры PEVK доменов в настоящее время не установлены, но известно, что эти домены являются пружинными элементами саркомеров и обес печивают их пассивный тонус [69, 215]. Так, гигантская молекула титина (длиной до 1 µm и весом около 3000 кДа) распологается вдоль саркомера, закрепляясь одним концом к Z диску, а другим концом к середине миозиновых филаментов. Две молекулы титина перекры вают саркомер, направляясь друг к другу с противоположных сторон и встречаясь в М линии. При растяжении саркомера, молекулы титина пружинообразно растягиваются за счет расплетания PEVK домена, примыкающего к Z линии, не допуская неравномерного натяжения полусаркомеров. Именно наличие большого количества остатков Pro и обеспечивает, по видимому, такое обратимое расплетание .

Можно предполагать, что подобным свойством обладают и тан демные KPV/A повторы в l КЛЦМ. В пользу такой гипотезы свиде тельствует поразительное сходство этих двух функционально различ ных белков. И титин, и КЛЦМ взаимодействуют с актином и миози ном различными концами молекул, обладают протеинкиназной активностью, а также несут и другие общие структурные элементы .

Таковыми являются иммуноглобулин подобные (Ig ) и фибронек тин подобные (FN ) домены, гомологичные СН2 домену иммуно глобулинов и домену III типа фибронектина, соответственно. Более того, одной из функций Ig доменов титина также является обратимое расплетание при удлинении саркомера свыше нормы и/или при длительной силовой нагрузке [145] .

FN и Ig домены расположены вокруг каталитического и регуля торного сегментов l КЛЦМ и h КЛЦМ (рис. 2). Другими использу емыми для них названиями они обязаны структурной гомологии с твитчином, продуктом гена unc 22 Caenorhabditis elegans, и прожекти ном из Drosophila, которые также являются гомологами титина. В связи с этим, FN и Ig домены получили название uncI и uncII, соот ветственно [156]. Именно С концевой Ig домен l КЛЦМ, а соответ ствено и h КЛЦМ, независимо экспрессируется с генетического локуса КЛЦМ как белок KRP [33, 58] .

FN и Ig домены обнаружены также во внеклеточной части ряда мембранных рецепторов и белков, взаимодействующих с компонен тами внеклеточного матрикса [186], где их роль недостаточно выяс нена. Учитывая обратимость рефолдинга Ig доменов, можно предполо жить, что они выполняют сходную внеклеточную функцию. Так, Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 395 физически изменяя длину связи с матриксом, эти домены могут поз волять клетке удерживать адгезивные контакты при незначительных перемещениях и флуктуациях мембран, разрывая контакт только при возникновении значительной силовой нагрузки .

Весьма заманчиво предположить, что Ig домены, также как и тан демные KPV/A повторы, играют аналогичную роль и в КЛЦМ. Если КЛЦМ одновременно взаимодействует с филаментами актина и мио зина противоположными концами молекулы, то перемещение этих филаментов относительно друг друга при сокращении или движении клетки должно неизбежно приводить к напряжению сдвига и отрыву одного из концов КЛЦМ, если ее молекула ригидна и не обладает способностью к растяжению. Аналогично титину и внеклеточным Ig доменам, тандемные KPV/A повторы и Ig домены могли бы обес печивать возможность дискретного растяжения КЛЦМ в зависимости от приложенной нагрузки при перемещении филаментов актина и миозина вдоль друг друга .

Интересно, что skКЛЦМ не содержит ни тандемных повторов, ни Ig и FN доменов (рис. 2). Возможно, это как раз связано с отсут ствием актин и миозин связывающих участков в этой форме КЛЦМ .

По всей видимости, skКЛЦМ фосфорилирует РЛЦ миозина из раствора, что снижает эффективность этого процесса. Действительно, фосфорилирование РЛЦ миозина не является ключевым для сокра щения поперечнополосатой мускулатуры и происходит только в условиях гиперстимуляции, выполняя модуляторную функцию [203] .

Альтернативно, способность Ig доменов к рефолдингу может не играть существенной роли в l КЛЦМ/h КЛЦМ и их наличие может быть эволюционно рудиментарным или предназначенным для других, пока неизвестных целей. Так, С концевой KRP домен этих белков практически целиком состоит из Ig домена и отвечает за связывание с миозином гладких мышц [185]. В то же время, миозин связываю щая активность может быть обусловлена уникальной С концевой последовательностью KRP домена [187], поскольку для внутренних Ig доменов КЛЦМ она пока не показана. В то же время, необходимо отметить, что в титине и С белке из поперечнополосатых мышц функ цией Ig доменов также может быть взаимодействие с миозином и/или ассоциированными с ним белками, важное для структурной органи зации миозиновых филаментов [69] .

МОДЕЛЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЦМ В КЛЕТКЕ

Содержание l КЛЦМ варьирует в фазных и тонических гладких мышцах и составляет от 1,6 до 4,6 µM [10]. Поскольку содержание миозина составляет до 80 µM, то на одну молекулу l КЛЦМ прихо 396 А.Ю.Хапчаев и др .

дится более 20 молекул миозина. Очевидно, что при активации сокра щения одна молекула l КЛЦМ должна фосфорилировать несколько головок миозина для достижения физиологически значимого уровня фосфорилирования миозина. Так как КЛЦМ закреплена N концом на филаменте актина, а ее субстрат также иммобилизован в фила ментных структурах, можно предположить, что фосфорилирование миозина происходит по механизму циклического твердофазного катализа .

В отсутствие Са2+/CaM, молекула l КЛЦМ находится в неактивной «сложенной» конформации так, что ее С концевая часть обращена к N концу, обеспечивая связывание автоингибиторной последовательности с каталитическим центром и внутримолекуляр ное ингибирование КЛЦМ. Связывание Са2+/CaM разворачивает и активирует КЛЦМ. Молекула l КЛЦМ может перекрывать расстоя ние между филаментами актина и миозина, которое составляет in vivo около 15 нм [158], и взаимодействовать с противолежащей ей молекулой миозина своим KRP доменом. Такое взаимодействие уве личивает эффективность фосфорилирования РЛЦ, однако, после этого каталитический и KRP домены диссоциируют от фосфорили рованного миозина [185]. Продвижение миозинового филамента относительно актинового приводит головку следующей молекулы миозина к КЛЦМ для фосфорилирования, и цикл повторяется. Такой механизм мог бы объяснить относительно быстрое и прогрессивное увеличение степени фосфорилирования миозина при активации сокращения гладких мышц. Таким образом, диссоциация киназы от уже фосфорилированного миозина и модификация следующей головки не менее важна, чем активация КЛЦМ комплексом Са2+/CaM .

