WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

Pages:   || 2 |

«Логвинова Дарья Сергеевна Роль существенных лёгких цепей миозина в процессе работы миозиновой головки ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР

«ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК»

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. БАХА

На правах рукописи

Логвинова Дарья Сергеевна

Роль "существенных" лёгких цепей миозина в процессе

работы миозиновой головки

03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Левицкий Москва – 2018 Оглавление Список сокращений 5 Введение 6

1. Обзор литературы 11

1.1. Общие сведения о структуре и свойствах миозина 11 Мышечный миозин: история открытия и строение молекулы 11 Разнообразие миозинов. Немышечные миозины II класса 13 Атомная структура головки миозина 14 AТРазная активность миозина 16 Взаимодействие миозина с актином. Механизм мышечного сокращения 17 Легкие цепи миозина. Регуляторные легкие цепи 18 1.2. «Существенные» легкие цепи миозина (ELC) 21 Синтез, особенности первичной структуры, распространение и номенклатура изоформ ELC 21 Сердечные изоформы «существенных» легких цепей миозина 23 Влияние ELC на свойства миозина и его изолированных головок; сравнение свойств препаратов S1, содержащих разные изоформы ELC – А1 и А2 27 N-концевой сегмент «существенной» легкой цепи А1 миозина и его взаимодействие с актином 28 Взаимодействие N-концевого сегмента «существенной» легкой цепи А1 миозина с моторным доменом миозиновой головки 34 Возможные функции «существенных» легких цепей миозина в мышцах 38 Роль ELC миозина во взаимодействиях между моторным и регуляторным доменами миозиновой головки в процессе АТРазного цикла 41



1.3. Применение метода Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) для структурно-функциональных исследований головки миозина 48

2. Материалы и методы 54

2.1 Получение препаратов белков 54 Получение рекомбинантных «существенн

–  –  –

3. Результаты и их обсуждение 66

3.1. Роль C-конецевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом миозиновой головки, во взаимодействии между моторным и регуляторным доменами головки в процессе АТРазного цикла 66 Тепловая денатурация S1 в составе тройных комплексов S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx 66 Сравнение свойств рекомбинантных ELC дикого типа со свойствами ELC, выделенных из миозина скелетных мышц кролика 70 Температурные изменения флуоресценции меченых рекомбинантных ELC, связанных с регуляторным доменом S1 в отсутствие нуклеотидов 71 Температурные зависимости флуоресценции и светорассеяния S1 в присутствии малого белка теплового шока HspB5 74 Температурные зависимости флуоресценции меченых ELC, связанных с регуляторным доменом S1, в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- 75 Тепловая диссоциация ELC от тяжелой цепи S1 79 Измерение дистанций между С-концевой частью ELC и активным центром S1 с помощью метода FRET 84

–  –  –

Введение Актуальность темы. Циклическое взаимодействие головок молекул миозина с актиновыми филаментами, сопровождаемое гидролизом АТР в головках, лежит в основе молекулярного механизма множества самых разных проявлений биологической подвижности – от процессов внутриклеточного транспорта до мышечного сокращения [1] .



К настоящему времени уже установлено, что при осуществлении двигательных процессов в актомиозиновых системах главные функции выполняют глобулярные головки молекул миозина, играющие роль “молекулярных моторов”. При связывании и гидролизе АТР миозиновые головки подвергаются значительным структурным перестройкам, которые определяют характер присоединения головок к актину и вызывают направленное перемещение актиновых филаментов. Выяснение характера таких конформационных перестроек, происходящих в миозиновой головке при связывании и гидролизе ATP, является ключевой задачей, решение которой необходимо для понимания молекулярного механизма механохимической трансформации энергии в актомиозиновой двигательной системе. Изолированная миозиновая головка (субфрагмент 1 миозина, S1) состоит из двух главных доменов – моторного и регуляторного, а ее работа в качестве «молекулярного мотора» обеспечивается поворотом регуляторного домена относительно моторного домена в процессе АТРазной реакции. Согласно предсказаниям, такой поворот может сопровождаться взаимодействием между моторным доменом и С-концевой частью «существенной» легкой цепи (ELC), ассоциированной с регуляторным доменом. Такие взаимодействия между двумя главными доменами миозиновой головки – моторным и регуляторным, происходящие в процессе АТРазной реакции, представляют несомненный интерес, поскольку они могли бы индуцировать значительные внутримолекулярные перемещения в головке и играть важную роль в процессе трансформации энергии гидролиза АТР в механическую работу. Однако, несмотря на то, что возможность такого междоменного взаимодействия была уже предсказана в ряде работ, данное предположение до сих пор не получило убедительного экспериментального подтверждения. Именно получение такого подтверждения и составляло одну из основных задач данного исследования .

Интересно, что существует две изоформы ELC миозина: A1, состоящая из 194 аминокислотных остатков, и более короткая – А2, состоящая из 150 аминокислотных остатков. Изоформы А1 и А2 имеют идентичные С-концевые последовательности, но у А1 в N-концевой области имеется дополнительный сегмент из 44 аминокислотных остатков, который при связывании миозиновой головки с актиновым филаментом может взаимодействовать с актином, формируя таким образом дополнительный актинсвязывающий участок в S1. Следует отметить, однако, что взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином ранее наблюдали, как правило, лишь при очень низких значениях ионной силы, вследствие чего не раз высказывались сомнения в том, что такое взаимодействие может иметь место при физиологических условиях. Таким образом, еще одним направлением наших исследований являлось выяснение возможности иммобилизации N-концевого сегмента А1 на поверхности актинового филамента при актомиозиновом взаимодействии в условиях ионной силы, близких к ее физиологическим значениям .

И, наконец, еще одно направление нашего исследования связано с проверкой предположения о том, что в процессе АТРазной реакции может происходить взаимодействие дополнительного N-концевого сегмента существенной легкой цепи А1, отсутствующего у А2, с моторным доменом миозиновой головки .



Предполагалось, в частности, что на определенных стадиях АТРазного цикла в S1 (например, промежуточных состояниях S1-ATP и S1-ADP-Pi) дополнительный N-концевой сегмент А1 может вовлекаться не только в межмолекулярные взаимодействия с актином, но и во внутримолекулярные взаимодействия с моторным доменом S1 .

С учетом всего вышеизложенного целью настоящей работы стало изучение роли «существенных» легких цепей (ELC) миозина и, в частности, N-концевого сегмента А1, в функционировании головки миозина в качестве молекулярного мотора.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Получить экспериментальные подтверждения высказанной ранее гипотезы о том, что в процессе АTPазной реакции происходит взаимодействие между моторным доменом миозиновой головки и С-концевой частью ELC, связанной с регуляторным доменом головки .

2). Исследовать особенности взаимодействия N-концевого сегмента ELC (А1) с актином при связывании головок миозина с актиновыми филаментами в условиях ионной силы близких к ее физиологическим значениям .

3). Получить экспериментальные подтверждения гипотезы о том, что в процессе АТРазной реакции может происходить взаимодействие уникального дополнительного Nконцевого сегмента легкой цепи А1 с моторным доменом миозиновой головки .

Научная новизна. В представленной работе впервые были получены экспериментальные подтверждения гипотезы о том, что в процессе АТРазного цикла может происходить взаимодействие между двумя основными структурными доменами головки миозина – регуляторным доменом (точнее – ассоциированной с ним ELC) и моторным доменом .

Такое взаимодействие выражается не только в резком повышении термостабильности регуляторного домена S1 при образовании стабильных тройных комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, имитирующих главные интермедиаты АТРазной реакции S1, но и в уменьшении расстояний между моторным доменом S1 и C-концевой частью ELC, ассоциированной с регуляторным доменом. В комплексах S1 с F-актином методом Ферсторовского резонансного переноса энергии (FRET) были впервые определены расстояния между остатками в N-концевом сегменте ELC (А1) и в F-актине; полученные результаты свидетельствуют о том, что взаимодействие N-концевого сегмента ELC (A1) с актином может происходить при физиологических значениях ионной силы и играть важную роль при взаимодействии миозина с актином в процессе мышечного сокращения .

Методом FRET было также показано, что образование стабильных комплексов S1-ADPBeFx и S1-ADP-AlF4 сопровождается резким сближением N-концевого сегмента А1 с моторным доменом S1, что является, на наш взгляд, достаточно убедительным подтверждением гипотезы о том, что в процессе АTPазного цикла происходит взаимодействие N-концевого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки, которое обеспечивает более слаженный в пространстве и во времени процесс функционирования головки миозина в качестве молекулярного мотора .

Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе данные расширяют представления о той роли, которую играют ELC при функционировании головки миозина в качестве молекулярного мотора. На сегодняшний день имеется большое количество работ, посвященных изучению влияния мутаций в ELC сердечного миозина на функционирование сердечной мышцы. Хорошо известно, что многие такие мутации в гене ELC ассоциированы с развитием тяжелых наследственных заболеваний человека – кардиомиопатий. Известно также, что ELC миозина могут фосфорилироваться в сердечных и скелетных мышцах, но роль такого фосфорилирования остается пока совершенно неясной. Мы полагаем, что результаты нашего исследования, в котором мы постарались подробно изучить роль ELC миозина в функционировании головки миозина, а также разработанные новые методы и подходы могут впоследствии оказаться очень полезными для выяснения тех молекулярных механизмов, которые лежат в основе влияния кардиомиопатических мутаций в гене ELC и фосфорилирования ELC на работу сердечной мышцы .

Методы исследования. В работе были использованы методы генной инженерии и молекулярной биологии для получения рекомбинантных препаратов ELC с остатками Cys в различных частях молекулы, а также многочисленные современные физико-химические методы исследования белков для анализа структуры и свойств головок миозина (S1), несущих такие рекомбинантные ELC: флуоресцентная спектроскопия, динамическое светорассеяние, Ферсторовский резонансный перенос энергии и ряд других .

–  –  –

Личный вклад автора заключался в получении всех рекомбинантных препаратов ELC, в планировании и проведении всех научных экспериментов, обработке и интерпретации полученных данных, а также в подготовке материалов научных публикаций .

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1). Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с измерениями температурных зависимостей флуоресценции проведена идентификация тепловых переходов на термограммах ДСК, соответствующих регуляторному домену головки миозина, с которым ассоциирована ELC, в препаратах S1 как в отсутствие нуклеотидов, так и в составе тройных комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 .

Оказалось, что в этих комплексах, имитирующих главные интермедиаты АТРазной реакции S1 – S1-ATP и S1-ADP-Pi, регуляторный домен миозиновой головки денатурирует при значительно более высокой температуре, чем в отсутствие нуклеотидов .

Мы также определили расстояния от активного центра АТРазы в моторном домене S1 до остатков цистеина в С-концевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом S1, и показали, что они резко снижаются при образовании комплекса S1-ADP-BeFx. В совокупности, все полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что в процессе АTPазной реакции происходит достаточно прочное взаимодействие между двумя главными доменами миозиновой головки регуляторным

– (точнее – ассоциированной с ним ELC) и моторным, в результате чего изменяет характер тепловой денатурации регуляторного домена .

2). Сравнительный анализ агрегационных свойств двух изоформ изолированных головок миозина (S1), содержащих разные ELC – А1 и А2, показал, что в условиях низкой ионной силы S1(A1) подвергается интенсивной агрегации, полностью отсутствующей у S1(A2) .

Такая необычная агрегация S1(A1) полностью исчезала при формировании комплексов S1-ADP-AlF4 и S1-ADP-BeFx – стабильных аналогов ключевых интермедиатов АТРазной реакции S1, для которых не наблюдалось никакой разницы в агрегационных свойствах между S1(A1) и S1(A2). Такая агрегация S1(A1) обусловлена межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента А1 с моторными доменами других молекул S1, которые отражают, по-видимому, внутримолекулярное взаимодействие этого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки, происходящее в процессе АТРазного цикла .

Это предположение было подтверждено данными FRET, согласно которым образование комплекса S1-ADP-BeFx резко снижало расстояния от остатков цистеина в N-концевом сегменте A1 до TNP-ADP в активном центре S1. Таким образом, нам удалось получить достаточно убедительные экспериментальные подтверждения гипотезы о том, что в процессе АTPазного цикла происходит взаимодействие N-концевого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки, которое обеспечивает более слаженный и структурированный процесс работы головки миозина как молекулярного мотора .

3). В комплексах S1 c F-актином методом FRET впервые определены расстояния между остатками Cys в N-концевом сегменте ELC (А1) и Cys374 в F-актине. Результаты этих экспериментов, проведенных при разных значениях ионной силы, подтверждают высказанные ранее предположения о том, что взаимодействие N-концевого сегмента A1 с актином может происходить при физиологических значениях ионной силы и играть важную роль при взаимодействии миозина с актином в процессе мышечного сокращения .

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: на VII Российском симпозиуме и пептиды» на международных симпозиумах «Белки (Новосибирск, 2015), «Биологическая подвижность» (Пущино, 2014 и 2016 г.г.), на международной конференции «Ломоносов»-2014 и на 44-й, 45-й и 46-й Европейских мышечных конференциях (Варшава, Польша, 2015; Монпелье, Франция, 2016; Потсдам, Германия, 2017), а также на 42-м конгрессе FEBS (Иерусалим, Израиль, 2017) .

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи в российских и международных рецензируемых журналах и тезисы 12 докладов на отечественных и международных конференциях .

–  –  –

1.1. Общие сведения о структуре и свойствах миозина Мышечный миозин: история открытия и строение молекулы .

Термин «миозин» был известен еще в XIX веке, впервые термин ввел В. Кюне в 1864 году. Так обозначали белок, экстрагированный из мышцы растворами с высокой ионной силой и выпадающий в осадок при понижении ионной силы [2]. Термин «миозин» (myo- +

-ose + -in) означает «внутри мышцы», корень «myo» был образован от слова «mys», которое в Греции используют для обозначения мышц. В начале 30-х годов 20-го века было показано, что в мышцах животных существует фермент, способный осуществлять гидролиз АТР и что отмытые мышцы способны отщеплять одну фосфатную группу от АТФ [3]. На основании этих фактов был сделан вывод о наличии в мышце фермента, способного осуществлять гидролиз АТР. И только спустя 80 лет после открытия миозина было показано, что именно этот белок осуществляет гидролиз АТP в мышечной ткани .

В 1939 году супруги В.А. Энгельгардт и М.Н. Любимова в Институте биохимии им. А.Н. Баха АН СССР в Москве обнаружили, что актомиозин (тогда еще называвшийся миозином) обладает АТРазной активностью [4]. Позднее они показали, что добавление АТР к искусственным актомиозиновым нитям, полученным при выдувании раствора актомиозина через капилляр в воду, приводит не только к расщеплению АТР под действие АТРазы миозина, но и к изменению длины нитей. Почти одновременно (в 1942 году) А .

Сент-Дьердьи также наблюдал сокращение актомиозиновых нитей, помещенных в раствор АТР; он же позднее показал, что глицеринизированные мышечные волокна сокращаются при добавлении АТР [3]. Основным результатом этих работ являлся вывод о том, что в основе сокращения мышц лежит взаимодействие актомиозина с АТР. Эти открытия положили начало изучению молекулярного механизма мышечного сокращения .

В 1942–1943 годах Ф. Штрауб показал, что миозин представляет собой комплекс двух белков; один из них был назван актином, а за другим сохранилось старое название – миозин. Комплекс актина с миозином получил название актомиозин .

Параллельно с работами по изучению молекулярного механизма мышечного сокращения активно изучались структура и свойства миозина. Аминокислотный состав миозина был определен в 1954 году с помощью хроматографии на Dowex 50 [5]. Исходя из исследований осмотического давления, скорости седиментации и диффузии, молекулярный вес миозина определили равным 420 кДа [6]. Все эти величины были близки к истинным, но самые точные результаты были получены только в 1969 году, когда было показано, что молекула мышечного миозина представляет собой гетерогексамер, состоящий из двух тяжелых (молекулярная масса ~200 кДа) и четырех легких цепей (молекулярная масса ~20 кДа). N-концевые области тяжелых цепей (myosin heavy chain, MHC) образуют две глобулярные головки, с которыми ассоциированы «существенная» («essential» light chain, ELC) и регуляторная (regulatory light chain, RLC) легкие цепи (по две с каждой головкой) [7]. Каждая головка миозина содержит активный центр АТРазы и участки связывания актина. С-концевые части тяжелых цепей миозина, взаимодействуя друг с другом, образуют длинную и жесткую стержневую часть молекулы (хвост), представляющую собой двойную -спираль. (рис. 1). Эта двойная спираль (coiledcoil) образуется за счет периодических повторов гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков [1] .