Процессы диссоциации ассоциации КЛЦМ, скорее всего, регули руются дополнительно, и наличие KRP или фосфорилирование КЛЦМ другими протеинкиназами может вносить существенный вклад .

В немышечных клетках только часть актина и миозина II типа образуют актомиозин, тогда как до 50% миозина может находиться в мономерной (растворимой) форме, а существенная часть актина формирует кортикальный цитоскелет, не содержащий миозина .

Поэтому предложенный выше механизм функционирования КЛЦМ реализуется, скорее всего, в структурированном актомиозине, а активация мономерного миозина осуществляется КЛЦМ из раствора или другими киназами (см. раздел VIII). В силу небольших размеров и внутриклеточной дисперсии, актомиозин обычно не генерирует тотального поляризованного сокращения в немышечных клетках, но участвует в их локомоции и обеспечивает локальные формы подвиж ности, такие как цитокинез, эндоцитоз, кэпирование рецепторов и др .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 397 V. h КЛЦМ h КЛЦМ включает всю последовательность l КЛЦМ и содержит дополнительную N концевую часть, составляющую около половины массы этого белка (рис. 2). Как следствие такой структурной органи зации, h КЛЦМ должна обладать всеми свойствами l КЛЦМ и иметь новые свойства, отсутствующие у последней .

В библиотеке кДНК эндотелия человека обнаружены четыре вида кДНК h КЛЦМ, кодирующих изоформы КЛЦМ2, 3а, 3b и 4, которые являются результатом альтернативного сплайсинга пре мРНК. В КЛЦМ3а отсутствует экзон 28, в КЛЦМ3b – экзоны 9 и 28, а КЛЦМ4 не содержит экзона 25. Однако в тканях и клетках человека обнару жены лишь два белковых продукта: полноразмерная h КЛЦМ1 и доминирующая изоформа h КЛЦМ2 с делецией экзона 9. Этот экзон кодирует 69 членную последовательность, содержащую консен сусные участки фосфорилирования тирозинкиназой р60src [133] .

В структуре уникальной N концевой последовательности h КЛЦМ идентифицировано шесть Ig подобных доменов СH2 типа, разделен ных короткими и, вероятно, гибкими звеньями [133, 225]. Роль этих доменов в h КЛЦМ окончательно не выяснена, однако, возможно, они формируют структурную основу функциональных доменов h КЛЦМ. В С конце уникальной последовательности h КЛЦМ рас положены два актин связывающих мотива Asp Phe/Val Arg Х Х Leu, которые вместе с тремя подобными мотивами в N конце l КЛЦМ формируют единый актин связывающий домен с выраженной перио дической структурой [131, 172] .

Как белок, h КЛЦМ крайне склонна к протеолитической дегра дации, что долгое время затрудняло ее биохимическую характерис тику. Был разработан метод аффинной очистки h КЛЦМ, что поз волило исследовать кинетические параметры h КЛЦМ и ее взаимо действие с компонентами цитоскелета in vitro [4, 131]. Как и ожида лось, удельная активность h КЛЦМ и ее зависимость от Са2+/CaM оказались сопоставимыми с соответствующими параметрами l КЛЦМ .

Ферментативная активность h КЛЦМ, экспрессированной в баку ловирусной системе, оказалась сходной с активностью фермента, выделенного из ткани аорты [23]. Так же как и l КЛЦМ, h КЛЦМ взаимодействует с филаментами актина и миозина, при этом уни кальная часть h КЛЦМ вносит дополнительный вклад в связывание с актином. Это определяется наличием в ее составе вышеупомянутых актин связывающих мотивов и других актин связывающих участков, структура которых окончательно не установлена ([131, 172, 189], 3) .

Кудряшов Д.С., Ширинский В.П., неопубликованные данные .

398 А.Ю.Хапчаев и др .

Трансфекция кДНК уникального N концевого домена h КЛЦМ в культивируемые клетки выявила его колокализацию с микрофи ламентами [4, 131], а дифференциальная экстракция изоформ КЛЦМ из клеток свидетельствует в пользу возможного взаимодействия h КЛЦМ и с другими компонентами цитоскелета [131, 189] .

Таким образом, можно предположить, что в дополнение к извест ным для l КЛЦМ функциям, главной из которых является активация АТPазы миозина, h КЛЦМ может играть в клетках роль молекуляр ного интегратора цитоскелета, координируя взаимодействие его основных компонентов в процессе клеточной подвижности. С другой стороны, h КЛЦМ может выполнять роль фиксатора актиновых филаментов в местах их перекреста, стабилизируя цитоскелет .

Экспрессия h КЛЦМ изменяется в онтогенезе. Так, экспрессия h КЛЦМ максимальна во время раннего развития и снижается после рождения. Интересно, что экспрессия l КЛЦМ, напротив, относи тельно низка в эмбриональном, однако повышается в постнатальном периоде, и l КЛЦМ становится доминирующей изоформой в гладких мышцах и немышечных тканях [24, 51, 57]. h КЛЦМ также экспрес сируется в миобластах – предшественниках скелетных мышц, но замещается на l КЛЦМ и skКЛЦМ при последующей дифференци ровке клеток [79]. Вероятно, стабилизирующая функция h КЛЦМ особенно важна в эмбриональном периоде при созревании различ ных клеточных структур, например, саркомеров, что и обусловливает высокий уровень экспрессии h КЛЦМ в эмбриональных тканях .

Вместе с тем, h КЛЦМ продолжает экспрессироваться в эпителии, эндотелии, аортальных гладкомышечных клетках и, возможно, в других клетках взрослых животных и человека [4, 24]. В эндотелии и многих культивируемых клетках h КЛЦМ является основной, если не единственной изоформой КЛЦМ [219, 220, Ширинский В.П., неопубл. данные], что свидетельствует о ее самодостаточности в под держании актомиозин зависимой клеточной подвижности .

Следует отметить, что полное структурное сходство l КЛЦМ с С концевой частью h КЛЦМ, как на уровне гена, так и на уровне белка, делает нетривиальным исследование коэкспрессии изоформ КЛЦМ в клетках организма, не позволяя селективно выявлять l КЛЦМ стандартными иммуногистохимическими методами или гиб ридизацией in situ. В этой связи нельзя исключить, что преобладание l КЛЦМ в тканях взрослых животных, измеряемое методом имму ноблоттинга, отражает не только изменение характера экспрессии КЛЦМ в клетках паренхимы, но и степень развития сосудов в ткани, которые могут являться источником низкомолекулярной изоформы .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 399 Чтобы разрешить эту проблему, требуется разработка надежных мето дов количественной детекции изоформ КЛЦМ на срезах тканей .

VI. KRP Как независимый продукт генетического локуса КЛЦМ, KRP был впервые получен и идентифицирован стандартными биохими ческими методами [104]. KRP был выделен из мускульного желудка курицы и охарактеризован как кислый (pI 4,5) 17 кДа белок, реаги рующий с поликлональными антителами против l КЛЦМ. Секвени рование нескольких пептидов и определение блокирующей N кон цевой группы этого белка позволили предположить, что он является независимо экспрессирующимся С концевым доменом l КЛЦМ. В то же время, в этой ткани была обнаружена новая мРНК, соответству ющая 520 парам оснований 3' конца кДНК l КЛЦМ и являющаяся результатом транскрипции с независимого промотора, расположен ного в интроне гена l КЛЦМ [33, 58] (рис. 1) .

Было показано, что возможны два варианта сплайсирования в самом начале второго экзона KRP, что приводит к вставке одного остатка Glu в положение 29 [226]. Однако изоморфизм KRP не огра ничивается альтернативным сплайсингом. При анализе продуктов протеолиза очищенного KRP были обнаружены три ацетилирован ных по N концу пептида, соответствующих началу трансляции KRP с Met1, Met3 или Met8 и представленных в соотношении 1: 1 :3, соответственно [178]. Кроме того, масс спектрометрический анализ очищенного KRP выявил разное количество С концевых остатков Glu (от 0 до 5), хотя мРНК KRP кодирует шесть последовательно расположенных остатков [178] .

С помощью рентгеновской дифракции кристалла KRP опре делено пространственное положение 103 центральных (Val33 Met135) из 154 остатков KRP [87]. Образуемая ими структура может быть оха рактеризована как бочонок, формируемый семью антипараллель ными листами, расположенными двумя пластами один против дру гого (см. рис. 4 в обзорe [2]). Один пласт содержит четыре листа, другой – три. Подобную структуру имеют СН2 домены иммуно глобулинов. Однако, в отличие от СН2 домена, KRP не содержит внутримолекулярной дисульфидной связи, хотя два остатка Cys63 и Cys115 расположены в структурно идентичных позициях. Молекуляр o ные размеры KRP составляют 47 х24х 31 А и радиус Стокса равен 28,7 o А [12, 87] .

KRP содержит основной миозин связывающий участок КЛЦМ [185] и является конкурентным ингибитором фосфорилирования 400 А.Ю.Хапчаев и др .

миозина под действием l КЛЦМ in vitro [187]. Скорее всего, это явля ется следствием нарушения взаимодействия КЛЦМ с субстратом, в результате чего l КЛЦМ фосфорилирует миозин из раствора. Об этом свидетельствует увеличение Km для миозина реакции фосфорилиро вания без изменения Vmax в присутствии KRP [187] .

C помощью электронной микроскопии [142] и использования делеционных мутантов миозина [187] KRP связывающая область миозина была локализована в месте контакта РЛЦ с тяжелыми цепями миозина, т.е. там, где головка соединяется со стержневой частью мио зина. KRP стехиометрически взаимодействует только с нефосфори лированным миозином, причем для прочного связывания необходима С концевая последовательность Gly138 Asp151 KRP [187]. В ATP со держащих физиологических растворах такое взаимодействие препят ствует конформационному переходу молекулы миозина из развер нутого (6S) в свернутое (10S) состояние, аналогично эффекту фосфо рилирования РЛЦ [185]. Поскольку только 6S миозин способен формировать филаменты, была высказана гипотеза о том, что в покоя щейся клетке KRP стабилизирует филаменты нефосфорилирован ного миозина и поддерживает структуру сократительного аппарата [185, 221]. Интересно, что KRP не взаимодействует с миозинами попе речнополосатых мышц, молекулы которых не способны к ATP за висимому изменению конформации. Возможно, что избиратель ность KRP в связывании и регуляции определенных миозинов может находить отражение в тканеспецифичной экспрессии этого белка .

KRP экспрессируется преимущественно в гладкой мускулатуре .

При этом, количество этого белка значительно меньше в тонических мышцах, чем в фазных [1, 58, 84, 231], где оно сопоставимо с кон центрацией миозина [185] и где уровень фосфорилирования РЛЦ может быть недостаточен для поддержания филаментной структуры миозина. На всем протяжении онтогенеза KRP экспрессируется на высоком уровне только в гладких мышцах и мышцах сердца [24, 58, 84] и в небольших количествах в легких и соединительной ткани [240] .

В полном согласии со способностью KRP связываться с миози ном in vitro, методами иммунофлуоресценции трансфицированных клеток и окраской цитоскелетов Cy3 меченным KRP была показана колокализация KRP с миозином II типа [132]. Более того, трансген ные клетки HeLa, постоянно экспрессирующие KRP, проявляют повышенную адгезивную и миграционную активность по сравнению с клетками, не содержащими KRP (Дуднакова Т.В., Ширинский В.П., неопубл. данные). Предполагается, что этот эффект KRP обусловлен тем, что в немышечных клетках до 50% миозина II может находиться в мономерной форме и не участвовать в образовании филаментов .

Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 401 Cдвигая равновесие между мономерным и филаментарным миози ном в пользу последнего, KRP увеличивает количество готовых к силогенерации филаментов миозина, способствуя более быстрому и выраженному двигательному ответу клетки. Вместе с тем предложена альтернативная гипотеза, согласно которой KRP участвует в расслаб лении гладких мышц и этот эффект усиливается при фосфорилиро вании KRP [223, 231]. К сожалению, полученные к настоящему вре мени экспериментальные данные пока не позволяют отдать предпоч тение какой либо из этих гипотез и идентифицировать механизм действия KRP in vivo .

VII. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ

ГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛОКУСА КЛЦМ

В настоящее время стало очевидным, что фосфорилирование может быть важным для регуляции функций КЛЦМ и KRP. Эти белки являются субстратами различных протеинкиназ in vitro, а также фос фобелками in vivo. Очищенная из гладких мышц l КЛЦМ разделяется на три фракции высокоэффективной жидкостной хроматографией, а предобработка фосфатазой приводит к изменению профиля элю ции и соотношения белковых пиков, указывая на наличие in vivo по крайней мере трех форм l КЛЦМ, характеризующихся различным содержанием фосфата [39, 48]. Аналогично, в гладких мышцах KRP является мажорным фосфобелком, содержащим несколько фосфо рилированных остатков [1, 130]. В уникальной N концевой после довательности h КЛЦМ также обнаружены участки фосфорилиро вания различными протеинкиназами [23, 3] .