Рис. 1. Схематическое представление молекулы мышечного миозина (миозина II класса):

фиолетовыми овалами обозначены две головки миозина, с каждой из которых связаны «существенная» и регуляторная легкие цепи; двойной спиралью показана С-концевая часть миозина или хвост [8] .

В основании головки (в области «шейки», соединяющей ее со стержневой частью миозина) в молекуле миозина II класса, к которому относятся все мышечные миозины, имеются два консервативных IQ мотива (IQxxxRGxxxR); следует отметить, что немышечные миозины других классов могут иметь и другое количество IQ мотивов [9] .

IQ-мотивы представляют собой амфифильную -спираль с сайтами связывания для легких цепей миозина (или кальмодулина). ELC и RLC занимают первый и второй IQ мотивы в области шейки, соответственно. Считается, что длина этой области оказывает непосредственное влияние на эффективность перемещения головки миозина вдоль нити актина. Это линейная зависимость: чем длиннее шейка головки, тем эффективнее она перемещает миозин вдоль актина [10] .

Разнообразие миозинов. Немышечные миозины II класса .

Более 140 различных миозинов встречается у эукариот [11]. Все обнаруженные на данный момент миозины подразделяют на 35 различных классов [12]. Каждый класс миозинов обозначится римской цифрой; если в организме встречается более одного типа миозина одного и того же класса, то они называются в алфавитном порядке, начиная с того, который был открыт первым. Миозины имеют одну (миозины классов I, III, IV, IX, XIII) или две головки (миозины II, V, VI, VII, X, XI), содержащие в области шейки от 1 до 6 участков связывания легких цепей (IQ-мотивов). С-концевые области (хвосты) миозинов у представителей разных классов часто не имеют ничего общего друг с другом. Этот вариабельный участок молекулы определяет, какие специфические функции данный класс миозинов выполняет в клетке. Так, например, хвостовые части могут отвечать за самосборку миозина в филаменты (миозины класса II), за прикрепление к мембранам (класс I), нести дополнительные участки связывания актина и других цитоскелетных белков (классы I, V, IX) [1]. Миозины V класса осуществляют везикулярный транспорт вдоль нитей актина от центра к периферии клетки, а миозины VIII класса участвуют в клеточном делении .

На сегодняшний день известно о более чем 34 миозинах класса II (к которому относятся и все мышечные миозины), выделенных из разных организмов. Считается, что во всех эукариотических клетках синтезируется хотя бы один миозин II. В зависимости от структуры головки и хвоста молекулы миозина, а также от типа клеток, в которых он встречается, все миозины II класса подразделяются на четыре разных подкласса или группы. Это (1) миозины из почвенной амебы Acanthamoeba или миксомицета Dictyostelium, (2) миозины дрожжей, (3) скелетные и сердечные миозины и (4) миозины гладких мышц и немышечных клеток [12]. Известно, что миозины II класса впервые появились у одножгутиковых простейших (Unikonta), которые являются предками эукариот без жгутиков или только с одним жгутиком [13]. Простые одноклеточные организмы, такие как амеба, имеют только один ген миозина II, тогда как сложные многоклеточные организмы приобрели в процессе эволюции множество генов миозина II .

Геном человека содержит более 40 генов миозина, и 15 из них представляют собой гены миозина класса II (MYH1–MYH4, MYH6, MYH7, MYH7B, MYH8–MYH11, MYH13– MYH16), но не все они активны [14]. Например, MYH11 кодирует миозин II в гладких мышцах, но в результате альтернативного сплайсинга могут формироваться четыре различные изоформы миозина. Гены MYH9, MYH10 и MYH14, расположенные на разных хромосомах, кодируют миозин IIA, миозин IIB и миозин IIC, соответственно. Эти изоформы миозина II экспрессируются исключительно в немышечных клетках; они могут синтезироваться в каждой человеческой немышечной клетке всего за несколькими исключениями, однако их присутствие зависит от типа клеток и ткани [15]. По-видимому, ни в одном из типов клеток и тканей не встречаются одновременно все три немышечных миозина II, но во многих типах клеток в нормальных физиологических условиях синтезируются один или два из них. Несмотря на значительное сходство в аминокислотной последовательности, эти изоформы миозина II различаются по сродству к актину. Поэтому считается, что миозины IIA, IIB и IIC выполняют в клетках механическую работу с различной энергетической эффективностью .

Миозин IIA и миозин IIB экспрессируются в эндотелиальных и эпителиальных клетках в одинаковых количествах. С другой стороны, в нервной ткани экспрессируется преимущественно миозин IIB, в легочной ткани – миозин IIC, а миозин IIA является единственным двигательным белком – представителем миозина II класса, встречающимся в циркулирующих тромбоцитах. Таким образом, миозины II, встречающиеся в разных типах клеток, отражают их специализацию и определяют их функцию .

Немышечные миозины II класса активно участвуют в процессе клеточного деления [16]. Также известно, что миозины IIA и IIB участвуют в процессе изменения формы клетки и взаимодействуют с матриксом во время клеточной миграции. С одной стороны, миозин IIB способствует расширению ламеллоподий и формированию конуса роста, а с другой, миозин IIA приводит к ретракции клеточной мембраны во время миграции клеток [17]. Миозины II также участвуют в интернализации рецепторов с поверхности клетки – таких, например, как EGFR (epidermal growth factor receptor) и CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4). Помимо этого, миозины II принимают участие в работе сократительных вакуолей, чтобы вытеснить лишнюю воду и токсичные материалы из почвенной амебы в гипоосмотических условиях [18], хотя амебы могут выживать с определенными дефектами развития и без миозинов II класса. С другой стороны, экспрессия всех трех изоформ миозина II необходима для роста и развития эмбриона мыши [19] .



Объектом нашего исследования является миозин II класса из скелетных мышц (MYH4), поэтому рассмотрим подробнее структуру молекулы такого миозина, в особенности – его головки, ответственной за его моторную функцию .

Атомная структура головки миозина .

В 1987 г. было показано, что изолированные миозиновые головки способны перемещать актиновые филаменты в искусственных системах биологической подвижности (in vitro motility assay) [20]. Стало ясно, что именно миозиновая головка является молекулярным мотором, способным самостоятельно осуществлять двигательные функции. С этого момента интерес большинства исследователей, изучающих структуру и функции миозина, переключился на изучение миозиновой головки .

При ограниченном протеолизе молекулы миозина трипсином, химотрипсином или папаином можно получить различные фрагменты миозина в изолированном состоянии:

изолированная миозиновая головка или субфрагмент 1 миозина (S1), стержневая часть миозина (rod), N- и C-концевые фрагменты стержневой части – субфрагмент 2 (S2) и легкий меромиозин (LMM), соответственно, а также тяжелый меромиозин (HMM), состоящий из двух головок, присоединенных к S2 (рис. 2). Эти фрагменты, сохраняющие свойства определенных частей молекулы миозина, часто используются в экспериментах вместо целого миозина [1, 3, 7] .

Рис. 2. Схематическое представление молекулы мышеченого миозина (миозина II) и ее фрагментации протеолитическими ферментами: S1, S2 – субфрагменты 1 и 2 миозина, НММ – тяжелый меромиозин, LMM – легкий меромиозин, ЛЦ – легкие цепи, Rod – стержневая часть молекулы миозина. «Шарнирные» участки с малым содержанием спиралей обеспечивают высокую подвижность головок миозина относительно стержневой части и области НММ относительно области LMM; эти участки наиболее подвержены протеолизу, при котором можно получать изолированные фрагменты молекулы миозина [1] .

В 1993 г. были впервые опубликованы данные о полной третичной структуре изолированной миозиновой головки, полученные на основании рентгеноструктурного анализа кристаллов S1 [21]. Особенностью этой структуры является наличие в головке двух четко выраженных доменов – моторного и регуляторного (называемого также “lever arm”). Моторный домен представляет собой глобулярную часть головки, содержащую активный центр АТРазы и участки связывания актина. Важно отметить, что в моторном домене выделяют две короткие -спирали, несущие на концах так называемые «существенные» SH-группы SH1 и SH2 (остатки Cys707 и Cys697 в скелетном S1), одна из которых (спираль SH1) соединяет С-концевой субдомен (окрашен на рис. 3 синим цветом) с «конвертером», а другая (спираль SH2) расположена в С-концевом субдомене в непосредственной близости от активного центра АТРазы, который находится между Nконцевым субдоменом (окрашен на рис. 3 зеленым цветом) цветом и «верхним 50 кДасубдоменом» (окрашен красным цветом на рис. 3) [1] (рис. 3) .

Рис. 3. Третичная структура головки молекулы миозина [21] .

Приблизительно после остатка 780 моторный домен переходит в регуляторный домен, который представляет собой длинную -спираль, стабилизируемую двумя нековалентно ассоциированными с ней легкими цепями – «существенной» (ELC) и регуляторной (RLC) (рис. 3) .

AТРазная активность миозина .

Каждая головка миозина несет один активный центр миозиновой АТРазы .

АТРазная активность миозина проявляется только в присутствии определенных катионов .

In vitro АТРаза миозина сильно активируется ионами Са2+ (Са2+-АТРазная активность) и очень слабо – ионами Mg2+. Однако Mg2+-АТРазная активность миозина резко возрастает при взаимодействии миозина с актином; только эта активность и имеет место в физиологических условиях, где концентрация Mg2+ достаточно высока. Кроме того, в отсутствие двухвалентных катионов (в присутствии ЭДТА) АТРаза миозина активируется одновалентными катионами в высоких концентрациях (так называемая ЭДТА-ATPазная активность), причем степень активации зависит от ионного радиуса катиона: наибольшие значения ЭДТА-ATPазной активности наблюдаются в присутствии катионов K+, NH4+ и Rb+. Катионы с большим или меньшим радиусами неспособны активировать EDTAATPазу миозина [3] .

ЭДТА-ATPазная реакция миозина, активируемая одновалентными катионами, протекает обычно по схеме:

M + ATP M–ATP М + ADP +Pi Совершенно иначе протекает Mg2+-АТРазная реакция миозина, механизм которой включает в себя значительные изменения структуры белка:

M + ATPM–ATP M*–ATP M**–ADP– Pi M*–ADP– Pi M*–ADP + Pi M–ADP M + ADP, где M – активный центр миозина, НММ или S1; M* и M** – изомерные формы белка с увеличенной триптофановой флуоресценцией (каждая звездочка отражает прирост триптофановой флуоресценции на 10%) [1]. Изменение триптофановой флуоресценции указывает на конформационные изменения, происходящие в молекуле миозина .

Наибольшие изменения происходят при образовании интермедиатов M*–ATP и M**– ADP–Pi. Однако такие интермедиаты существуют очень короткое время в процессе АТРазной реакции, что не позволяет проводить детальные исследования структуры головки миозина в этих комплексах. Для этих целей успешно используются стабильные аналоги этих интермедиатов АТРазной реакции миозина – тройные комплексы головки миозина (S1) или ее изолированного моторного домена с ADP и аналогами Pi, такими как анионы ортованадата (Vi), фторида бериллия (BeFx) или фторида алюминия (AlF4). К настоящему времени установлено, что комплекс S1–ADP–BeFx отличается от остальных тройных комплексов S1 с ADP и аналогами Pi: он имитирует интермедиат S1*–ATP, тогда как комплексы S1–ADP–Vi и S1–ADP–AlF4 имитируют интермедиат S1**–ADP–Pi [1] .

Взаимодействие миозина с актином. Механизм мышечного сокращения .

В 1954 году независимо друг от друга, используя разные подходы, Эндрю Хаксли и Хью Хаксли сформулировали теорию скользящих нитей, согласно которой сокращение мышечного волокна происходит за счет скольжения актиновых и миозиновых нитей относительно друг друга, длина нитей при этом не изменяется. Впоследствии выяснилось, что связь между филаментами осуществляется с помощью «поперечных мостиков» – головок миозина, вместе с областью S2 выступающих с поверхности миозинового филамента и способных взаимодействовать с актином. Это взаимодействие сопряжено с гидролизом АТР в миозиновых головках. В отсутствие АТР поперечные мостики прочно присоединены к актиновым филаментам. Однако при связывании АТР с миозиновыми головками сродство их к актину резко снижается и мостики отрываются от актиновых филаментов (рис. 4). Затем в активных центрах АТРазы миозина происходит гидролиз АТР и образуется промежуточный комплекс M**–ADP–Pi (см. приведенную выше схему Mg2+-ATPазной реакции миозина). Образование этого комплекса сопровождается конформационными изменениями в молекуле миозина (M**). В этом состоянии поперечные мостики вновь связываются с актиновыми филаментами, но очень слабо и под другим углом по сравнению со связыванием с отсутствие АТР (рис. 4) .

Рис. 4. Схема функционирования миозиновой головки при ее циклическом взаимодействии с актиновыми филаментами в процессе мышечного сокращения. Во всех положения сверху – актиновый филамент, снизу – миозиновый филамент (А – актин, М – головка молекулы миозина) [1] .

Такое связывание резко ускоряет процесс изомеризации промежуточного комплекса M**-ADP-Pi и соответственно последующий выброс продуктов АТРазной реакции из активного центра миозиновой АТРазы; in vitro это проявляется как сильная активация актином Mg2+-ATPазы миозина. При такой изомеризации происходит изменение ориентации головки миозина относительно актина и вследствие этого перемещение актинового филамента вдоль миозинового филамента. Затем миозиновые головки опять связывают АТР, отрываются от актина и цикл начинается сначала. В результате происходит взаимное «скольжение» миозиновых и актиновых филаментов друг относительно друга, что является основой мышечного сокращения .

Легкие цепи миозина. Регуляторные легкие цепи .

Легкие цепи миозина (ЛЦ) делят на два основных класса – «существенные» и регуляторные. С каждой головкой миозина ассоциированы две ЛЦ, по одной ЛЦ каждого класса. Регуляторные легкие цепи (RLC) называются так, поскольку они участвуют в регуляции ферментативной активности некоторых миозинов (например, миозинов большинства беспозвоночных и миозинов из гладких мышц позвоночных). В мышцах позвоночных эти ЛЦ фосфорилируются, поэтому их еще иногда называют фосфорилируемые ЛЦ. Кроме того, можно встретить еще одно название – ДТНБ (5-5'дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) ЛЦ. Все дело в том, что регуляторные ЛЦ впервые были избирательно отделены от миозина при обработке ДТНБ. RLC относятся к белкам семейства EF-руки. Отличительной особенностью таких белков является способность связывать Са2+ через специальный структурный мотив – спираль-петля-спираль (helixloop-helix). Спиральные участки такого мотива взаимодействуют с Са2+, а участок петли обеспечивает координацию атомов кислорода или азота основной полипептидной цепи белка. Белки семейства EF-руки обладают повышенной специфичностью к ионам кальция по сравнению с другими двухвалентными катионами. Взаимодействие с кальцием приводит к изменению структуры мотива EF-руки. В отсутствие ионов кальция спирали (E и F) в кальций-связывающем мотиве располагаются параллельно, приобретая «замкнутую» конформацию. В присутствии Са2+ спирали EF-руки располагаются перпендикулярно друг другу, приобретая «открытую» форму (рис. 5) [22] .

Рис. 5. Различные конформационные состояния мотива EF-руки RLC миозина человека [22] .

В открытой форме E- и F-спирали могут взаимодействовать с IQ-мотивами в области шейки тяжелой цепи миозина, в то время как закрытая конформация не допускает такого тесного взаимодействия .

Трансляция RLC человека идет с мРНК следующих генов: MYL2, MYL7 (в сердечной ткани), MYL5, MYL9 (в скелетной мускулатуре), MYL10, MYL11, MYL12A, MYL12B (немышечные миозины). Продукты всех этих генов имеют очень высокое структурное сходство. Большинство RLC человека состоит из 172–226 аминокислот и имеет молекулярную массу от 18,8 до 25,3 кДа. RLC состоят из 4 мотивов EF-руки, хотя у некоторые они могут быть частично нарушены, из-за недостатка СаRLC координирующих лигандов .