Согласно изложенной выше гипотезе о структурно функцио нальной взаимосвязи белковых продуктов генетического локуса КЛЦМ, можно предположить, что распределение фосфорилируемых остатков в этих белках соответствует необходимости регуляции основной функции каждого из них. Так, фосфорилирование KRP может быть в основном связано с модуляцией его белковых взаимо действий, например, с миозином, фосфорилирование l КЛЦМ – с регуляцией ферментативной активности, а фосфорилирование h КЛЦМ – с изменением взаимодействия с различными компонен тами цитоскелета .

Действительно, многочисленные данные показывают, что фос форилирование l КЛЦМ протекает, в основном, по остаткам, клас теризованным в двух последовательностях, а именно, в уникальном для КЛЦМ CaM связывающем участке и примыкающей к нему с С конца N концевой области KRP домена (рис. 4, см. цветную 402 А.Ю.Хапчаев и др .

вкладку, стр. 388). Уже первые эксперименты позволили установить Ser815 и Ser828 как участки фосфорилирования сАМР зависимой протеинкиназой (РКА) [98], которые были названы сайтами А и В, соответственно [200]. Дальнейшие исследования не только подтвер дили фосфорилирование Ser815 и Ser828 in vitro и in vivo, но и показали, что расположенные в непосредственной близости остатки также могут быть субстратами других протеинкиназ. Таким образом, в настоящее время правильнее говорить о сайтах А и В как о коротких последова тельностях, несущих основные участки фосфорилирования l КЛЦМ и h КЛЦМ, тогда как KRP содержит только сайт В. Пока трудно судить насколько фосфорилируемые остатки кластеризованы в уни кальной области h КЛЦМ ввиду недостаточности эксперименталь ных данных по этому белку .

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ l КЛЦМ

Фосфорилирование l КЛЦМ по сайтам А и В было впервые иссле довано in vitro с использованием каталитической субъединицы РКА [8]. Было обнаружено, что в отсутствие Са2+/CaM фосфорилируются как Ser815, так и Ser828, однако, только сайт В фосфорилируется в присутствии Са2+/CaM, связывание которого блокирует сайт А [7, 8] .

Как можно было ожидать, фосфорилирование сайта А снижало сродство l КЛЦМ к Са2+/CaM в 3,5 раза [34], а дефосфорилирование обращало этот эффект [159]. В то же время, избирательное фосфо рилирование только Ser828 не влияло на активацию l КЛЦМ Са2+/CaM [34], однако, еще более усиливало эффект фосфорилирования сайта А на связывание Са2+/CaM [151]. Наконец, было показано, что сGMP зависимая протеинкиназа (PKG) также может фосфорили ровать сайт А [150] .

Результаты, полученные in vitro, легли в основу гипотезы о меха низме расслабления гладких мышц при внеклеточной стимуляции сАМР и сGMP мобилизующих систем клетки. Известно, что рецеп тор зависимая и независимая активация аденилатциклазы (изопро теренол, карбахол, форсколин) или гуанилатциклазы (за счет оксида азота) приводят к быстрому и эффективному расслаблению гладких мышц (см. обзоры [86, 176]). Поскольку молекулярный механизм не был подробно описан, то обнаруженное в ткани форсколин зави симое увеличение фосфорилирования сайта А l КЛЦМ позволило предположить прямое участие РКА в фосфорилировании и ингиби ровании l КЛЦМ с последующим дефосфорилированием РЛЦ миозина за счет Са2+ независимой фосфатазы, и расслаблением [43] .

Таким образом, фосфорилирование сайта А, но не общего для l КЛЦМ и KRP сайта В, является регуляторным по отношению к Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 403 ферментативной активности l КЛЦМ. Скорее всего, фосфорилиро вание сайта В связано с регуляцией других функций, главных для KRP, но может сохраняться, а может оказаться рудиментарным для l КЛЦМ. При этом интересно отметить крайнюю гомологию сайтов А (…GRLSS815…) и В (…GRKSS828…) в белке млекопитающих, что распространяется и на их способность к фосфорилированию. Если РКА фосфорилирует l КЛЦМ по Ser815 и Ser828, то протеинкиназа РАК, активируемая низкомолекулярным G белком р21, фосфори лирует Ser814 и Ser827 [66, 2]. Однако, только фосфорилирование внутри сайта А приводит к инактивации l КЛЦМ .

Хотя в настоящее время механизм ингибирования l КЛЦМ путем фосфорилирования сайта А не вызывает сомнений, последующие эксперименты выявили достаточно сложный характер этой регуля ции. Оказалось, что сайт А является мишенью нескольких протеин киназ, контролируемых различными внутриклеточными сигнальными каскадами. Помимо РКА и PKG, сайт А может быть фосфорилирован протеинкиназой С [151], Са2+/СаМ зависимой протеинкиназой II типа (СаМК II) [73, 98] и РАК [66]. По видимому, фосфорилиро вание КЛЦМ в ответ на активацию определенного сигнального каскада зависит от природы клетки, организации и взаимодействия протеинкиназных каскадов, а также от доступности КЛЦМ в кон тексте данной клетки. Кроме того, выполнение клеткой специфи ческих функций, таких как миграция или прохождение клеточного цикла, также может определять способ и степень фосфорилирования КЛЦМ. Так, РАК фосфорилирует сайт А l КЛЦМ при миграции кле ток, тогда как в гладкой мускулатуре за это фосфорилирование ответ ственна, главным образом, СаМК II ([199, 200, 209], см. также [2]) .

Вместе с тем, каждая из протеинкиназ фосфорилирует более одного остатка в l КЛЦМ in vivo и in vitro (рис. 4). Было показано, что доступность фосфорилируемых остатков и эффект их фосфори лирования могут различаться для l КЛЦМ из разных источников, а также зависеть от изоформы фосфорилирующего фермента. Так, отмеченная выше способность PKA фосфорилировать сайты А и В в отсутствие Са2+/CaM и только сайт В, когда Са2+/CaM связан, харак терна для l КЛЦМ птиц [34]. Однако, РКА фосфорилирует те же остатки в l КЛЦМ миометрия овцы независимо от присутствия Са2+/CaM, но также ингибирует последующее связывание Са2+/CaM [160]. РКС из мозга кролика фосфорилирует l КЛЦМ птиц по регу ляторному сайту А и Са2+/CaM независимо по остатку, отличному от сайта В [151]. Однако РКC из тромбоцитов человека также фосфори лирует два остатка в l КЛЦМ из той же ткани, расположенные вне сайтов А и В [95]. Фосфорилирование обоих ингибируется Са2+/CaM 404 А.Ю.Хапчаев и др .