Основной функцией RLC миозина является процесс регуляции мышечного сокращения по миозиновому типу, характерному для мышц большинства беспозвоночных и гладких мышц позвоночных. В мышцах беспозвоночных (например, моллюсков) такая регуляция осуществляется путем связывания Са2+ с RLC, а в гладких мышцах позвоночных – путем фосфорилирования RLC по остатку серина в N-концевой области специфическим ферментом – киназой ЛЦ миозина (MLCK). Очень интересен механизм такой регуляции, осуществляемой путем фосфорилирования-дефосфорилирования RLC в в немышечных клетках позвоночных и включающей значительные конформационные перестройки молекулы миозина. При физиологических условиях, в присутствии АТР, неупорядоченные С-концевые «хвостики» тяжелых цепей миозина присоединяются к области шейки, где находятся дефосфорилированные RLC [12] (рис. 6). В такой «свернутой» конформации молекула миозина неактивна и неспособна взаимодействовать с актином. Фосфорилирование RLC предотвращает это взаимодействие; в результате молекула миозина II распрямляется и принимает нормальную «вытянутую» конформацию (см. рис. 1), в которой она способна образовывать филаменты, взаимодействовать с актином и осуществлять свои двигательные функции .

–  –  –

Рис. 6. Схематическое изображение молекулы немышечного миозина II класса с дефосфорилированными RLC в неактивной компактной конформации [12] .

В скелетных и сердечных мышцах позвоночных регуляция сокращения (т.е. его запуск) осуществляется по иному принципу – при помощи тропонин-тропомиозиновой системы, ассоциированной с актиновым филаментом (это т.н. «актиновый» тип регуляции). Однако и в этом случае связывание Са2+ с RLC и их фосфорилирование может оказывать заметное влияние на характер взаимодействия миозина с актином и на сократительные свойства мышечных волокон [23] .

Что касается «существенных» легких цепей миозина (ELC), то их структуру и свойства мы рассмотрим в следующем разделе гораздо подробнее, поскольку именно они являлись главным объектом нашего исследования .

1.2. «Существенные» легкие цепи миозина (ELC) Синтез, особенности первичной структуры, распространение и номенклатура изоформ ELC .

Свое название «существенные» легкие цепи (essential light chains, ELC) получили благодаря тому, что ранее они считались необходимыми миозину для проявления его главных свойств – АТРазной активности и способности связываться с актином .

У легких цепей данного типа имеется еще одно название – «щелочные» легкие цепи. Все дело в том, что долгое время ЛЦ этого класса удавалось отделять от тяжелых цепей миозина только в довольно жестких условиях (в присутствии гуанидина-HCl, мочевины или при рН 11). Такая жесткая обработка миозина почти всегда приводила к потере его основных свойств. Однако в начале 80-х годов прошлого века ученым удалось получить изолированные тяжелые цепи миозина, практически свободные от «существенных» ЛЦ, которые сохраняли свои основные типы активностей [24]. Таким образом, стало понятно, что название «существенные» ЛЦ не отражает исходно заложенного в него смысла, поэтому его часто заключают в кавычки, но продолжают пользоваться и по сегодняшний день .

«Существенные» ЛЦ миозина, как и регуляторные ЛЦ, относятся к белкам, способным связывать кальций. В аминокислотной последовательности ELC выделяют четыре мотива EF-руки с нарушенной структурой. Способность связывать Са2+ сохраняется только у ELC из миозина моллюсков. В данном случае координация кальция дополнительно облегчается за счет взаимодействия между ELC и RLC в регуляторном домене миозиновой головки .

«Существенные» ЛЦ связываются с головкой миозина в области IQ мотивов, это взаимодействие схематически представлено на рисунке 7. Видно, что ELC, связанная с регуляторным доменом головки миозина, как будто разделена на две половины, расположенных по разные стороны от -спирали тяжелой цепи. Такое расположение ELC в головке миозина характерно не только для мышечных миозинов человека, но и для миозинов из запирательных мышц моллюсков, и для немышечных миозинов [25] .

Об атомной структуре ELC в свободном состоянии ничего не известно; скорее всего, ELC, не связанная с тяжелой цепью миозина, находится в развернутом состоянии .

Имеются только данные о том, что содержание -спиралей в ELC составляет около 48% [26] .

Рис. 7. Схематическое изображение взаимодействия ELC с IQ-мотивом в -спирали тяжелой цепи регуляторного домена миозиновой головки [25, 27] .

«Существенные» ЛЦ миозина состоят из 150–208 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу от 16,9 до 22,8 кДа. В миозине из быстрых скелетных мышц позвоночных они представлены двумя изоформами – А1 и А2, с молекулярными массами 20,7 кДа и 16,5 кДа соответственно. Эти названия, происходящие от английских терминов Alkali 1 и Alkali 2 (т.е. «щелочные» ЛЦ-1 и «щелочные» ЛЦ-2) традиционно используются в литературе для обозначения этих двух изоформ ELC; мы также будем часто употреблять их при сравнении этих изоформ .

Обе изоформы ELC из скелетных мышц, A1 и A2, кодируются одним геном, c которого в результате работы дискретных промоторов и за счёт альтернативного сплайсинга синтезируются две мРНК [28, 29] и как следствие – два белка. Изоформы ELC человека кодируются геном MYL1 (HUGO) (хромосома 2q32,1qter), в результате работы этого гена можно получить длинную изоформу ELC – A1, состоящую из 194 аминокислотных остатков, и более короткую – А2, состоящую из 150 аминокислотных остатков (рис. 8) .

Изоформы А1 и А2 имеют идентичные С-концевые последовательности (141 аминокислотный остаток). В общей С-концевой области обеих «существенных» ЛЦ расположен единственный остаток цистеина (в положении 181 у А1 и в положении 137 у А2). Остальные девять N-концевых остатков А2 не полностью идентичны А1, в этой области имеется шесть аминокислотных замен (на рисунке 8 выделены зеленым цветом) .

Кроме того, А1 имеет в N-концевой области дополнительный сегмент из 44 аминокислотных остатков, в составе которого выделяют область, богатую повторами AlaPro (выделена голубым цветом на рис. 8), и несколько положительно заряженных остатков Lys у самого N-конца А1 (выделены красным цветом на рис. 8). Именно наличие у А1 дополнительного N-концевого сегмента определяет различия в свойствах А1 и A2 .

Рис. 8. Аминокислотные последовательности изоформ «существенных» легких цепей миозина из скелетных мышц человека – А1 (P05976) и А2 (P06741). А1 на 44 аминокислотных остатка длиннее, чем А2. Зеленым цветом выделена область, в которой последовательности А1 и А2 могут не совпадать. В последовательности дополнительного N-концевого сегмента А1, отсутствующего у А2, голубым цветом выделена область AlaPro повторов, а красным – положительно заряженного кластера около N-конца .

Длинные изоформы ELC, подобные А1 из быстрых скелетных мышц, также синтезируются в медленных скелетных мышцах и в миокарде. Ген MYL3, расположенный на хромосоме 3p21.3-p21.2, кодирует изоформы ELC из медленных скелетных мышц, а также из жедочков сердца (ELCv), тогда как ELC предсердий (ELCa) кодируется геном MYL4 (хромосома 17q21-qter) [30, 31]. При этом во время эмбрионального развития ELCa встречается не только в предсердиях, но и в желудочках сердца [32], а также в скелетной мышце плода, однако во взрослой жизни ELCa имеется только в предсердиях. Экспрессия может также возникать в желудочках больных с различными видами ELCa кардиомиопатии, что приводит к нарушению работы миокарда, несмотря на высокую гомологию аминокислотных последовательностей ELCa и ELCv [33]. Короткие изоформы ELC (длиной до 150 аминокислотных остатков) представлены больше всего в гладкой мускулатуре и в немышечных клетках и тканях. По аминокислотной последовательности они сходны с изоформой А2 из быстрых скелетных мышц .

Сердечные изоформы «существенных» легких цепей миозина .

В предсердиях и желудочках сердца человека синтезируются разные изоформы ELC миозина – ELCa и ELCv, соответственно (atrial ELC и ventricular ELC). Рассмотрим подробнее свойства этих сердечных изоформ ELC .

ELCа из предсердий состоит из 197 аминокислотных остатков и содержит в своей центральной и С-концевой области два остатка цистеина, а ELCv из желудочков состоит из 195 остатков и содержит три остатка цистеина (рис. 9). По своей структуре обе эти изоформы похожи на удлиненную изоформу ELC (А1) из миозина скелетных мышц. При этом сродство ELCа к актину ниже, чем у ELCv; видимо, это связано с тем, что ELCa содержит в N-концевой области 8 положительно заряженных остатков, а ELCv – 9 таких остатков (на рис. 9 эти остатки выделены красным цветом) .

В одной из работ, посвящённой изучению функций сердечных изоформ ELC, Timson с соавторами продемонстрировали, что по активности актин-активируемой Mg-ATPазы скелетный S1, содержащий рекомбинантную ELCa из предсердий человека, почти не отличался от S1(А1) из скелетных мышц кролика, однако после удаления 45 N-концевых остатков из ELCa активность АТРазы становилась такой же, как у S1(А2). При этом препарат S1, содержащий рекомбинантную ELCa, из которой были удалены 11 Nконцевых остатков, по своей активности занимал промежуточное положение между S1(A1) и S1(A2), хотя активность его актин-активируемой ATPазы была все-таки больше похожа на активность S1(A2) [34] .

Рис. 9. Аминокислотные последовательности изоформ ELC миозина из сердечной мышцы человека – ELCa (P12829) и ELCv (P08590). Черным цветом выделены области, в которых последовательности ELCa и ELCv не совпадают. Красным цветом выделены положительно заряженные аминокислотные остатки в N-концевом сегменте ELC .

В сердце имеется две изоформы тяжелых цепей миозина (MHC):

-MHC, которая встречается в основном в предсердиях, и -MHC, которая экспрессируется только в желудочках. Было показано, что очищенный миозин предсердий несколько быстрее перемещает актиновые филаменты в искусственной системе подвижности по сравнению с миозином желудочков, но при этом развивает значительно меньшую силу [35] .

Интересно, что работа сердца регулируется не только изоформами MHC, но и изоформами ELC. Действительно, гораздо проще, видимо, использовать ELC миозина для модуляции и регуляции мышечного сокращения, чем тяжелые цепи миозина. Обе изоформы ELC миозина, ELCa и ELCv, похожи и содержат на N-конце дополнительный сегмент, но отмечалось, что именно ELCа в миозине предсердий обеспечивает улучшение общей сердечной активности. Так, в группе Morano проводили исследования на мышечных волокнах из желудочков сердца человека, взятых при трансплантации сердца у различных групп пациентов: с ишемической кардиомиопатией, с расширенной кардиомиопатией и с нормальными человеческими сердцами. Авторы отметили, что когда в миозине желудочков происходила частичная замена ELCv на ELCa, это приводило к увеличению максимальной скорости сокращения и расслабления мышечного волокна, а также к увеличению кальциевой чувствительности сокращения. Такая частичная замена ELCv на ELCa в желудочках считается компенсаторным ответом при сердечной недостаточности [36]. Эксперименты с использованием трансгенных мышей и крыс подтвердили результаты, полученные на людях. У таких животных отмечалось увеличение скорости и общей эффективности работы желудочков сердца, экспрессирующих ELCa [37]. В одной из работ было отмечено, что при этом в результате увеличения активности сердца не происходило развития сердечной гипертрофии. Таким образом, экспрессия ELCa в желудочке, по-видимому, в некоторых случаях выгодна для сердца и приводит к усилению сердечной функции [38]. Интересно, что при постоянных и активных физических тренировках в желудочках сердца крыс происходит повышение уровня экспрессии ELCa, что в итоге приводит к улучшению сократимости сердца [39] .

Опосредованное ELCa усиление работы сердечной мышцы подтвердили и на уровне миозина. Для этого в филаментах миозина желудочков проводили частичную замену ELCv на рекомбинантные ELCa и показали, что такая замена на 12%, 24% и 42% приводила к увеличению актин-активируемой ATPазной активности миозина на 18%, 26% и 36%, соответственно [40] .

Клинические исследования показали, что нарушения в ELCv, вызываемые мутациями в гене MYL3, кодирующем ELCv, могут быть ассоциированы с семейными гипертрофическими кардиомиопатиями (FHC – Familial hypertrophic cardiomyopathy) – аутосомно-доминантными заболеваниями, характеризующимися гипертрофией стенок левого желудочка. Очень часто такие нарушения могут приводить к внезапной смерти без предшествующих симптомов или предупреждений [41]. Общий клинический фенотип пациентов с FHC широк: от полного отсутствия сердечно-сосудистых симптомов до сильной одышки и боли в груди. FHC вызваны ошибками или делециями в генах, которые кодируют основные саркомерные белки, такие как -MHC, титин, актин; -тропомиозин;

тропонины Т, I и С, С-белок, RLC и ELC. В частности, на сегодняшний день известно 7 аминокислотных замен в ELCv человека, вызываемых мутациями в гене MYL3, которые ассоциированы с FHC: E56G, A57G, E143K, M149V, R154H, M173V и E177G [42-47]. Все эти мутации расположены в участках гена, которые кодируют EF-Ca2+-связывающие мотивы в той области ELC, которая взаимодействует с -спиралью тяжелой цепи регуляторного домена миозиновой головки. При этом никаких мутаций, ассоциированных с FHC, не было обнаружено в других функционально важных участках ELCv, расположенных в ее N-концевой области, таких как актин-связывающий участок на Nконце ELCv или богатая пролином область. Все эти мутации в гене ELCv, приводящие к развитию FHC, находятся в его очень консервативных участках .

Известно несколько случаев, когда мутация E143K в гене MYL3 являлась причиной смерти при рождении или в молодом возрасте. В одной из совсем недавно опубликованных работ [48] было показано, что у трансгенных мышей с мутацией E143K в ELCv человека развивается интерстициальный фиброз, наблюдается нарушение систолы и увеличение силы сокращения мышечного волокна. При этом на молекулярном уровне вследствие этой мутации происходит усиление связывания миозина с актином и повышение актин-активируемой АТРазной активности миозина. В другой работе [49] авторы подробно изучили влияние гипертфрофической мутации A57G в ELCv на работу сердечной мышцы трансгенных мышей, миозин которых содержал ELCv с этой мутацией .

Ранее мутация A57G была обнаружена в двух несвязанных корейских семьях с гипертрофическими кардиомиопатиями и у одного японского пациента с классической асимметричной септальной гипертрофией [46]. Интересно отметить, что эта мутация локализована в первичной структуре ELC поблизости от ее уникального N-концевого сегмента который может формировать в миозиновой головке (остатки 1–45), дополнительный сайт взаимодействия с актином в процессе АТРазного цикла, делая такое взаимодействие более прочным. Поскольку этот N-концевой сегмент ELC принимает активное участие в работе головки миозина как молекулярного мотора, то мутации в области этого сегмента или поблизости от него могут, видимо, приводить к нарушениям сократительных функций мышечного волокна. В работе [49] было показано, что мутация A57G в ELCv миозина у трансгенных мышей приводила к развитию фиброза и нарушению морфологии сердечной мышцы, но при этом изменения толщины стенок сосудов не наблюдалось. На молекулярном уровне такая аминокислотная замена в ELC снижала максимальную силу, развиваемую мышечными волокнами. В то же время мутация A57G в ELC приводила к увеличению кальциевой чувствительности сокращения волокон. Интересные данные были также получены для мутации Е56G в ELCv: было показано, что эта мутация резко снижает сродство ELC к участку ее взаимодействия с тяжелой цепью миозина в регуляторном домене миозиновой головки [50] и снижает как жесткость молекулы миозина, так и скорость осуществляемого миозином перемещения (скольжения) актиновых филаментов в искусственной подвижной системе [51] .

Исследование кардиомиопатических мутаций в ELC приобретает в последнее время все большую популярность. Для некоторых из них (к примеру, A57G и Е56G) уже накапливаются данные об их влиянии на свойства миозина и на сократительные свойства мышечных волокон. В то же время для большинства других подобных мутаций в ELC (таких, например, как кардиомиопатические мутации M149V и E177G) известно пока лишь то, что они ассоциированы с развитием кардиомиопатий, но почти ничего пока не известно о том молекулярном механизме, который лежит в основе этого процесса .

Влияние ELC на свойства миозина и его изолированных головок; сравнение свойств препаратов S1, содержащих разные изоформы ELC – А1 и А2 .