и примерно в 10 раз снижает сродство к Са2+/CaM. Аналогично, в l КЛЦМ миометрия овцы РКС фосфорилирует два участка, отличные от сайтов А и В, но не влияет на активность КЛЦМ [160]. Возможно, РАК1 и РАК2 также фосфорилируют разные остатки, но общий из них расположен в сайте А [66, 180]. Наконец, CaMK II фосфорилирует два [98] или три [73] остатка КЛЦМ, только один из которых распо ложен в сайте А .

Если фосфорилирование сайта А является основным путем инги бирования КЛЦМ, то дополнительное фосфорилирование других остатков может, в свою очередь, влиять на доступность сайта А и/или модулировать эффект его фосфорилирования. Было отмечено, что фосфорилирование сайта В само по себе не влияет на взаимодействие l КЛЦМ с Са2+/CaM, но усиливает ингибирующий эффект при фос форилировании сайта А [151]. Аналогично, если фосфорилирование внутри или поблизости от сайта В не изменяет связывания KRP с миозином (см. ниже), то в контексте КЛЦМ оно может усиливать это взаимодействие [179] .

Скорее всего, тонкая регуляция активности КЛЦМ достигается мозаичным фосфорилированием разных остатков КЛЦМ, но глав ным является фосфорилирование сайта А. Об этом также свидетель ствует факт внутримолекулярного автофосфорилирования КЛЦМ, протекающего по нескольким остаткам [56], но преимущественно внутри или рядом с сайтом А. Так, если автофосфорилирование по Ser815 [194, 212] очевидно связано с ингибированием l КЛЦМ, то аналогичная модификация Thr803 приводит к повышению CaM не зависимой активности фермента [212]. Описано автофосфорилиро вание по остаткам Ser823 [212], а также Thr863 или Thr865 [194] и остатку Thr вблизи N концевого актин связывающего участка [6], без существенных функциональных последствий. Возможно, что авто фосфорилирование этих остатков имеет эффект только когда оно дополняет фосфорилирование внутри сайта А. Само по себе, авто фосфорилирование вероятно играет незначительную роль в регуля ции активности l КЛЦМ, поскольку требует очень высокой концент рации Mg2+ и протекает со скоростью более чем на два порядка ниже, чем фосфорилирование миозина – основного субстрата l КЛЦМ .

В последнее время появились интересные данные о возможной активации l КЛЦМ после ее фосфорилирования пролин направлен ными протеинкиназами. Так, конститутивная активация каскада р42/44erk1,2 МАР киназ повышала уровень фосфорилирования l КЛЦМ и миграционную активность трансформированных клеток [119], а ингибирование этого каскада тормозило подвижность различных клеток [119, 140, 148]. Механизм такой активации l КЛЦМ до сих Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 405 пор неясен. По одним данным, он связан с повышением чувствитель ности l КЛЦМ к Са2+/CaM [119], по другим – с увеличением самой каталитической активности без изменения сродства к Са2+/CaM [146] .

Также неясной остается область l КЛЦМ и конкретный остаток, фосфорилирование которых способно активировать фермент .

Вполне вероятно, что как и в случае ингибиторного сайта А, l КЛЦМ содержит последовательность, предназначенную для регу ляторной активации, и включающую кластер или всего лишь один принципиальный участок фосфорилирования. Установлено, что МАР киназой преимущественно фосфорилируется Ser834 l КЛЦМ [1, 130], расположенный к С концу от сайта В (см. рис. 4). Более того, как показано с использованием KRP в качестве модельного субст рата, другие протеинкиназы могут фосфорилировать и соседние остатки [1, 130]. Выяснение возможности активации l КЛЦМ путем избирательного фосфорилирования С концевых остатков от сайта В является предметом ближайших исследований .

Как отмечено выше, фосфорилирование внутри KRP домена может быть связано с регуляцией свойств, специфичных для KRP, но не с активацией l КЛЦМ. Действительно, есть данные об актива ции l КЛЦМ фосфорилированием Thr283 и, возможно, N концевых остатков Thr40/Thr43 пролин направленными p34cdc2 и MAP киназами [146]. Интересно, что вблизи первого из них расположен Thr259, фос форилируемый РАК2 в клетках эндотелия [66] .

Thr283 фосфорилируется под действием p34cdc2, которая активи руется при митозе. Это позволяет предположить роль фосфорили рования Thr283 в регуляции l КЛЦМ в процессе клеточного деления .

Действительно, в клетках, остановленных нокодазолом в телофазе митоза, наблюдается повышенный уровень фосфорилирования l КЛЦМ по остатку Thr, расположение которого соответствует Thr283, но точно не установлено [89]. Интересно, что подобные митоз зави симые изменения фосфорилирования были показаны и для других белков, ассоциированных с актомиозином, например, кальдесмона [236] и фосфатазы РЛЦ миозина [213]. Недавние исследования пока зали, что фосфорилирование некоторых белков р34cdc2 и другими пролин направленными киназами перед митозом необходимо для создания условий их специфического связывания с WW доменом IV типа ядерной пептидил пролил cis/trans изомеразы PIN1 [137]. При разрушении ядерной мембраны в процессе митоза PIN1 переходит в цитоплазму, связывается с такими белками и изменяет их активность на время деления клетки [137]. Можно предположить, что подобная регуляция активности белков, участвующих в регуляции актинового цитоскелета и актомиозина, необходима для осуществления глобаль 406 А.Ю.Хапчаев и др .

ной, но быстрой по времени разборки и ориентированной сборки цитоскелета с последующей активацией актомиозина, необходимой для цитотомии. Проверка этой гипотезы также является предметом ближайших исследований .

В отличие от р34cdc2, МАР киназа преимущественно фосфори лирует l КЛЦМ по остаткам Ser834 и, в меньшей степени, Thr40/Thr43 [146]. При этом Thr40/Thr43 локализованы в актин связывающем домене l КЛЦМ и, возможно, в непосредственной близости от участка связывания с кортактином [44]. Вопрос о том, влияет ли фосфорили рование МАР киназой на связывание l КЛЦМ с филаментами актина и/или кортактином и регулирует ли оно внутриклеточную локализа цию l КЛЦМ остается важным, но совершенно неисследованным .

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ h КЛЦМ

h КЛЦМ полностью включает последовательность l КЛЦМ и все ее участки фосфорилирования, включая сайты А и В (рис. 4). Однако уникальная N концевая часть h КЛЦМ содержит также и другие фосфорилируемые остатки. РКА фосфорилирует in vitro несколько сериновых остатков уникальной области, что нарушает взаимодей ствие h КЛЦМ с основными компонентами цитоскелета3. Наиболее вероятно, что фосфорилированию подвергаются Ser127 и Ser140. Эти результаты являются первыми данными о том, что предполагаемая функция h КЛЦМ по обеспечению интеграции цитоскелета может находиться под внутриклеточным регуляторным контролем. Более того, взаимная близость фосфорилируемых остатков также позволяет предположить наличие короткой последовательности, специально предназначенной для такой регуляции h КЛЦМ, аналогично ранее описанным сайтам А и В в l КЛЦМ .

Как отмечено выше, в клетках эндотелия человека h КЛЦМ экспрессируется в виде двух основных изоформ, КЛЦМ1 и КЛЦМ2, благодаря альтернативному сплайсингу экзона 9, кодирующего 69 аминокислотных остатков [133]. Фосфорилирование большей изо формы КЛЦМ1 киназой р60Src по остаткам Tyr464 и Tyr471 происходит внутри этой вставки и приводит к 2–3 кратному повышению энзима тической активности фермента in vitro [23]. Хотя механизм такой активации остается неясным, отмечено, что тирозиновое фосфори лирование h КЛЦМ может иметь функциональное значение и играть роль в регуляции барьерной функции эндотелия [64]. Кроме того, фосфорилирование внутри кластера Tyr464 Tyr471 может стимулиро вать взаимодействие h КЛЦМ с другими внутриклеточными белками, например, с кортактином [44]. Таким образом, в ближайшее время можно ожидать появления новых интересных данных о фосфорили Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 407 ровании уникального фрагмента h КЛЦМ и его роли в регуляции функций, специфических для h КЛЦМ .

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ KRP

Сравнительный анализ спектра белкового фосфорилирования показывает, что KRP является мажорным фосфобелком в гомоге натах гладких мышц, метаболически меченных [32P] ортофосфатом [1, 130]. При этом практически весь связанный фосфат ассоциирован как минимум с тремя остатками, расположенными в короткой N кон цевой последовательности белка Lys11 Ser 19 [130] (рис. 4). В эту область входят Ser13 и Ser19, соответствующие Ser828 (сайту В) и Ser834 l КЛЦМ, и фосфорилируемые РКА/PKG и МАР киназой, соответ ственно [130, 139]. Невозможность разделения этих остатков из за их взаимной близости не позволяет точно определить другие участки фосфорилирования, однако, эксперименты in vitro показывают, что ими могут быть Ser15/Ser16 [130] и/или Ser12 (рис. 4), который есть только в KRP млекопитающих и является субстратом РАК12 .

Фосфорилирование KRP возрастает при стимуляции гладких мышц, но, скорее всего, не связано с сокращением [130]. Напротив, KRP участвует в расслаблении и, по мнению Сомлио и соавторов, фосфорилирование по Ser13 усиливает его действие [231]. Экспери менты с мутированным по Ser13 KRP лишь отчасти подтвердили такую возможность [223], но прямое фосфорилирование KRP не изменяло его релаксирующего действия на сокращенные скиниро ванные волокна [139]. Более того, в экспериментах с интактной тканью выяснилось, что степень фосфорилирования KRP сущест венно возрастает только при развитии сокращения, но мало изменя ется в ходе дальнейшего расслабления [130], как этого требует гипо теза Сомлио. Последующий анализ степени фосфорилирования отдельных остатков KRP с помощью фосфо и сайт специфических антител подтвердил, что фосфорилирование Ser13 возрастает с 20 до 100% при стимуляции сокращения мышцы, тогда как фосфорили рование Ser19, составляющее в покое 25%, изменяется слабо в про цессе сокращения расслабления (Krymsky M.A., Khapchaev A.Yu., Sidorova M.A., Bespalova Zh.D., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V., руко пись в подготовке). Таким образом, физиологический смысл фосфо рилирования KRP остается неясным и является предметом дальней ших исследований .

Тем не менее, KRP подвергается массированному фосфорили рованию по нескольким остаткам in vivo и in vitro. Поскольку основ ной известной в настоящее время функцией KRP является взаимо действие с миозином, можно предположить, что именно оно регули 408 А.Ю.Хапчаев и др .

руется фосфорилированием. Однако эксперименты in vitro достаточно убедительно показывают, что ни фосфорилирование Ser13, ни Ser13 вместе с Ser19 не изменяют взаимодействия KRP c миозином [125, 222]. Такие результаты согласуются с расположением основной миозин связывающей последовательности в С конце KRP [187] и позволяют предположить наличие у KRP других функций, регуляция которых осуществляется фосфорилированием N концевой области KRP. Аналогичный вывод был сделан в результате физиологических экспериментов, где именно N концевая область была необходима для релаксирующей активности KRP в модели скинированных глад комышечных волокон [223, 231]. В настоящее время ведутся актив ные поиски мишени KRP, отличной от миозина. В этой связи, боль шое значение приобретают последние данные о том, что фосфорили рование остатков Ser13 или Ser19 ослабляет взаимодействие KRP с неидентифицированными пока клеточными структурами2. В цито плазме трансфицированных гладкомышечных клеток KRP дикого типа распределяется диффузно, тогда как фосфорилированный KRP, а также мутанты, имитирующие фосфорилирование, локализованы в примембранной области клетки [125]. Эти результаты могут отра жать возможную сигнальную функцию KRP в клетке, не связанную со взаимодействием с миозином. Можно предположить, что фосфо рилирование KRP приводит к его связыванию с фосфоспецифич ными модульными доменами (например, WW доменами). Такое взаимодействие может играть роль в направленном транспорте KRP в определенные клеточные компартменты, где KRP способствует сборке миофиламентов или ингибирует l КЛЦМ, способствуя инак тивации миозина .

VIII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время становится очевидно, что белковые продукты генетического локуса КЛЦМ играют важнейшую роль в жизнедея тельности клеток, обеспечивая выполнение двигательных функций, таких как мышечное сокращение и различные формы клеточной подвижности. Вместе с тем, несмотря на более чем 25 летние иссле дования со времени открытия их первого представителя – l КЛЦМ, остается много невыясненных вопросов как относительно организа ции локуса КЛЦМ в геноме и регуляции экспрессии его продуктов, так и их структурно функциональных взаимосвязей, способов конт роля их активности и их участия в других внутриклеточных процессах .