Каждая из двух головок в молекуле миозина из быстрых скелетных мышц содержит только одну из изоформ ELC (либо А1, либо А2), поэтому миозин может существовать либо в виде гомодимера, содержащего в обеих головках одинаковые ELC, либо в виде гетеродимера, содержащего разные изоформы ELC. Еще в 70-х годах прошлого века был разработан метод, позволяющий с помощью ионообменной хроматографии разделять головки миозина по содержанию в них «существенных» ЛЦ и получать в чистом виде препараты S1, содержащие либо А1, либо А2 [52]; впоследствии этот метод был значительно усовершенствован [53]. Сравнение свойств препаратов S1, содержащих разные изоформы ELC, позволило получить дополнительную информации о функциях ELC. На сегодняшний день известно, что они играют важную роль в стабилизации головки миозина в области активного и актин-связывающего центров [54] .

Изолированные тяжелые цепи миозина (без ELC) очень лабильны и быстро теряют свою АТРазную активность и способность связываться с актином [24, 55], а их реассоциация с ELC частично восстанавливает эти свойства [55]. Было также показано, что гомодимеры миозина по А1 и по А2 имеют одинаковые Са2+-, Mg2+- и К+-ЭДТА-АТРазные активности и не различаются по механизму гидролиза АТР [23]. Однако такие различия в «существенных» ЛЦ оказывают значительное влияние на актин-активируемую Mg2+АТРазную активность миозина. В 1975 году было впервые показано, что эта АТРаза S1(A1) активируется актином в два раза слабее, чем у S1(A2). Км для активации АТРазы актином для S1(A2) оказалась значительно выше, чем для S1(A1), что говорит о более прочном связывании S1(А1) с актином [52]. Высокое сродство к актину головок миозина, содержащих А1, подтвердили с помощью метода аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным актином. Фракции, содержащие S1(A2), элюировались с колонки градиентом концентрации Mg-ATP раньше, чем фракции с S1(A1) [56]. Важно отметить, что все описанные выше различия в свойствах S1(A1) и S1(A2) имели место только лишь в условиях низкой ионной силы (6 мМ KCl), а повышение ионной силы до 46 мМ нивелировало все имеющиеся различия. При этом актин-активируемая АТРазная активность S1(А2) не менялась, а активность S1(A1) увеличивалась, достигая тех же значений, что и для S1(A2) [24, 57]. Подобные различия между S1(A1) и S1(A2) наблюдали и при измерениях прочности их связывания с F-актином методом соосаждения как в присутствии, так и в отсутствие АТР: при низкой ионной силе S1(A1) связывался с актином значительно прочнее, чем S1(A2), но эти различия полностью исчезали при повышении ионной силы [58]. Интересно заметить, что во всех перечисленных случаях изменялись только свойства S1(A1), они приближались к свойствам S1(A2). Можно предложить два объяснения такому явлению: либо N-концевой сегмент А1 участвует в формировании дополнительного контакта головки миозина с актином, либо изоформа А1 может вызывать конформационные изменения в тяжелой цепи миозина, которые усиливают его сродство к актину. В любом случае, все описанные выше различия между S1(A1) и S1(A2) можно объяснить наличием у А1 дополнительного N-концевого сегмента, свойства которого мы подробно рассмотрим в следующем разделе .

N-концевой сегмент «существенной» легкой цепи А1 миозина и его взаимодействие с актином .

Изоформы «существенных» легких цепей A1 и A2 имеют одинаковые С-концевые аминокислотные последовательности, через которые они связаны с тяжелой цепью миозина и, возможно, c RLC [21, 27]. Отличаются эти две изоформы ELC наличием Nконцевого дополнительного сегмента у легкой цепи А1. На сегодняшний день уже ясно, что основной функцией этого N-концевого сегмента является его взаимодействие с актином в процессе АТРазного цикла. В отличие от Ca2+-зависимой регуляции сокращения мышц моллюсков и гладких мышц позвоночных, которая осуществляется путем прямого связывания Ca2+ с миозином или путем Ca2+-зависимого фосфорилиррования RLC (регуляция миозинового типа), запуск сокращения в поперечнополосатой мышце осуществляется при взаимодействии Са2+ с тропонином С (TnC), которое инициирует серию конформационных изменений в регуляторных мышечных белках – тропонине (Tn) и его компонентах (TnI и TnT) и в тропомиозине (Tm), что приводит к взаимодействию толстых миозиновых филаментов с тонкими актиновыми филаментами и, как следствие, к развитию мышечного сокращения. Такой тип регуляции мышечного сокращения называется актиновым. Tm и Tn в тонком филаменте управляют процессом образования поперечных мостиков между актином и миозином путем стерического блокирования сайтов связывания миозина в актине [59]. Какую точно роль в этом процессе играют ELC (А1 и А2), а особенно N-концевой сегмент А1, ещё предстоит определить, но интересно то, что в основном во всех мышцах с актиновым типом регуляции ELC представлены своей удлиненной изоформой, и лишь в быстрых скелетных мышцах обе изоформы ELC, А1 и А2, присутствуют одновременно .

К настоящему времени существуют многочисленные доказательства того, что при сокращении мышц N-концевой сегмент А1 способен напрямую взаимодействовать с актином. Некоторые из первых доказательств этого взаимодействия были получены с помощью метода ЯМР. Авторы показали, что взаимодействие S1(A1) с актином сопровождается значительными структурными изменениями в области N-концевого сегмента A1 [32]. Другие доказательства такого взаимодействия были получены при обработке комплексов S1(A1) и S1(A2) с актином бифункциональным реагентом с нулевой длиной сшивки (водорастворимым карбодиимидом). Было показано, что в условиях низкой ионной силы A1, в отличие от A2, ковалентно пришивалась к С-концевой области актина в области остатков 360–363 [60], причем при повышении ионной силы до 100 мМ КСl степень такой сшивки уменьшалась на 50% [61]. В 1985 году при обработке А1 тромбином впервые удалось получить изолированный N-концевой фрагмент А1 из скелетных мышц кролика и из сердечной мышцы быка, после чего методами аффинной хроматографии и H-ЯМР спектроскопии было показано, что такой фрагмент сам способен напрямую взаимодействовать с актином [62]. Впоследствии, при подробном анализе полученных с помощью криоэлектронной микроскопии трехмерных изображений актиновых филаментов, декорированных либо S1(A1), либо S1(A2), были получены убедительные доказательства того, что участок связывания А1 находится в С-концевой области актина в области остатков 360–363 [63]. С помощью метода 1H-ЯМР было показано, что непосредственно с актином взаимодействуют несколько первых Nконцевых аминокислотных остатков дополнительного сегмента А1: Ala1-Pro2-Lys3-Lys4 [64]. ELC типа А1, но не А2, могут быть химически сшиты с актином благодаря тому, что их центральная и С-концевая области нековалентно связаны с тяжелой цепью миозина, тогда как N-конец А1 находится в свободном состоянии. Удаление первых 13 N-концевых аминокислотных остатков (включая 2 пары остатков лизина) у А1 в препарате S1(A1) приводило к практически полному исчезновению сшивок между A1 и актином и восстановлению скорости актин-активируемой Mg-ATPазы S1(A1) до уровня S1(A2) [34] .

Аналогичные результаты были получены, когда S1(A1) обрабатывали папаином в мягких условиях, чтобы удалить только 13-членный N-концевой фрагмент А1. Оказалось, что параметры Км и Vmax актин-активируемой АТPaзы S1(A1) после такой обработки очень мало отличались от соответствующих параметров для S1(A2). Самые интересные результаты были получены, когда свободный пептид, соответствующий первым 13 Nконцевым аминокислотным остаткам А1, добавляли к S1(A1) во время актинактивируемой АТРазной реакции, в результате чего значения KМ и Vmax для S1(A1) также приближались к значениям, характерным для S1(A2) [65]. Из этих данных можно сделать интересный вывод о конкуренции за связывание с актином в процессе ATPазного цикла между N-концевым сегментом А1 в S1(A1) и свободным N-концевым пептидом этого сегмента. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что кинетические параметры актинактивируемой АТРазной реакции отличаются от параметров S1(A1) S1(A2) исключительно благодаря наличию у А1 дополнительного N-концевого сегмента (в частности, наличию положительно заряженных остатков лизина в его N-концевой части), который в процессе АТРазного цикла взаимодействует с актином. Отсюда становится понятным, почему в отсутствие актина между S1(A1) и S1(A2) не наблюдается разницы в АТРазной активности. В одной из работ с помощью сайт-направленного мутагенеза были получены рекомбинантные препараты А1 с заменой остатков лизина в положениях 3 или 4 на аланин, а также А1 с заменой остатка лизина в положении 4 на аспартат, и было показано, что такие замены в А1, включенной в S1(A1), снижают степень сшивки А1 с актином [64] .

Важность N-концевого сегмента А1 в регуляции сокращения сердечной мышцы была показана в нескольких экспериментах с использованием синтетических пептидов разной длины, соответствующих остаткам 5–14, 5–10 и 5–8 в аминокислотной последовательности N-концевого сегмента А1-подобной ELC из желудочков сердца (ELCv). Скорость сокращения и расслабления мышечного волокна увеличивалась при добавлении к нему таких пептидов, причем наибольший эффект наблюдался для самого длинного пептида (остатки 5–14); чтобы достичь такого же эффекта с помощью других пептидов требовались гораздо более высокие их концентрации. При этом контрольные пептиды со случайной аминокислотной последовательностью не влияли на силу и скорость сокращения волокон [66]. Подобные эффекты были получены и в другой работе, проведенной на сердечных миофибриллах крыс, где также использовали пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 5–14 из N-концевого сегмента ELCv и способный конкурировать с ELCv за связывание с актином: было показано, что добавление этого пептида к миофибриллам приводило к почти двукратному увеличению их АТРазной активности [67] .

В структуре дополнительного сегмента A1 важную роль играет не только область положительно заряженных остатков лизина на самом N-конце аминокислотной последовательности, но и следующий за ней участок, содержащий повторы Ala-Pro .

Известно, что пептид, состоящий из четырех повторов -аминоизомасляной кислоты и пролина, имитирующий Ala-Pro повторы в структуре белков, по кристаллографическим данным имеет очень жесткую конформацию [68]. В одной из работ с помощью математических методов (Simplex алгоритм) авторы провели структурный анализ области Ala-Pro повторов в А1 (остатки 14–27). Оказалось, что она представляет собой стержнеподобный пептид с ограниченной внутренней гибкостью и длиной около 8–9 нм [69] (рис. 10). В совокупности эти данные говорят о том, что область Ala-Pro повторов в N-концевом сегменте А1 может выполнять роль жесткой "распорки", которая позволяет положительно заряженным остаткам лизина на N-конце А1 "дотянуться" до актина в процессе АТРазного цикла .

Рис. 10. Модель N-концевого сегмента «существенной» легкой цепи А1 миозина (46 аминокислотных остатков). Расстояние между N-концевым и С-концевым остатками дополнительного сегмента А1 составляет около 9 нм [70] .

Важные свидетельства возможной роли области Ala-Pro повторов в N-концевом сегменте А1 при взаимодействии миозина с актином были получены с помощью методов белковой инженерии. Удаление только этой области из N-концевого сегмента А1 (при том, что N-концевые лизины не были удалены) не изменяло способность А1 в свободном состоянии связываться с актином и сшиваться с ним, но полностью предотвращало сшивку А1 с актином в том случае, когда такие укороченные A1 (delA1) находились в составе S1; при этом кинетические параметры актин-активируемой ATPазы для S1(delA1) уже не отличались от параметров для S1(A2). Интересно, что А1 с удвоенным участком повторов Ala-Pro аминокислотной последовательности (dblА1) эффективно сшивался с актином как в свободном состоянии, так и в составе S1. При этом Км для S1(dblА1) была такой же, как для S1(A1), в то время как максимальная скорость актин-активируемой ATPазы (Vmax) была как у S1(A2) [Timson & Trayer, 1997]. Таким образом, дупликация участка Ala-Pro повторов в А1 не влияла на способность А1 в составе S1(A1) связываться с актином, но полностью подавляла эффект такого взаимодействия на скорость гидролиза АТР в активном центре S1. Это значит, что богатый повторами Ala-Pro участок А1 может, по-видимому, не только выполнять роль «антенны», которая доставляет N-концевые положительно заряженные остатки Lys в А1 к поверхности актина, но также способен принимать непосредственное участие в процессе модуляции скорости АТРазного цикла S1(A1) .

Как именно N-концевой сегмент А1 преодолевает расстояние от регуляторного домена головки миозина до поверхности актина до сих пор точно не известно. Данные кристаллических структур головок миозина могли бы дать ответ на этот вопрос, но, к сожалению, ни на одной из имеющих на сегодняшний день атомных структур S1 по разным причинам нет N-концевого сегмента А1. Попробуем разобраться, какие же на сегодняшний день имеются экспериментальные данные о механизме взаимодействия Nконцевого сегмента А1 c актином. В 2007 году Susan Lowey с соавторами сконструировали мутантную форму A1, в N-концевой сегмент которой ввели два дополнительных остатка цистеина, Сys3 и Сys45. Эти остатки пометили разными флуоресцентными метками, образующими донорно-акцепторную пару, и с помощью метода Фёрсторовского резонансного переноса энергии измерили расстояние между двумя этими метками, которое оказалось равным ~4,1 нм. Это расстояние, измеренное для свободной А1 в нативных условиях, не изменялось в присутствии 6М гуанидин гидрохлорида; это может говорить о том, что N-концевой сегмент А1 в свободном (как от актина, так и от S1) состоянии находится, видимо, в форме статистического клубка [71] .

Однако мы уже знаем, что область Ala-Pro повторов в составе N-концевого сегмента А1 может формировать вытянутую структуру, способную «дотягиваться» до поверхности актина. При этом она представляет собой «палку», которая позволяет N-концевым заряженным остаткам А1 преодолевать расстояние более 4 нм по направлению к актину .

Компьютерный докинг структуры S1 в трехмерную реконструкцию актиновых филаментов, декорированных S1, позволил оценить расстояние от первого разрешенного остатка в структуре ELC (5-й остаток в A2) в составе S1 до ближайшего участка на поверхности актина, составляющее более 8 нм. Более того, оказалось, что этот участок расположен не на том мономере актина, с которым связывается тяжелая цепь головки миозина, а на соседнем [71] .

Доказательства того, что при взаимодействии S1(A1) с актиновым филаментом тяжелая цепь S1 и N-концевой сегмент A1 связываются с разными мономерами актина, были получены еще в ранних работах при помощи нескольких разных подходов. Один из них – сшивка N-концевого сегмента А1 с актином при разных молярных отношениях S1(А1) к актину [72]. Было показано, что увеличение этого соотношения сначала приводило к росту количества пришитой к актину А1, но по мере его приближения к соотношению 1:1 количество сшивок уменьшалось, а при полном насыщении актиновых филаментов молекулами S1(А1) А1 переставал «пришиваться» к актину. Это можно объяснить тем, что тяжелая цепь миозина обладает более высоким сродством к актину, чем N-конец А1; следовательно, при высоких степенях насыщения актинового филамента головками миозина все мономеры актины будут заняты именно тяжелыми цепями миозина, а не N-концевыми сегментами A1. В другой работе, также подтверждающей этот факт, авторы использовали ДНКазу I, которая обладает высоким сродством к мономерному актину (G-актину), предотвращая его полимеризацию с образованием актиновых филаментов (F-актина). Если к комплексу G-актина с ДНКазой I добавляли свободные А1, то образовывались сшивки между актином и N-концевым сегментом А1;

если же добавляли S1(A1), то с мономером актина взаимодействовала только тяжелая цепь S1 [34] .

Также было показано, что S1(A1) может инициировать полимеризацию актина при значительно более низких концентрациях и с гораздо более высокой скоростью, чем S1(A2) [73]. Известно, что актин в условиях низкой ионной силы и в отсутствие Mg2+ существует в виде мономера (G-актин). Добавление S1 к G-актину приводит к полимеризации актина, в результате чего формируется F-актин. В таком случае S1 стабилизирует зародыш полимеризации актина, который состоит из двух мономеров актина. В одной из работ была получена мутантная форма А1, у которой была избирательно удалена область Ala-Pro повторов в N-концевом сегменте А1. Во-первых, оказалось, что S1(A1), содержащий такую мутантную форму А1, утрачивал способность к высокоскоростной полимеризации актина и вел себя так же, как S1(A2). Во-вторых, его способность к полимеризации актина хорошо коррелировала с кинетическими параметрами актин-активируемой АТРазы, которые в условиях низкой ионной силы (5 mM KCl) были точно такие же, как и у S1(A2) [71]. Отсюда можно сделать вывод, что за способность взаимодействовать с актином в процессе АТРазного цикла и за процесс полимеризации актина отвечают одни и те же взаимодействия N-конца А1 с актином .