Роль l КЛЦМ наиболее существенна при активации миозина, сокращении гладких мышц и двигательной активности немышечных клеток. Нарушение этих процессов, вероятно, должно иметь катаст Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 409 рофические последствия в контексте организма. Скорее всего, мыши с конститутивным селективным нокаутом l КЛЦМ (если их в прин ципе возможно создать) будут погибать на ранних стадиях эмбрио генеза. В то же время, ряд функций КЛЦМ можно исследовать в моделях культивируемых клеток, где избирательный нокаут l КЛЦМ не является летальным, но блокирует их миграционную [118] и сок ратительную [19] активность. Создание и использование высокосе лективных ингибиторов является другим подходом к изучению функ ций КЛЦМ. В частности, такие работы позволили выявить вероятное участие КЛЦМ в интегрин зависимом формировании цитоскелета [30, 50]. Однако в этом случае сложно дискриминировать индиви дуальный вклад изоформ КЛЦМ .

Можно предполагать, что для обеспечения быстрой моторной реакции клеток различной природы функционирование l КЛЦМ является принципиальным. Однако для более медленных процессов участие КЛЦМ не всегда обязательно. Полученные в последние годы данные показывают, что и другие киназы могут фосфорилировать и активировать миозин в клетках. Такое фосфорилирование является, главным образом, рецептор или интегрин зависимым и не зависит от изменения [Са2+]i (см. обзор [2]). При этом дальнейшая регуляция степени фосфорилирования РЛЦ миозина осуществляется путем модуляции активности миозин специфичной фосфатазы [196, 197] .

Аналогичные рецептор зависимые механизмы реализуются и в гладкой мускулатуре, что обуславливает более длительные сократительные реакции по сравнению с Са2+/СаМ зависимой активацией l КЛЦМ .

Важное значение имеет тонкая регуляция внутриклеточной актив ности l КЛЦМ путем фосфорилирования. Если в гладкой муску латуре в условиях массированной Са2+ зависимой активации фер мента фосфорилирование l КЛЦМ выполняет лишь модулирующую роль, то в других типах клеток, регулируемых, главным образом, путем активации поверхностных рецепторов и множественных внутрикле точных сигнальных систем, значение этого пути может возрастать. В таких случаях фосфорилирование, например, МАР киназами, может активировать l КЛЦМ и стимулировать локомоцию [119, 140, 148], вносить вклад в формирование адгезивных контактов [50] или способствовать изменению внутриклеточной локализации КЛЦМ .

Напротив, фосфорилирование под действием РКА/PKG и РАК при активации рецепторов, сопряженных с определенными G белками, будет приводить к ингибированию l КЛЦМ и клеточной подвижности .

Наконец, фосфорилирование КЛЦМ под действием p34cdc2 киназы в процессе митоза [89] может иметь значение для правильного прохож дения клеточного цикла .

410 А.Ю.Хапчаев и др .

Роль h КЛЦМ в клетках продолжает оставаться недостаточно раскрытой. С одной стороны, эта изоформа обладает всеми свойст вами l КЛЦМ в плане фосфорилирования миозина и, следовательно, стимуляции его филаментообразующей и моторной функций [23, 131]. С другой стороны, во многих клетках, например, в пассиро ванных гладкомышечных клетках [4, 131] присутствуют обе изоформы КЛЦМ, и создается впечатление, что в таких клетках l КЛЦМ играет роль основного регулятора АТФазы миозина. Так, ингибирование ее экспрессии с помощью антисенс олионуклеотидов или аденовирус ной трансдукции антисенс КЛЦМ конструкций подавляет сократи тельный ответ клеток, несмотря на то, что при таких воздействиях экспрессия h КЛЦМ нарушается в меньшей степени [19, 118]. Пос ледующее ингибирование h КЛЦМ путем увеличения степени инфи цирования клеток антисенс КЛЦМ не приводило к дальнейшему падению сократимости клеток и, что не менее интересно, не изме няло степени фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина под действием агонистов и Ca2+ ионофора A23187 [19]. Эти и другие подобные данные по различной активности изоформ КЛЦМ могут быть объяснены на основе их структурных различий. Анализируя результаты дифференциальной экстракции изоформ КЛЦМ из клеток и тканей, а также опытов in vitro, можно утверждать, что уни кальная N концевая последовательность h КЛЦМ опосредует ее более прочное взаимодействие с компонентами цитоскелета [131, 172, 189]. l КЛЦМ значительно слабее заякорена на цитоскелетных структурах и, вероятно, имеет большую свободу к перемещению в цитоплазме. Поэтому эффективный ареал l КЛЦМ для фосфорили рования молекул мономерного миозина в цитоплазме будет больше, чем у h КЛЦМ, которая значительно менее подвижна и способна фосфорилировать миозин только непосредственно вокруг себя .

Дополнительная регуляция h КЛЦМ за счет фосфорилирования ее N концевой части также может влиять как на ассоциацию с цитоске летом, так и на ее ферментативную активность. В результате, при сравнимой экспрессии обеих изоформ КЛЦМ в клетках их актив ность, измеренная по конечному параметру (сократительному ответу клеток или общему фосфорилированию РЛЦ миозина) будет казаться различной .

Возможно, функциональное назначение уникальной последова тельности h КЛЦМ состоит именно в том, чтобы локализовать фер мент в местах цитоплазмы, где необходимо осуществление опреде ленных и строго ограниченных двигательных актов. Например, в клетках эндотелиального или эпителиального пласта h КЛЦМ может находиться в субкортикальном актине и регулировать локальную Структура, свойства и регуляция белковых продуктов… 411 плотность межклеточных контактов и, следовательно, барьерную функцию клеточного слоя. Возможно, в норме этим клеткам не требу ется осуществлять полное сокращение тела и поэтому они не экспрессируют l КЛЦМ [219, 220]. Противоположная ситуация характерна для клеток с активной локомоцией, таких как эмбрио нальные фибробласты. Они преимущественно экспрессируют l КЛЦМ, однако при длительном пассировании и снижении мигра ционной активности ее уровень падает и повышается относительное содержание h КЛЦМ [25, 57, 79] .

Экспериментально доказано, что удаление h КЛЦМ из организма животного методом генетического нокаута не приводит к катастро фическим последствиям. Мыши с отсутствующей h КЛЦМ, но с сохраненной экспрессией l КЛЦМ и KRP практически не отлича ются от мышей дикого типа и, даже наоборот, становятся менее под вержены действию токсических агентов, введенных в кровоток (D.M.Watterson, персональное сообщение). Эти данные хорошо соответствуют предполагаемой важной роли h КЛЦМ в барьерной функции эндотелия, однако, возможны и другие объяснения. Нали чие h КЛЦМ–/– животных дает возможность создать клеточные модели, не содержащие h КЛЦМ, что позволит ответить на многие вопросы о функциях изоформ КЛЦМ in vivo, которые подняты в данном обзоре .

Несмотря на малые размеры и известные физико химические и биохимические свойства KRP, функциональная значимость этого белка в клетке продолжает оставаться предметом дискуссий. В целом, не возникает сомнений, что он вовлечен в регуляцию структурно функциональных свойств миозина и расслабление гладкой муску латуры [221, 231]. Однако остается необходимой детализация меха низма действия KRP. Дифференциальная экспрессия KRP в фазной (висцеральной) и тонической (сосудистой) мускулатуре позволяет предположить его прямое участие в поддержании определенного уровня фосфорилирования РЛЦ миозина в покоящейся мышце. Для тканей с повышенной экспрессией KRP характерен низкий уровень фосфорилирования миозина и их глубокая релаксация, тогда как крайне низкое содержание KRP в тонической мускулатуре может, в частности, определять наличие остаточного сократительного компо нента (тонуса). Учитывая такую зависимость, нельзя исключить, что с помощью искусственной модуляции уровня экспрессии KRP в сосудах станет возможным регулировать локальный сосудистый тонус (например, коронарных и церебральных артерий) и/или системное давление (при гипертензии). Однако прежде необходимо разрешить вопрос о причинно следственной связи между уровнем экспрессии KRP и степенью тонуса сосудов. Решение этой задачи с использованием 412 А.Ю.Хапчаев и др .

трансгенных животных, дефицитных по гену KRP, вряд ли возможно, поэтому потребуется разработка животных моделей с избирательной гиперэкспрессией этого белка в сосудистой ткани. Одним из созда ваемых в нашей лаборатории подходов является локальная аденови русная трансдукция кДНК KRP в сосуды животных и изучение ее функциональных последствий .

Крайне важным с точки зрения дальнейших исследований явля ется вопрос о физиологической значимости экспрессии KRP в мио карде и его потенциальной роли в кардиомиогенезе [45]. Установле ние функций KRP в этой ткани может стать важным для понимания механизмов дифференцировки, гипертрофии и регенерации миокарда .

Наконец, в связи с обнаружением четвертого класса мРНК, гиб ридизующегося с зондами к КЛЦМ/KRP в некоторых тканях чело века [226], остается открытым вопрос о существовании новых про дуктов генетического локуса КЛЦМ. Наличие множественных вариантов сплайсинга всех известных мРНК локуса КЛЦМ позволяет допустить, что неизвестный продукт будет обладать комбинацией свойств известных белков, и тогда его функциональные свойства можно будет предсказать на основе первичной структуры. В то же время, нельзя исключить, что новый белок может считываться в альтер нативной рамке и, соответственно, иметь функции совершенно отлич ные от таковых для КЛЦМ и KRP .

Каковы бы ни были варианты развития событий, несомненно, что прогресс в изучении функциональной геномики локуса КЛЦМ у позвоночных и человека будет способствовать более глубокому пониманию фундаментальных основ эукариотической подвижности и разработке методов лечения широкого спектра заболеваний, при которых нарушается сократительная или двигательная активность клеток .

–  –  –






Похожие работы:

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА V. Y. Levanidov's Biennial Memorial Meetings Вып. 1 ФАУНА ХИРОНОМИД ПОДСЕМЕЙСТВА ORTHOCLADIINAE (DIPTERA, CHIRONOMIDAE) ОСТРОВА ВРАНГЕЛЯ Е.А. М...»

«Приложение 4 Минимальные баллы. Порядок проведения вступительных испытаний творческой и(или) профессиональной направленности 4.1. Минимальное количество баллов для проводимых организацией самостоятельно общеобразовательных вступительных испытаний и ЕГЭ, дополнительных вступительных испытаний творческой и/или професс...»

«https://otvet.com.ru/kak-zimuet-lisa.html Как зимует лиса? Как зимует лиса? загрузка. Лиса в отличии от медведя зимой не спит, а бодрствует, охотится и готовится к рождению потомства. Зимой лиса питается в основном мышами, зайцами, реже птицами. Лиса это очень чуткий зверь, зимой она присматривает место д...»

«Руководство Общее руководство осуществляет организационный комитет (Оргкомитет). Оргкомитет проводит работу по подготовке и проведению конференции и конкурсов, формирует состав жю...»

«ГРЦ # 4 2015 Аннотации Бернард Лайтман. "Тезис о конфликте" и научный натурализм Зоолог Томас Гексли, физик Джон Тиндаль и философ-эволюционист Герберт Спенсер были центральными фигурами в истории отношений науки и религии в Британии XIX в. До 1970-х гг., когда "тезис о конфли...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 2. – С. 196-214. УДК 01+092.2 АНДРЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ БАКИЕВ (К 50-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ И 25-ЛЕТИЮ НАУЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ) © 2010 Г.С. Розенберг; А.Л. Маленев, О.Л. Носкова, С.В. Саксон...»

«ЛОГВИНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата...»

«Государственное учреждение социального обслуживания населения Тульской области "Социально-реабилитационный центр для несовершеннолетних Дубенского района". Выпуск № 9 сентябрь – октябрь 2013г.В НОМЕРЕ: Первый раз в первый класс! – стр. 1 1000 и 1 дерево – стр. 2 Уборка клумб – стр. 3 От сердца к сердцу – стр. 4 Временный пе...»

«СРГ ПДООС ПОВЕСТКА ДНЯ УЧЕБНОГО СЕМИНАРА "ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЕКТОВ, ФИНАНСИРУЕМЫХ ЗА СЧЕТ ГОСУДАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ" УЧЕБНЫЙ СЕМИНАР ДЛЯ ЭКСПЕРТОВ МОЛДОВЫ 16 – 19 ЯНВАРЯ 2007 Г., КИШИНЕВ Исходная инфо...»

«Лекция №14. Популяционная динамика Лекцию читает Петр Валентинович Турчин – один из сильнейших специалистов в мире по популяционной динамике, преподаватель Коннектикутского университета. Данная лекция состоит из 3 лекций курса общей экологии, преподава...»

«Качков Ю.П., Панасюк, О.Ю. Опыт природно-сельскохозяйственного районирования Белорусского Полесья // Современные экологические проблемы устойчивого развития Полесского региона и сопредельных территорий:...»

«UNEP/CMS/Saiga/MOS3/Inf.4.3 ОБРАЗЕЦ ПРОЕКТНОГО ОТЧЕТА ДЛЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЕЙ СВЯЗАННЫХ С САЙГАКАМИ Этот проектный образец предназначен для объединения данных по проектам проведенных межправительственными, международными государственными и негосударственными организациями, а также академиками и другими экспертами работающих по любым аспектам сохранения и у...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.