Поскольку процесс полимеризации актина начинается с образования актинового димера, то логично предположить, что тяжелая цепь S1 и N-конец А1 действительно связываются с разными мономерами актина, что способствует стабилизации димера и более быстрому и эффективному формированию F-актина .

Таким образом, существует большое количество экспериментальных доказательств того, что в процессе АТРазного цикла несколько положительно заряженных остатков лизина на N-конце дополнительного сегмента А1 с помощью антенно-подобной структуры, формируемой повторами Ala-Pro, дотягиваются до поверхности актинового филамента и находят там сайт посадки. Такое дополнительное связывание головки миозина (через N-концевой сегмент А1) с поверхностью актина приводит к изменениям в кинетике актин-активируемой миозина, что в итоге отражается на ATPазы физиологических параметрах сокращения целой мышцы .

Взаимодействие N-концевого сегмента «существенной» легкой цепи А1 миозина с моторным доменом миозиновой головки .

Если взаимодействию N-концевого сегмента A1 с актином посвящено множество работ, результаты которых не вызывают сомнений в его существовании (в настоящее время обсуждаются лишь некоторые особенности такого взаимодействия), то данные литературы о возможности взаимодействия этого сегмента с моторным доменом миозиновой головки немногочисленны и зачастую весьма противоречивы .

Одним из первых указаний на то, что N-концевой сегмент A1 может взаимодействовать с моторным доменом головки, были данные электронномикроскопических исследований, согласно которым моноклональные антитела к последовательности первых четырех N-концевых остатков A1 связываются с миозиновой головкой на расстоянии ~11 нм от места ее соединения со стержневой частью миозина, т.е. в моторном домене головки [74]. Другим косвенным указанием на такое взаимодействие было то, что химическое сшивание S1(A1) в отсутствие актина сильно ингибировало его актин-активируемую ATPазу, тогда как степень активации актином сшитого S1(A2) оставалась неизменной [75]. Более прямые данные по химическому сшиванию были получены B. Pliszka с соавторами, которые в своей работе использовали бифункциональный реагент с нулевой длиной сшивки и показали, что первые 30 аминокислотных остатка с N-конца А1 могут сшиваться с С-концевым фрагментом c мол .

м. 20 кДа тяжелой цепи S1 [76]. Было высказано предположение, что при этом А1 сшивается с т.н. "конвертером" – областью моторного домена S1, которая примыкает к регуляторному домену (см. рис. 3) и содержит многочисленные кислые остатки, с которыми может связываться положительно заряженный N-конец A1. В этом взаимодействии участвовал именно N-конец А1, поскольку после удаления фрагмента с мол. м. ~2 кДа с N-конца А1 путем обработки S1(A1) термолизином ковалентная сшивка уже не наблюдалась. Эффективность образования самой сшивки была довольно низкая;

это говорит о том, что взаимодействие было слабое. Следует также отметить, что такая сшивка N-концевого сегмента A1 с тяжелой цепью S1 была нечувствительна к добавлению ATP [76] .

Позднее S. Lowey с соавторами, используя легкую цепь A1, меченную по N-концу кластером золота и включенную в S1, определили методом электронной криомикроскопии положение этого золотого кластера в актиновых филаментах, декорированных S1 .

Оказалось, как ни странно, что N-концевая область A1 располагается не на актине, а поблизости от SH3-домена – области S1, расположенной поблизости от N-конца тяжелой цепи миозина в моторном домене S1 (остатки 35–80). Принимая во внимание, что SH3домены могут связывать лиганды, богатые пролином, авторы предположили, что богатая пролином последовательность N-концевого сегмента A1 может связываться с SH3доменом S1. Далее авторы с помощью молекулярного докинга измерили расстояния от первого разрешенного N-концевого остатка ELC (5-й остаток последовательности А2) до поверхности актина, которое составило 8,9 нм, и до SH3-домена тяжелой цепи S1 – 6,6 нм .

Они также определили расстояние от SH3-домена до поверхности актина, которое составило 3,6 нм. На основании этих данных авторы также высказали предположение, что богатая пролином последовательность N-концевого сегмента A1 постоянно связана с SH3доменом на всех стадиях ATPазного цикла, и что дополнительный сегмент А1 использует этот домен как "стартовую площадку" для дальнейшего взаимодействия положительно заряженных остатков лизина на N-конце А1 с актином [71]. Следует отметить, однако, что эти эксперименты проводились на актиновых филаментах, полностью декорированных S1, т.е. в тех условиях, весьма далеких от физиологических, когда N-концевой сегмент A1 может вообще не связываться с актином, поскольку вся поверхность актина была занята головками миозина [72] .

Следуя рассмотренным выше данным литературы, можно предположить, что богатая пролином последовательность N-концевого сегмента A1 (остатки 15–28) всегда связана с моторным доменом S1, независимо от присутствия или отсутствия ATP. Это, видимо, совсем не так в случае сильно заряженного N-конца A1, чье электростатическое взаимодействие с актином (и, вероятно, с моторным доменом S1) является ATPзависимым. Мы полагаем, что на разных стадиях ATPазного цикла S1 N-конец A1 может связываться или с актином (в состоянии сильного связывания S1 с актином), или с моторным доменом S1 (когда S1 связывает ATP и диссоциирует от актина). Этим подразумевается, что оба эти взаимодействия N-конца A1 (не только с актином, но и с моторным доменом S1) должны быть ATP-зависимыми. Идея об индуцируемом ATP взаимодействии N-конца A1 с моторным доменом S1 подтверждается результатами исследований поляризованной флуоресценции S1, содержащего A1, флуоресцентно меченую по N-концу, в которых было продемонстрировано значительное увеличение анизотропии флуоресценции при добавлении что, по мнению авторов, ATP, подразумевало взаимодействие N-конца A1 с тяжелой цепью S1, которое приводило к частичной иммобилизации флуоресцентной метки [77]. Это позволяет предположить, что в определенных условиях (когда головка миозина диссоциирует от актина в процессе АТРазного цикла) дополнительный N-концевой сегмент А1, благодаря своей полужесткой структуре, может вовлекаться не только в межмолекулярные взаимодействия с актином, но и во внутримолекулярные взаимодействия с моторным доменом головки миозина .

Другим интересным свойством N-концевого сегмента легкой цепи А1 является его способность индуцировать межмолекулярные взаимодействия между молекулами S1(A1), приводящие к их необычной агрегации, которая была впервые описана еще в ранних работах [78, 79]. Впоследствии был проведен более подробный сравнительный анализ агрегационных свойств двух изоформ S1, содержащих разные существенные легкие цепи, A1 и A2 [80]. Было показано значительное различие между этими изоформами S1, проявляющееся в температурных зависимостях их агрегации, измеренной по возрастанию кажущейся оптической плотности при низкой ионной силе. В этих условиях агрегация молекул S1, содержащих легкую цепь A1 (но не A2), сильно зависела от концентрации белка, увеличение которой сдвигало кривую температурной зависимости агрегации приблизительно на 10C в сторону более низких температур. Был сделан вывод о том, что агрегационные свойства изоформы S1(A1) при низкой ионной силе определяются в основном межмолекулярными взаимодействиями сегмента N-концевого A1 (отсутствующего в A2) c другими молекулами S1 (предположительно с их моторными доменами), и эти взаимодействия не зависят от тепловой денатурации молекул S1, так как они имеют место даже при низких температурах. Было высказано предположение о том, что такие межмолекулярные взаимодействия отражают способность N-концевого сегмента А1 участвовать во внутримолекулярных взаимодействиях с моторным доменом собственной молекулы S1, которые могут играть существенную роль в процессе мышечного сокращения [80]. Можно предположить два главных взаимодействия, в которых участвует N-концевой сегмент А1: в отсутствие нуклеотидов в активном центре S1 он взаимодействует с актиновым филаментом, создавая на миозиновой головке дополнительный актин-связывающий участок и повышая прочность ее связывания с актиновым филаментом, а в процессе АТРазной реакции (в промежуточных состояниях M*–ATP и M**–ADP–Pi) – с моторным доменом S1. Соответственно, вероятность такого внутримолекулярного взаимодействия должна заметно повышаться в процессе ATPазной реакции S1 благодаря сближению N-концевого сегмента А1 с моторным доменом S1 вследствие поворота регуляторного домена относительно моторного домена. Напротив, в отсутствие как актина, так и нуклеотидов N-концевой сегмент А1 начинает взаимодействовать, по-видимому, с моторными доменами других молекул S1, что и отражается в необычной агрегации S1(A1). Если это действительно так, то вероятность таких межмолекулярных взаимодействий N-концевого сегмента А1 должна сильно снижаться при моделировании промежуточных стадий ATPазной реакции (M*–ATP и M**–ADP–Pi), что должно заметным образом отражаться на агрегационных свойствах S1(А1) в этих условиях. Проверка этого предположения являлась одной из задач наших исследований .

Судя по имеющимся на сегодняшних день данным, представляется вполне вероятным, что межмолекулярные взаимодействия N-концевого сегмента А1 могут отражать его способность в определенных условиях (например, в процессе АТРазного цикла, сопровождаемого глобальными конформационными перестройками в миозиновой головке) к внутримолекулярным взаимодействиям с моторным доменом головки, которые, как предполагается, могут играть важную роль в функционировании головки в качестве молекулярного мотора .

Стоит отметить, что в ранее опубликованных работах необычная агрегация S1(A1) наблюдалась только при очень низкой ионной силе, т.е. в условиях, далеких от физиологических. Следует отметить, однако, что взаимодействие А1 с актином наблюдалось не только при очень низкой ионной силе, но, в некоторых случаях, и при довольно высокой ионной силе, близкой к ее физиологическому уровню [32, 61,71, 80] .

Поэтому нельзя исключить возможность того, что индуцируемое ATP внутримолекулярное взаимодействие N-конца A1 с моторным доменом S1 также может происходить и при физиологических значениях ионной силы .

Завершая этот раздел, можно заключить, что имеющиеся к настоящему времени немногочисленные данные о возможности взаимодействия N-концевого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки не позволяют пока оценить функциональное значение такого взаимодействия, если оно действительно имеет место. Можно предположить, однако, что подобное взаимодействие должно играть важную роль в процессе АТРазного цикла, когда головка миозина (а вместе с ней и N-концевой сегмент А1) отрываются от актина. Для проверки этого предположения требуются прямые экспериментальные доказательства такого взаимодействия, получение которых являлось целью наших исследований .

Возможные функции «существенных» легких цепей миозина в мышцах .

Какую роль выполняют «существенные» ЛЦ миозина в процессе мышечного сокращения? На сегодняшний день нет однозначного ответа на этот вопрос, но накоплено большое количество материалов, которые говорят в пользу того, что ELC миозина могут не только выполнять структурную роль, стабилизируя головки миозина в процессе АТРазного цикла, но и оказывать существенное влияние на сократительные свойства мышечных волокон за счет наличия разных изоформ ELC как в скелетной мускулатуре (А1 и А2), так и в сердце (ELCa и ELCv) .

Важность ELC в процессе эмбрионального развития была показана на трансгенных животных, у которых устранение сегмента ДНК длиной 1,5 кб, содержащего энхансерную последовательность ELC из генома мыши, приводило к преждевременной экспрессии ELC и разрушению мезодермы. Мышиные эмбрионы, гомозиготные по такой делеции, были меньше по размеру и имели задержку в развитии. На 7–8 день эмбрионального развития у них наблюдались серьезные нарушения в развитии мезодермы. В то же время для гетерозиготных эмбрионов, несущих только один ген ELC с укороченным энхансером, наблюдалось нормальное развитие. Эти результаты показывают, что преждевременная транскрипция гена ELC может нарушать функции мезодермальных клеток во время раннего эмбриогенеза. Поскольку миозин играет важную роль на всех стадиях цитокинеза, ранняя эмбриональная летальность, наблюдаемая у гомозиготных мутантных мышей, может быть вызвана дефектами в цитокинезе, что приводит к нарушению репликации клеток во время гаструляции [82]. Все это указывает на то, что ELC немышечного миозина играют немаловажную роль в процессе клеточного деления уже на стадии эмбриогенеза .

Значимая роль ELC миозина в работе скелетных мышц была подтверждена в экспериментах, проводимых с помощью искусственной системы подвижности (in vitro motility assay). Селективное удаление ELC из скелетного миозина курицы приводило к уменьшению на 50% силы, развиваемой головками миозина в изометрических условиях, тогда как удаление RLC не изменяло уровень силы. Удаление одной или обеих ЛЦ (ELC и RLC) заметно уменьшало скорость скольжения актиновых филаментов без существенной потери актин-активируемой АТРазной активности [83] .

О высокой функциональной значимости ELC миозина в работе сердечной мышцы может свидетельствовать наличие в них нескольких мутаций, ассоциированных с развитием различных типов кардиомиопатии – тяжелого наследственного заболевания сердца человека [25] .

Важную роль в процессе мышечного сокращения играют изоформы ELC (А1 и А2) .

В большинстве описанных выше работ авторами было показано, что в условиях низкой ионной силы с помощью своего дополнительного N-концевого сегмента А1 может связываться с актином в процессе АТРазного цикла. Следует отметить, однако, что это взаимодействие наблюдалось главным образом в растворах с довольно низкой ионной силой, но не наблюдалось при значениях ионной силы, приближенных к ее физиологическому уровню (~100–140 мМ) [84, 58]. С другой стороны, имеются многочисленные данные, указывающие на то, что взаимодействие А1 с актиновыми филаментами может происходить даже при довольно высокой ионной силе, близкой к ее физиологическим значениям. Так, например, сшивку A1 c актином наблюдали при физиологических значениях ионной силы [61]. В присутствии Ca2+ и 50 мM KCl между S1(A1) и S1(A2) сохранялась разница в связывании комплексов S1-Mg-AMP-PNP и S1Mg-ADP с актином в присутствии тропомиозина и тропонина, в то время как в отсутствие Ca2+ эта разница наблюдалась только в условиях низкой ионной силы [81]. В группе Sweeney было показано, что замена А1 на А2 в медленных мышечных волокнах кроликов приводит к двукратному увеличению максимальной скорости сокращения. Миозины, содержащие длинные изоформы ELC, демонстрировали более медленную кинетику образования актин-миозиновых мостиков, чем миозины с короткими изоформами ELC .

Скорость сокращения без нагрузки скинированных мышечных волокон зависела от соотношения изоформ ELC даже в условиях высокой ионной силы (120–180 мM) [85] .

Одно из самых прямых доказательств важной роли N-концевого сегмента удлиненной изоформы ELC в сокращении мышц было получено с использованием трансгенных мышей, у которых в миокарде синтезировалась мутантная форма ELC с удаленным N-концевым сегментом, включающим 43 N-концевых остатка (43ELC) [86] .

Напомним, что в сердце синтезируется только удлиненные изоформы ELC (ELCa и ELCv), подобные изоформе А1 скелетных мышц. Замена ELC в миокарде была неполной и соотношение эндогенных ELC к 43ELC было примерное таким же, как и соотношение А1 к А2 в быстрых скелетных мышцах. Сила сокращения мышечных волокон, полученных из сердечных мышц таких мышей, была существенно ниже, чем у контрольных волокон. Важно отметить, что данные эксперименты проводились в условиях высокой ионной силы (150 мМ). Интересно, что у таких мутантных мышей наблюдалась гипертрофия сердечной мышцы, которая не приводила, однако, к серьезным функциональным нарушениям работы сердца. Данные результаты авторы объясняют тем, что миозиновые головки с А1-подобной изоформой ELC в сердце за счет ее взаимодействия с актином генерируют за одни АТРазный цикл большую силу сокращения, чем головки с А2-подобной изоформой. Особенно важно то, что такое различие между свойствами головок миозина, содержащими разные формы ELC, имеет место при физиологических значениях ионной силы [86] .

Имеются и другие доказательства взаимодействия N-концевого сегмента А1 с актином в мышцах, полученные на трансгенных моделях животных. Так, в одной из работ авторы исследовали, может ли экспрессия N-концевого пептида сердечной ELC оказывать влияние на сократительные свойства сердечной мышцы. Получали трансгенных крыс, в геном которых вставляли сверхэкспрессирующие минигены, кодирующие в кардиомиоцитах 15 N-концевых аминокислот из ELCa или ELCv человека. Было показано, что экспрессия таких N-концевых пептидов сердечных ELC у трансгенных крыс оказывала заметное влияние на сократительные свойства изолированных перфузированных сердец. У таких трансгенных животных по сравнению с контрольной линией, в которой не экспрессировался дополнительный N-концевой пептид, повышалась скорость сокращения и расслабления сердечной мышцы; при этом развития гипертрофии не наблюдали [87] .

Итак, в мышце А1- и А2-подобные ELC по-разному влияют на процесс взаимодействия миозина с актином: А1 за счет своего N-концевого сегмента может в процессе АТРазного цикла образовывать дополнительный контакт головки миозина с актином, что позволяет ей генерировать большую силу в пересчете на потребляемую АТР, а миозин, содержащий А2, наоборот, может развивать более высокую скорость, но при этом сила сокращения ниже. В медленных волокнах скелетных мышц и в сердечной мышце встречается только удлинённая изоформа ELC (A1, ELCv, ELCa), в гладких мышцах – только короткая ELC (A2), а в быстрых волокнах скелетных мышц – обе изоформы, А1 и А2. Такое распределение изоформ ELC в мышечных волокнах кажется неслучайным. Сердечный миозин содержит только А1-подобные изоформы ELC, позволяющие генерировать большую силу сокращения, чтобы обеспечивать ток крови по сосудам. Гладким мышцам, выстилающим сосуды и кишечник, такая высокая сила сокращения не требуется, поэтому головки гладкомышечного миозина содержат укороченную изоформу ELC. Что же касается быстрых скелетных мышц, то они должны уметь осуществлять сокращения с различной скоростью и силой, поэтому за модуляцию этого процесса отвечают обе изоформы ELC, как А1, так и А2 .

Роль ELC миозина во взаимодействиях между моторным и регуляторным доменами миозиновой головки в процессе АТРазного цикла .

В этом разделе мы рассмотрим пока немногочисленные и зачастую весьма спорные данные о возможном участии ELC (а именно, ее С-концевой части, ассоциированной с регуляторным доменом миозиновой головки) во взаимодействиях между моторным и регуляторным доменами головки, которые, как предполагается, могут происходить в процессе АТРазного цикла .

Согласно современным представлениям, функционирование головки миозина в качестве молекулярного мотора обеспечивается поворотом на ~60° регуляторного домена относительно моторного домена. Регуляторный домен действует при этом как рычаг, длина которого определяет величину перемещения миозиновой головки вдоль актинового филамента. Удлинение или укорочение регуляторного домена за счет введения или удаления путем мутагенеза участков связывания легких цепей приводили соответственно к повышению или снижению эффективности перемещения актиновых филаментов иммобилизованными молекулами S1 в системе in vitro motility assay [1] .

Опираясь на структуру скелетномышечного S1 миозина курицы [21] (см. рис. 3), в 1996 г. Р. Миллиган предположил наличие дополнительных взаимодействий между тяжелой цепью моторного домена головки и ELC, ассоциированной с регуляторным доменом (помимо тех взаимодействий, которые обеспечивают связывание ELC с длинной

-спиралью регуляторного домена головки). Эти взаимодействия представлены на рис. 11 [88]. Аминокислотные остатки 90–96 в С-концевой части ELC (спираль Е на рис. 12) лежат в непосредственной близости от остатков 720–730 тяжелой цепи моторного домена .

Другая спираль ELC (спираль F, остатки 103–115) лежит вблизи N-концевого участка тяжелой цепи (остатки 21–31). Было высказано предположение, что такие контакты между моторным и регуляторным доменами S1 (точнее – между некоторыми участками моторного домена и С-концевой частью ELC в регуляторном домене) могут играть важную (если не определяющую) роль в молекулярном механизме мышечного сокращения [88] .

Эта линия исследований была продолжена в 1998 году, когда группе американских авторов удалось получить атомные структуры гладкомышечного S1, содержащего участок регуляторного домена и ELC, в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, имитирующих главные интермедиаты АТРазной реакции миозина – S1*–ATP и S1**– ADP–Pi, соответственно [89]. В этих комплексах авторам удалось обнаружить достаточно плотные контакты С-концевой области ELC с петлей моторного домена (“25/50 kDa loop” на рис. 12) около нуклеотид-связывающего сайта. Это взаимодействие коренным образом отличалось от контактов между моторным и регуляторным доменами S1, обнаруженных ранее в атомной структуре скелетномышечного S1, свободного от нуклеотидов [21]; оно имело место с противоположной стороны моторного домена (рис. 12) .

–  –  –

существенную легкую цепь приводило к заметному снижению скорости перемещения актиновых филаментов иммобилизованными головками миозина в искусственных системах актомиозиновой подвижности [89] .

Рис. 12. Ленточная диаграмма, показывающая два различных положения регуляторного домена (lеver arm) относительно моторного домена миозиновой головки: в скелетномышечном S1, свободном от нуклеотидов [21], и в гладкомышечном S1 (MDE, т.е. «моторный домен + ELC») в тройных комплексах S1-ADP-AlF4- (или S1-ADP-BeFx) [89]. Желтым цветом показан моторный домен, пурпурным – -спираль скелетного S1 [21], розовым – -спираль MDE. RLC скелетного S1 представлена красным цветом;

поскольку MDE утрачивает эту легкую цепь, на рисунке голубым цветом показано модельное предположение о ее положении. ELC в обоих случаях отображены темно синим цветом .

Таким образом, результаты описанных выше работ свидетельствуют о возможности взаимодействия между моторным и регуляторным доменами S1 (точнее – между моторным доменом и ELC, ассоциированной с регуляторным доменом), причем характер таких взаимодействий может коренным образом изменяться в процессе АТРазной реакции S1 .

К сожалению, авторам последней из этих работ [89] в силу ряда методических трудностей не удалось получить кристаллические структуры свободного от нуклеотидов S1, содержащего ELC. Именно поэтому им пришлось сравнивать полученные ими структуры гладкомышечного S1 в тройных комплексах S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx с полученной ранее структурой свободного от нуклеотидов S1 из скелетных мышц (рис. 3) .

Рис. 13. Диаграмма, отражающая участки взаимодействия (розовый цвет) ELC (синий цвет) и моторного домена (желтый цвет) в комплексе MDE-ADP-AlF4-. Участок «конвертера» показан белым цветом. Участки взаимодействия включают следующие сегменты: Met140–His147, Ser163–Asp170, Ala198–Lys204, Phe256–Tyr261 в моторном домене тяжелой цепи S1 и Asp96–Ile138 в ELC (включая F- и G-спирали ELC). В частности, отрицательно заряженная G-спираль ELC взаимодействует с положительно заряженной 25/50 kDa петлей моторного домена. Однако, исходя из приведенной структуры, подобное взаимодействие не может быть описано полностью, поскольку между Lys204 и Gln211 утрачены (не разрешены) 6 аминокислотных остатков [89] .

Интересные результаты были получены при изучении ориентации концевых участков ELC при различных конформационных состояниях S1 [77]. Авторами было показано, что в препаратах S1, содержащих ELC, флуоресцентно меченые по единственной SH-группе остатка Суs180 в С-концевой части цепи, С-концевой участок ELC заметно сильнее иммобилизован и упорядочен в присутствии АТР, чем в отсутствие нуклеотидов. При аналогичных исследованиях препарата S1, модифицированного по SH1группе остатка Cys70 7 в моторном домене, подобных изменений замечено не было, как и при использовании ADP или PPi вместо АТР. Эти результаты свидетельствуют о том, что связывание АТР с активным центром S1 оказывает значительное влияние на подвижность ELC – повидимому, за счет ее взаимодействия с моторным доменом миозиновой головки .

Кажется странным тот факт, что С-концевой участок ELC в S1 заметно сильнее иммобилизован и упорядочен в присутствии АТР, чем в отсутствие нуклеотидов, поскольку это не согласуется с высказанным ранее предположением Р. Миллигана о взаимодействие между тяжелой цепью моторного домена головки и С-концевым участком «существенной» легкой цепью в регуляторном домене S1 без нуклеотидов. Стоит отметить, что эти предположения основывались на результатах анализа кристаллической структуры S1. Недавно же были получены данные микроскопии высокого разрешения, свидетельствующие в пользу того, что регуляторный домен S1 в отсутствие нуклеотидов постоянно «сгибается» относительно моторного домена, то есть обладает достаточно высокой подвижностью [90] .

Таким образом, имеющиеся в литературе данные об атомной структуре S1 и ее изменениях, вызываемых моделированием определенных стадий АТРазной реакции, говорят в пользу того, что при повороте регуляторного домена происходит не только его сближение с моторным доменом, но и достаточно прочное взаимодействие между этими доменами (точнее – между моторным доменом и ELC, ассоциированной с регуляторным доменом) .

Дальнейшие исследования в этом направлении проводились в нашей лаборатории при изучении доменной структуры S1 и ее изменений, происходящих в стабильных тройных комплексах S1-ADP-Vi, S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, имитирующих главные интермедиаты АТРазной реакции Эти исследования проводились методом S1 .

дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами и подходами. Применение метода ДСК позволяет отчетливо регистрировать структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при образовании таких комплексов S1 с ADP и аналогами Эти перестройки выражались в резком увеличении Pi .

термостабильности S1 и кооперативности его тепловой денатурации [91] (рис. 14), а также в значительных изменениях его доменной структуры [91-93] .

Особый интерес представляет анализ методом ДСК доменной структуры миозиновой головки, поскольку именно междоменные взаимодействия индуцируют значительные внутримолекулярные перемещения в головке и играют ключевую роль в процессе трансформации энергии гидролиза АТР в механическую работу. Метод ДСК является одним из лучших подходов для выявления в мультидоменных белках структурных доменов как отдельных тепловых переходов на кривой теплопоглощения .

Такие домены, называемые калориметрическими доменами, можно выявлять при исследовании методом ДСК тепловой денатурации белка как области в молекуле белка, которые разворачиваются кооперативно и независимо друг от друга .

Подходы для изучения методом ДСК доменной структуры S1 неоднократно модифицировались в нашей лаборатории на протяжении многих лет. Последняя модификация была проведена относительно недавно, в 2010 году, когда был предложен новый калориметрический подход для анализа доменной структуры необратимо денатурирующих белков, применимый даже в том случае, когда пики отдельных калориметрических доменов перекрываются друг с другом [Markov et al., 2010]. С использованием этого подхода был пересмотрен механизм тепловой денатурации S1. В частности, было показано наличие в молекуле S1 не трех калориметрических доменов, как считалось ранее [91, 92], а двух таких доменов; при этом, однако, было установлено, что более термостабильный домен денатурирует в 2 стадии (тепловые переходы 2 и 3 на рис .

15А). Для идентификации этих доменов (т. е. для выявления их соответствия определенным участкам структуры S1) был применен целый ряд специальных подходов – таких, например, как сопоставление данных ДСК с температурными зависимостями собственной триптофановой флуоресценции S1 и инактивации его ATPазы. Хорошо известно, что все остатки триптофана сосредоточены только в моторном домене S1, поэтому следовало ожидать, что изменения флуоресцентных свойств S1 будут происходить в области температур, соответствующих денатурации именно моторного домена .

1 - S1 3 2 - S1-ADP 3 - S1-ADP-Vi 5 моль )

-1

–  –  –

Рис. 14. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (Cp) препаратов S1 из скелетных мышц кролика в отсутствие нуклеотидов (1), в присутствии ADP (2) и в тройных комплексах S1-ADP-Vi (3), S1-ADP-AlF4- (4) и S1-ADP-BeFx (5) [91]. Условия: 30 мM Hepes (pH 7,3), 1 мМ MgCl2, 1,5 мг/мл S1. Скорость нагрева 1 K/мин .

Оказалось, что необратимая тепловая денатурация S1 сопровождается сдвигом максимума спектра собственной триптофановой флуоресценции в более коротковолновую область; во всех случаях такое изменение спектра соответствовало изменению параметра A = I320/I365, т.е. отношения интенсивностей флуоресценции на соответствующих длинах волн. (Впервые такой параметр был введен для оценки нативного состояния актина [94, Сопоставление температурных зависимостей степеней завершенности трех 95]) .

калориметрических переходов с температурной зависимостью S1 (рис. 15А) нормализованного параметра А (степени завершенности перехода по параметру А) (рис .

15Б) показало, что температурные изменения параметра А происходят в области калориметрических переходов 2 и 3, а в области денатурации калориметрического домена 1 никаких изменений параметра А не наблюдается (рис. 16). Эти данные позволили идентифицировать более термостабильный калориметрический домен, включающий тепловые переходы 2 и 3, как моторный домен S1, а менее термостабильный калориметрический домен 1 – как регуляторный домен, не содержащий остатков триптофана [96] .

Сопоставляя данные ДСК, представленные на рисунках 14 и 15А, легко заметить, что в тройных комплексах S1 с ADP и аналогами Pi (рис. 14) почти отсутствует прирост теплопоглощения при 35–45оС, т.е. в том температурном диапазоне, в котором в отсутствие нуклеотидов плавится регуляторный домен S1 (рис. 15). Это значит, что в этих комплексах регуляторный домен S1 денатурирует где-то в другом температурном диапазоне .

–  –  –

к предположению о том, что в процессе АТРазной реакции регуляторный и моторный домены миозиновой головки не только сближаются, но и могут взаимодействовать друг с другом. Такое взаимодействие осуществляется, по-видимому, за счет достаточно прочных контактов между ELC, ассоциированной с регуляторным доменом, и определенными участками тяжелой цепи в моторном домене S1. Результатом этого взаимодействия является, видимо, значительное увеличение термостабильности не только моторного домена S1, но и регуляторного домена .

Предположение о том, что в процессе АТРазного цикла происходит взаимодействие регуляторного домена миозиновой головки (точнее – ассоциированной с ним ELC) с моторным доменом, несомненно требовало серьезных экспериментальных подтверждений. Необходимо было, в частности, провести идентификацию тепловых переходов на термограммах ДСК, чтобы точно выяснить, какой из них соответствует плавлению регуляторного домена S1 как в отсутствие нуклеотидов, так и в тройных комплексах с ADP и аналогами Pi. Следует отметить, что в описанных выше исследованиях такая идентификация проводилась лишь косвенным путем, основанном на том, что все остатки триптофана локализованы лишь в моторном домене S1, но отсутствуют в регуляторном домене (и, соответственно, в ассоциированной с ним ELC). .

Было бы гораздо интереснее напрямую получать информацию о тепловой денатурации самого регуляторного домена. Такую информацию можно получить, например, исследуя температурные зависимости флуоресценции метки, специфически присоединенной к единственной SH-группе ELC, ассоциированной с регуляторным доменом S1, и сопоставляя эти зависимости с данными ДСК о доменной структуре S1 как в отсутствие нуклеотидов, так и в тройных комплексах ADP и аналогами Pi. Именно это и составило одну из главных целей нашего исследования .

1.3. Применение метода Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) для структурно-функциональных исследований головки миозина В нашей работе для решения поставленных задач мы применяли метод Фёрстеровского резонансного переноса энергии (Frster Resonance Energy Transfer, FRET), который позволяет определять расстояния между двумя флуоресцентными метками (донором и акцептором энергии флуоресценции), присоединенными к аминокислотным остаткам в разных областях молекулы белка. В связи с этим представляется целесообразным рассмотреть здесь данные литературы о тех возможностях, которые предоставляет использование этого метода для структурно-функциональных исследований миозиновой головки, а именно – как для определения расстояний между разными участками головки, так и расстояний от этих участков до актина при различных функциональных состояниях актомиозинового комплекса .

В 80-х годах прошлого столетия метод FRET начал активно применяться для определения структуры миозинового мотора. На тот момент еще не был получен кристалл миозиновой головки, поэтому это было особенно популярным направлением. Многие исследователи, определяя этим методом внутримолекулярные расстояния между разными участками молекулы S1, пытались понять особенности ее структурной организации. Так, например, в 1980 году Marsh и Lowey впервые измерили расстояние от остатка Cys707 (SH1-группа) в тяжелой цепи S1 до остатка Cys180 в С-концевой части ELC, которое составило 4,0 нм. [97]. Для нас важно отметить, что в данной работе очень подробно описаны не только схемы самого эксперимента, но и дано подробное описание обработки результатов, полученных методом FRET. Авторы в своей работе использовали 1,5IAEDANS в качестве донора и 5-IAF в качестве акцептора. При изменении положения донора и акцептора (их меняли местами), получаемые дистанции не изменялись, что логично в условиях правильно поставленного и обработанного эксперимента. Добавление гуанидина-HCl в пробу приводило к полной денатурации белка; в результате расстояние между донором и акцептором увеличивалось, что приводило к резкому падению эффективности переноса энергии от донора к акцептору. Это свидетельствовало о том, что наблюдавшийся перенос энергии был безизлучательным, поэтому он очень сильно зависел от расстояния между донором и акцептором [97]. Интересно, что по данным кристаллической структуры S1 [21] расстояние между SH-группами остатков Cys707 в тяжелой цепи S1 и Cys180 в С-концевой части ELC составляет 3,6 нм, что вполне соответствует данным, полученным методом FRET задолго до открытия атомной структуры S1 .

Внутримолекулярный FRET использовали не только для измерения дистанций в свободной от нуклеотидов головке миозина, но и для S1, содержащего связанные нуклеотиды. В 1983 году Moss и Trentham измерили расстояние между меткой 1,5IAEDANS, присоединенной к Cys180 в С-концевой части ELC, и флуоресцентным аналогом ADP – TNP-ADP в активном центре АТРазы S1, которое составило 5,7 нм [98] .

По имеющимся уже на сегодняшний день данным кристаллических структур это расстояние составляет 4,9 нм для S1, свободного от нуклеотидов [21], и 4,3 нм для S1 в составе тройного комплекса S1-ADP-BeFx [89]. Позднее внутримолекулярный FRET использовали, чтобы определить расстояние от Cys180 в С-концевой части ELC до TNPADP в активном центре S1 не только в препарате S1-ADP, но и в тройных комплексах S1 с ADP и аналогами Pi [38]. Это расстояние в S1-ADP составило 5,5 нм, что очень хорошо согласовывалось с ранее опубликованными данными [98]. При образовании тройных комплексов S1-ADP-Vi, S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx это расстояние уменьшалось на 0,6 нм. Авторы также определили расстояния от Cys180 в ELC до остатка Lys83, расположенного в основании моторного домена S1, а также до остатка Lys553 в актинсвязывающем центре: они составили 2,5 нм и 5,0 нм, соответственно, и практически не изменялись при формировании тройных комплексов S1 с ADP и аналогами Pi [38] .

Логично, что дистанция между Cys180 в ELC и Lys83 в моторном домене S1 получилась довольно маленькой, поскольку остаток Lys83 располагается довольно близко к регуляторному домену S1, с которым связана С-концевая область ELC, в которой находится остаток Cys180 .

Большое количество работ посвящено исследованию с помощью метода FRET расстояний между головкой миозина и актином. Так, еще в 1979 году Takashi [99], используя донорно-акцепторную пару 1,5-IAEDANS – 5-IAF, в условиях высокой ионной силы (120 мМ KCl) определил расстояние между остатками Cys374 на актине и Cys707 в головке миозина, которое составило 6,0 нм. В 1983 году Hylary Trayer и Ian Trayer, используя донорно-акцепторную пару повторили данный 1,5-BrAEDANS–5-IAF, эксперимент при разных значениях ионной силы (от 10 до 200 мМ KCl). По их данным расстояние между Cys374 на актине и SH1-группой остатка Cys707 в S1 составляет около 5,0 нм. Но авторы отметили, что очень большое влияние на полученные данные может оказывать т.н. 2-фактор, описывающий взаимную ориентацию в пространстве донора и акцептора. Несмотря на то, что обычно величину этого фактора принимают равной 2/3, что соответствует беспорядочной ориентации доноров и акцепторов за счет вращательной диффузии, авторы показали, что в зависимости от величины 2 дистанция между метками на Cys374 актина и Cys707 в S1 может составлять от 3,9 до 6,7 нм [100] .

Расстояние между флуоресцентным аналогом АDP в нуклеотидADP) связывающем центре актина и 1,5-IAEDANS или 5-IAF, присоединенными к остатку Cys707 в S1, по данным FRET составило 4,9–5,3 нм [101]. Но стоит отметить, что для другой донорно-акцепторной пары (TNP-ADP – 1,5-IAEDANS) в этих же положениях на актине (нуклеотид-связывающий центр) и в головке миозина (Cys707) были получены дистанции более 6,0 нм. Расстояние между нуклеотид-связывающими центрами актина и миозина, измеренное для пары -ADP–TNP-ADP, также было больше 6,0 нм [102]. Такая достаточно большая дистанция (6,0 нм) свидетельствует в пользу того, что актинсвязывающий и АТРазный центры в миозиновой головке удалены друг от друга, что позднее, после получения атомной структуры миозиновой головки, полностью подтвердилось (см. рис. 3) .

Интересные данные получили методом FRET Ian Trayer с коллегами: они определили расстояние от единственного остатка цистеина в ELC миозина (Cys180) до остатка Cys374 на актине как в состоянии «сильного» связывания S1 с актином в отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP, (донорно-акцепторная пара 1,5BrAEDANS–5-IAF) так и в состоянии «слабого» связывания, характерного для связывания с актином комплекса М**-ADP-Pi в процессе АТРазного цикла актомиозина (см. рис. 4) .

При этом «слабое» связывание S1 с актином имитировали двумя разными путями: либо путем сшивки SH1- и SH2-групп остатков Cys707 и Cys697 в молекуле S1 pфенилендималеимидом (pPDM), либо при использовании регулируемых актиновых филаментов, содержащих тропомиозин и тропонин в отсутствие Ca2+. Было показано, что при низкой ионной силе (10 мМ KCl) в состоянии сильного связывания расстояние между Cys180 в ELC миозина и Cys374 на актине составляло около 6,0 нм, но при переходе в состояние слабого связывания эта дистанция резко уменьшалась и была меньше 2,8 нм [53, 103]. Эти данные свидетельствуют о том, что в состоянии слабого связывания S1 с актином в процессе АТРазного цикла С-концевая область ELC и, сооветственно, регуляторный домен миозиновой головки, с которым она связана, сильно сближаются с поверхностью актинового филамента, что и приводит к резкому уменьшению, с 6 нм до 3 нм, дистанции между этой областью ELC и актином .

В последнее время возможности использования метода FRET для структурнофункциональных исследований миозиновой головки значительно расширились благодаря появлению нового подхода – времяразрешенного FRET (Time-resolved fluorescence energy transfer, TR-FRET). Важным преимуществом этого подхода является то, что он позволяет быстро измерять расстояния между головкой миозина и актином непосредственно в процессе АТРазного цикла актомиозина, прямо при переходах головки из состояния слабого связывания с актином в состояние сильного связывания и наоборот. Недавно группой американских авторов TR-FRET был применен для сравнительного анализа связывания с актином двух изоформ S1 с разными ELC – S1(А1) и S1(А2) [104] .

Флуоресцентную метку (донор) присоединяли либо к С-концевой части ELC, общей для А1 и А2 (к Cys180 в А1 и к Cys136 в А2), либо к остатку Cys16 в N-концевом сегменте А1, введенному туда методом сайт-направленного мутагенеза (мутация А16С) после замены собственного остатка цистеина в А1 (Cys180) на аланин. В качестве акцептора использовали флуоресцентную метку, присоединенную к остатку Cys374 на актине. Было показано, что при слабом связывании S1 с актином расстояние от метки в С-концевой части ELC до актина не различается для S1(А1) и S1(А2) и составляет 9,6–9,7 нм, тогда как при переходе к сильному связыванию это расстояние заметно снижалось (на 1,7 нм) для S1(А1), но почти не изменялось для S1(А2). Если же измеряли расстояние между метками в актине и в N-концевом сегменте А1, то в состоянии сильного связывания оно было очень низким (2,9 нм), что свидетельствовало о непосредственном взаимодействии этого сегмента А1 с актином, но несколько увеличивалось (до 3,6 нм) при переходе к состоянию слабого связывания. Авторы предложили очень интересную интерпретацию полученных данных, суть которой в том, что при сильном связывании S1 с актиновым филаментом взаимодействие N-концевого сегмента А1 с соседним мономером актина в филаменте «подтягивает» регуляторный домен S1 ближе к актину, увеличивая таким образом угол его поворота относительно моторного домена и, соответственно, ту силу, которую развивает миозиновая головка при таком повороте [104] .

Сопоставляя данные о расстояниях между регуляторным доменом S1(А1) и актином, измеренные разными методами как для сильного, так и для слабого связывания S1 с актином, легко заметить существенную разницу между теми расстояниями, которые были измерены в ранних работах методом стационарного FRET [53] и теми, которые были определены методом TR-FRET [104], – и это несмотря на то, что в обоих случаях флуоресцентные метки (хотя и разные) были присоединены к одним и тем же остаткам в А1 (Cys180) и на актине (Cys374). Авторы последней работы объясняют это преимуществами метода TR-FRET, который позволяет измерять такие расстояния непосредственно в процессе АТРазного цикла, не прибегая к различным модификациям S1 или актина, имитирующим состояние слабого связывания S1 с актиновым филаментом .

Продолжая исследования в этом направлении, та же группа авторов совсем недавно применила метод TR-FRET для изучения тех изменений во взаимодействии головок миозина с актином, которые вызываются мутацией E56G в гене ELC из желудочков сердца человека (ELCv), ассоциированой с гипертрофической кардиомиопатией [105]. Три собственных остатка цистеина ELCv в положениях Сys67, Сys76 и Сys182 были заменены на остатки аланина, а Аla16 в N-концевом сегменте ELCv был заменен на цистеин. Такую с кардиомиопатической мутацией модифицировали малеимидной ELCv E56G флуоресцентной меткой (акцептором) по остатку Cys16, а в качестве донора использовали метку 1,5-IAEDANS, присоединенную к остатку Cys374 на актине. Было показано, что аминокислотная замена E56G не оказывала влияния на актин-активируемую АТРазу S1, на сродство S1 к актину в присутствии АТР и на структуру акто-миозинового комплекса в состоянии сильного связывания в отсутствие АТР, при котором расстояние от метки в Nконцевом сегменте ELCv до актина не изменялось и составляло 3,5–3,6 нм. Значительные изменения, вызываемые заменой E56G, были обнаружены методом TR-FRET лишь при слабом связывании S1 с актином в присутствии АТР: в этих условиях замена E56G заметно снижала расстояние между остатком Cys16 в ELCv и актином, от 5,2 до 4,2 нм .

Но самые интересные данные были получены при определении относительного количества молекул S1, находящихся в состояниях сильного и слабого связывания с актином в присутствии АТР, что является важным преимуществом метода TR-FRET .

Оказалось, что в этих условиях замена E56G в ELCv заметно (на 33%) повышает популяцию молекул S1, связанных с актином в состоянии сильного связывания, сдвигая равновесие между состояниями слабого и сильного связывания в процессе АТРазного цикла в сторону сильного связывания. Авторы предположили, что именно такой сдвиг в равновесии может приводить к развитию фенотипа с повышенной сократимостью сердца у людей с аминокислотной заменой E56G в ELCv миозина [105] .

Стоит отметить, что в этих работах были впервые определены дистанции от Nконцевого сегмента ELC миозина (остаток Сys16) до остатка Cys374 на актине в состояниях сильного и слабого связывания S1 с актином. Оказалось, что при переходе от состояния слабого связывания к состоянию сильного связывания это расстояние уменьшается от 3,6 нм до 2,9 нм в случае ELC (А1) миозина скелетных мышц [104] и от 5,2 нм до 3,6 нм в случае ELCv миозина сердечной мышцы [105] .

Таким образом, метод FRET активно применялся и применяется в настоящее время для изучения внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий в головке миозина и в актомиозиновом комплексе. Поскольку до сих пор еще не получены прямые экспериментальные доказательства высказанного ранее предположения о взаимодействии C-концевой части ELC с моторным доменом головки миозина в процессе АТРазного цикла, нам кажется логичным, что с помощью метода FRET можно получить больше информации о наличии такого взаимодействия. С помощью этого метода мы также планируем ответить на ряд вопросов о свойствах уникального дополнительного Nконцевого сегмента ELC (А1). В первую очередь нас интересует, каким образом этот сегмент взаимодействует с актином в процессе АТРазного цикла (а именно, какую роль в этом взаимодействии играют разные области этого сегмента) и что с ним происходит, когда головка миозина диссоциирует от актина в процессе АТРазного цикла. Для того, чтобы ответить на все эти вопросы, мы получили и использовали в своей работе целый набор рекомбинантных препаратов ELC (А1), несущих единственный остаток цистеина в различных положениях аминокислотной последовательности – как в С-концевой области, общей для А1 и А2, так и в дополнительном N-концевом сегменте А1 .

2. Материалы и методы исследования

2.1 Получение препаратов белков .

Получение рекомбинантных «существенных» легких цепей (LC1 или А1) в клетках E. Coli .

Кодирующая последовательность ELC (LC1 или А1) скелетномышечной ткани человека (194 а.о.) и молекулярно-генетические конструкции ELC, содержащие точечные замены T127C, S142C или E160C в векторах pQE60 были любезно предоставлены доктором Д.С. Ушаковым (King's College London, Лондон, Великобритания) .

На основании гена А1 миозина скелетных мышц человека с помощью сайтнаправленного мутагенеза с использованием пары перекрывающихся праймеров или мегапраймера были также получены молекулярно-генетические конструкции ELC, содержащие точечные замены V6C, A15C, S40C, A57C или S99C в векторах pMW172 .

Помимо этого, в этом же векторе был получен мутант А1, в котором остаток Cys был расположен практически на самом N-конце цепи (CysN), куда была введена дополнительная последовательность CGI сразу после двух N-концевых остатков (MetAla). Естественно, собственный остаток Cys180 в С-концевой части А1 был предварительно заменен на остаток Ala мутацией С180A во всех полученных молекулярно-генетических конструкциях. Олигонуклеотидные последовательности, которые использовали в работе для получения молекулярно-генетических конструкций ELC, содержащих точечные замены V6C, A15C, S40C, A57C или S99C, а также конструкт ELC с остатком цистеина на самом N-конце аминокислотной последовательности (CysN) в векторах pMW172 приведены в таблице 1. Все молекулярно-генетические конструкции ELC (как предоставленные доктором Д.С. Ушаковым, так и полученные впервые) с Cконца аминокислотной последовательности А1 содержали 6 остатков His, которые в дальнейшем позволяли очистить рекомбинантные белки с помощью аффинной хроматографии на колонке HisTrap HP .

Полученную с помощью ПЦР кодирующую последовательность, содержащую интересующую мутацию и вектор pMW172, подвергали действию эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI в течение 3 часов при 37C. За 20 минут до окончания рестриктазной реакции к вектору добавляли термочувствительную щелочную фосфатазу (FASTAP, Fermentas), после чего ферменты инактивировали инкубацией в течение 20 минут при 70C. Далее проводили лигазную реакцию, добавляя 10-кратный молярный избыток полученного фрагмента (вставки) относительно вектора. Реакцию проводили с использованием фермента T4 DNA Ligase («СибЭнзим-М») в течение ночи при 4C или в течение 1,5 часов при 20C; ферменты инактивировали нагреванием реакционной смеси при 65C в течение 20 мин. После этого проводили отбор клонов при помощи метода ПЦР-скрининга («screening»); «положительные» клоны (содержащие фрагмент нужного размера) выращивали в течение ночи в 5 мл среды Луриа-Бертани (LB) c добавлением ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение плазмиды проводили при помощи набора GeneJet Plasmid MiniPrep Kit (Fermentas) или набора Plasmid Miniprep («Евроген»). Корректность нуклеотидной последовательности и наличие исследуемых мутаций проверяли с помощью секвенирования в коммерческой организации «ООО Евроген» .

–  –  –

Рекомбинантные «существенные» легкие цепи A1 дикого типа и A1, содержащие точечные мутации, были экспрессированы в клетках E. coli штамма M15pREP4 в случае с векторами pQE60 или в клетках E. coli штамма С41 в случае с векторами pMW172 .

Трансформацию клеток проводили плазмидой pQE60 или pMW172, содержащей необходимую конструкцию, и затем высевали трансформантов на чашки со средой, содержащей ампициллин и дополнительно канамицин для плазмиды pQE60 в концентрации 100 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно. Далее, одиночную колонию переносили в 25 мл стерилизованной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина (только в случае с плазмидой pQE60), и оставляли на ночь на шейкере при 37oС и 170 об/мин. К 25 мл ночной культуры добавляли 1 л среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина (только в случае pQE60), и оставляли клетки расти на шейкере при 37oС до величины оптической плотности при 600 нм, равной часа). После этого к среде добавляли индуктор экспрессии 0,3–0,8 (~3 изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,7 мМ и продолжали экспрессию в течение 3 часов. Осадок клеток собирали центрифугированием в течение 60 мин при 4oC (центрифуга Eppendorf 5810R, 4500 g). Осадок ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 15 мМ имидазол и 300 мМ NaCl (рН 8,0), замораживали и хранили при –70оС до выделения легких цепей .

Выделение и очистка «существенных» легких цепей (LC1 или А1) .

Суспензию клеток размораживали, после чего клетки подвергали обработке ультразвуком в течение 6 мин (каждые 30 секунд делали перерыв на 30 секунд), затем проводили центрифугирование в течение 30 мин (центрифуга Eppendorf 5810R, 12000 g) .

Очистку легких цепей, несущих His6-tag на С-конце, проводили при помощи аффинной хроматографии на колонке HisTrap HP (Amersham Pharmacia) с использованием хроматографической системы ProStar 3250 (Varian). Колонку (V = 5 мл) уравновешивали 3 объемами 30 мМ Нереs-буфера, содержащего 300 мМ NaCI, 15 мМ имидазол, 0,1 мМ ингибитор протеаз (PMSF) и 1 мМ -меркаптоэтанол, при скорости 3 мл/мин. На колонку наносили белок (V = 35 мл), после чего колонку промывали в течение 5 мин от несвязавшихся белков. Элюцию проводили градиентом имидазола от 15 до 500 мМ на 30 мМ буфере Нереs, содержащем 300 мМ NaCI, собирая фракции по 3 мл. После хроматографии проводили SDS-электрофорез в ПААГ для анализа белкового состава фракций с колонки. Фракции, содержащие наибольшее количество легких цепей (А1), объединяли .

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, после чего проводили его концентрирование с помощью нитроцеллюлозного фильтра, центрифугируя белок 19 мин при 4500 об/мин и 4°С. Конечная концентрацией легких цепей составляла 13 мг/мл .

Полученный препарат замораживали и хранили при –20C .

Нативные «существенные» легкие цепи миозина из скелетных мышц кролика были получены ранее в нашей лаборатории [79] и хранились в лиофилизированном состоянии .

Разглицеринизация миозина .

Миозин, полученный ранее из скелетных мышц кролика, хранили при -20оС в 50% глицерине в присутствии 0,5 М KCl. К 2 мл раствора миозина (~20 мг/мл) добавляли 10кратный избыток холодной деионизованной воды. Образовавшиеся при пониженной ионной силе агрегаты миозина осаждали центрифугированием (15 минут при 5oС, центрифуга Beckman L, 70 000 g). Осадок гомогенизировали в 0,34 мл 2 М NaCl и в 0,68 мл буфера разглицеринизации (0,5 М NaCl, 20 мМ NaH2PO4, 0,5 мМ HCl, рН 7,2) до полного растворения осадка миозина. Затем опять добавляли 10-кратный избыток холодной деионизованной воды и снова центрифугировали 15 минут при тех же условиях .

После центрифугирования к осадку добавляли 0,34 мл 2 М NaCl и 2 мл буфера разглицеринизации и суспендировали до полного растворения осадка. Диализовали раствор миозина при 4С против буфера следующего состава: 20 мМ NaH2PO4, 0,12 M NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол (ДТТ) (pH 7,0), в результате чего формировались миозиновые филаменты .

Получение S1 [52] .

После диализа проводили переваривание миозиновых филаментов химотрипсином в той же среде при весовом соотношении -химотрипсин/миозин, равном 1/250. Протеолиз осуществляли 10 минут при постоянном перемешивании при температуре 25oC. Реакцию останавливали добавлением раствора PMSF (17,6 мг/мл) в этиловом спирте. Переваренный препарат миозина центрифугировали 1 час 15 мин (5оС, центрифуга Beckman L, 70 000 g). После центрифугирования препарат диализовали против буфера 50 мМ имидазол, 0,1 мМ ДТТ (рН 7,0) при 4С. После диализа суспензию центрифугировали 15 минут при тех же условиях для удаления нерастворимых продуктов переваривания .

Препарат S1 разделяли на изоформы S1(A1) и S1(A2) при помощи ионообменной хроматографии на колонке с SP-трисакрилом [53] .

Получение актина .

Актин из скелетных мышц кролика получали по стандартной методике [106] .

Мономеpный G-актин в G-буфере (2 мМ Трис-HCl, 2 мМ АТР и 0,2 мМ CaCl2) полимеpизовали в филаменты F-актина, добавляя к нему KCl и MgCl2 до конечных концентpаций 100 мМ и 2 мМ, cоответcтвенно .

Реассоциация S1 с «существенными» легкими цепями [107] .

Замещение собственных ELC в S1 на рекомбинантные ELC (LC1 или А1) проводили, инкубируя S1 с 8-кратным молярным избытком модифицированных A1. Перед началом реассоциации S1 и флуоресцентно меченые ELC диализовали в одном стакане против 50 мМ буфера имидазол-HCI, содержащего 5 мМ ДТТ (рН 7,0). Далее свободные ELC инкубировали 1,5 ч при 37С на водяной бане, после чего добавляли к ним S1 и MgATP до конечной концентрации 10 мМ и выдерживали еще на водяной бане в течение 30 минут .

Затем полученную смесь диализовали против 10 мМ буфера MOPS, содержащего 0,5 мМ ДТТ и 1 мМ PMSF (рН 7,0) .

Очистка S1, ELC, несущего рекомбинантные методом ионообменной хроматографии .

Очистку препарата S1 от избытка свободных ELC осуществляли методом катионообменной хроматографии на колонке с SP-трисакрилом с использованием хроматографической системы ProStar 3250 (Varian Inc.) [53]. Сначала носитель SPтрисакрил (~25 мл) промывали несколько раз 10 мМ буфером MOPS (рН 7,0), чтобы избавиться от этанола и соли. Перед началом хроматографии колонку (V=5,0 мл) промывали буфером MOPS (15 мл), затем наносили белок в том же буфере. Свободные ELC элюировались в свободном объеме со скоростью 2 мл/мин. Далее подключали градиент буфера MOPS, содержащего от 15 мМ до 200 мМ NaCl, для элюции с колонки S1. Перед использованием буфер очищали путем ультрафильтрации через фильтр Millipore c диаметром пор 0,22 мкм. Концентрацию белка во всех пробирках определяли спектрофотометрически (nanophotometer IMPLEN P330), после чего фракции, содержащие белок, анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом Na (SDS). Фракции, содержащие очищенный S1, объединяли и диализовали в течение ночи при 4С против буфера 30 мМ Hepes (pH 7,3), содержащего 2 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI .

Формирование тройных комплексов S1 с АDР и аналогами Pi .

Препараты S1 (как немодифированного S1, так и S1, меченого 1,5-IAEDANS) в буфере 30 мМ Hepes-NaOH (pH 7,3), содержавшем 2 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl, предназначенные для измерений флуоресценции, имели конечную концентрацию белка 0,15–0,2 мг/мл. Для получения тройных комплексов S1 с ADP и фторидом бериллия (S1ADP-BeFx) или фторидом алюминия (S1-ADP-AlF4-) к препаратам S1 добавляли ADP до конечной концентрации 0,7 мМ и NaF до конечной концентрации 5 мМ, после чего раствор выдерживали 10 минут при комнатной температуре, а затем добавляли

–  –  –

2.2. Методы модификации различных белков .

Модификация SH1-группы остатка Cys707 в S1 и единственного остатка Cys изолированных ЕСL флуоресцентным красителем .

модифицировали флуоресцентной меткой по наиболее S1 1,5-IAEDANS реакционной SH1-группе остатка Cys707 в тяжелой цепи S1 при эквимолярном отношении белка и реагента (10 мкМ) в течение 24 ч при 0°С. Модификацию препарата S1 по SH1-группе 5-йодацетомид-флуоресцеином (IAF) проводили аналогичным образом [108]. Степень модификации SH1-группы оценивали по степени ингибирования NH4+ЭДТА-АТРазной активности S1 и по увеличению Ca2+-АТРазной активности S1, измеряемой в присутствии 0,5 M KCl [109]. Степень модификации SH-группы остатка Суs707 в S1 составляла более 95% .

ЕLС в 10 мМ NaH2PO4 буфере, содержащем 100 мМ NaCl, (рН 7,0) модифицировали 1,5-IAEDANS по SH-группе единственного остатка цистеина в различных положениях аминокислотной последовательности – как в С-концевой части ELС, общей для А1 и А2 (Cys180, Cys160, Cys142, Cys127, Cys99 и Cys57), так и в Nконцевом сегменте А1 и Перед модификацией (Cys40, Cys15, Cys6 CysN) .

рекомбинантные ELС инкубировали с ДТТ в эквимолярном соотношении в течение 20 минут на шейкере при 4С для того, чтобы восстановить все SH-группы ELС. После этого проводили модификацию ЕLС 5-кратным молярным избытком 1,5-IAEDANS, инкубируя пробу при 4C в течение 4 ч в условиях постоянного перемешивания. Далее модифицированные ЕLС ставили на ночной диализ в 50 мМ буфере имидазол-HCl, содержащем 100 мМ NaCl и 5 мМ ДТТ (рН 7,0) [77] .

Полученный препарат ЕLС центрифугировали 15 мин при 5С (центрифуга Концентрацию ЕLС в супернатанте определяли Eppendorf 5804R, 13000 g) .

спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции А1% при 280 нм, равный 2,0 см-1. Количество метки, связанной с легкими цепями, ориентировочно оценивали по интенсивности ее флуоресценции, сопоставляя флуоресценцию связанной метки с флуоресценцией раствора свободной метки известной концентрации, и спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции для 1,5IAEDANS, равный 1,03 моль-1 см-1 при 280 нм и 5,7 моль-1 см-1 при 337 нм. Степень модификации SH-группы остатка Суs в легких цепях составляла более 85% .

Модификация актина флуоресцентной меткой .

Перед модификацией сухую метку 1,5-IAEDANS растворяли в G-буфере (состав без меркаптоэтанола). G-Актин в G-буфере модифицировали 1,5-IAEDANS по наиболее реакционной SH-группе остатка Cys374 при отношении белка и реагента 1:10 в течение 5 ч при при постоянном перемешивании. Далее полученный препарат 4°С модифицированного актина концентрировали в G-буфере с помощью концентраторов Amicon с размером пор на 10 кДа, избавляясь при этом от избытка метки. Степень модификации SH-группы остатка Суs374 в актине составляла около 80% .

2.3. Флуоресцентные методы анализа исследуемых препаратов .

Исследование температурных зависимостей флуоресценции S1 .

Исследование температурных зависимостей параметров собственной триптофановой флуоресценции S1 и флуоресценции метки 1,5-IAEDANS, специфически присоединенной к SH-группе единственного остатка цистеина в C-концевой части ELC (Cys180, Cys160, Cys142, Cys127, Cys99 или Cys57), ассоциированной с регуляторным доменом S1, проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком. Исследования проводили при концентрации белка 0,15–0,2 мг/мл в буфере 30 мМ Hepes, содержащем 2 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI. Длина волны возбуждения была равна 297 нм для регистрации триптофановой флуоресценции и 365 нм для флуоресценции 1,5-IAEDANS (ширина щели 5 нм). Спектры флуоресценции для остатков триптофана записывали в диапазоне от 310 нм до 450 нм, для 1,5-IAEDANS – от 385 нм до 600 нм (ширина щели 2,5 нм) .

Температурные изменения флуоресцентных свойств регистрировали следующим образом .

Образцы белков прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин и регистрировали интенсивность флуоресценции на двух длинах волн: для триптофановой флуоресценции – 320 нм и 365 нм, для 1,5-IAEDANS – 450 нм и 535 нм. Соотношение интенсивностей, измеренных при меньшей и при большей длинах волн (т.н. «параметр А» в случае триптофановой флуоресценции или «псевдо-параметр А» в случае флуоресценции меток, обозначаемый нами также как отражает положение спектра «параметр L») флуоресценции, а температурная зависимость этого параметра позволяет оценить смещение спектра, вызываемое изменением окружения флуорофоров в процессе тепловой денатурации белка и отражающее денатурацию тех участков его молекулы, в которых находятся флуорофоры (остатки триптофана или флуоресцентные метки, специфически присоединенные к определенным SH-группам) .

Исследование температурных зависимостей флуоресценции и светорассеяния S1 в комплексе с B-кристаллином .

Исследование температурных зависимостей параметров собственной триптофановой флуоресценции S1 и флуоресценции метки 1,5-IAEDANS, специфически присоединенной к SH-группе остатка Cys180 в ELC или к Cys707 моторного домена S1, в комплексе с B-кристаллином (малым белком теплого шока HspB5) проводили так же, как для аналогичных препаратов в отсутствие HspB5. Температурные зависимости агрегации S1 как в отсутствие, так и в присутствии HspB5, регистрировали по приросту светорассеяния, которое измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком. Длины волн возбуждения и эмиссии были равны 350 и 353 нм соответственно (ширина щелей 5 и 2,5 нм). Препарат HspB5 был любезно предоставлен с.н.с., к.б.н. Н.Н. Случанко .

Ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET) .

В основе метода Ферстеровского переноса энергии (Frster resonance energy transfer, FRET) или флуоресцентного резонансного переноса энергии лежит переноса энергии между двумя хромофорами, который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. В процессе такого переноса наблюдается тушение флуоресценции донора и появляется более длинноволновая флуоресценция акцептора .

Все исследования методом FRET проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian). Измерения проводили при 25C в 50 мМ буфере Tрис-HCl (pH 7,5), содержащем 2 мМ MgCl2, при концентрации белка 0,025 мг/мл [97]. Спектры излучения донора (AEDANS), присоединенного к ELC (A1), регистрировали в диапазоне от 360 нм до 630 нм (ширина щели 2,5 нм) при длине волны возбуждения 337 нм (ширина щели 5 нм) .

Эффективность передачи энергии (E) определялась по уменьшению флуоресценции донора (Fd) в присутствии акцептора (Fda) [71]. Fd и Fda рассчитывали, соответственно. как площадь под спектрами излучения донора в отсутствие или в присутствии акцептора (TNP-ADP или 5-IAF). Спектры доноров были скорректированы для неспецифического связывания TNP-ADP с S1 (см. подписи к рисункам 25 и 35 в разделе «Результаты и их обсуждение) [38, 110]. Дистанции между донором и акцептором флуоресценции рассчитывали как описано в работе [111] .

Вкратце, эффективность переноса энергии между донором и акцептором зависит от расстояния между хромофорами (R), что позволяет измерять дистанцию как между двумя молекулами, так и между метками в одной макромолекуле. Эффективность тушения флуоресценции донора убывает как R-6 с увеличением расстояния между метками.

Для расчета эффективности переноса энергии между донором и акцептором используется следующая формула:

E = 1–(Fda/Fd), где Fda и Fd – квантовый выход донора в присутствии и в отсутствие акцептора, соответственно.

Расстояние в донорно-акцепторной паре выражается следующим образом:

R= (E-1 – 1)(1/6) R0, где R0 – Ферстеровский радиус, при котором эффективность переноса энергии между донором и акцептором составляет 50% от максимума .

Одним из самых сложных этапов в обработке данных FRET является расчет

Ферстеровского радиуса следующим образом:

R0 = ((9ln10/1282 Nа)2Dn-4J)(1/6), где Nа – число Авогадро, 2 – фактор, описывающий взаимную ориентацию в пространстве дипольных моментов переходов донора и акцептора, D – квантовый выход донора в отсутствие акцептора, n – показатель преломления среды, а J – интеграл перекрытия, отражающий степень перекрывания спектров возбуждения донора и излучения акцептора. Как и в большинстве работ, для расчета D мы использовали хинин бисульфат, для которого известно, что его квантовый выход равен 0,7 [111]. Фактор 2 принимали равным 2/3 [97] .

2.4. Температурные методы исследования структуры S1 .

S1 Исследование тепловой денатурации методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) .

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном сканирующем адиабатическом микрокалориметре ДАСМ-4М биологического (Институт приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,48 мл. Для получения кривых теплопоглощения препарат S1 (конечная концентрация 1 мг/мл) в буфере 30 мM Hepes-КOH, рН 7,3, содержавшем 2 мM MgCl2 и 100 мМ NaCl, помещали в ячейку прибора и прогревали со скоростью 1oC в минуту с 10 до 80С при постоянном давлении 2,2 атм. Контрольную ячейку сравнения заполняли тем же буфером, не содержащим белка. После охлаждения ячеек до 10°С белок подвергали повторному прогреву при тех же условиях. Тепловая денатурация S1 была полностью необратимой. Из каждой полученной кривой теплопоглощения белка вычитали соответствующую кривую повторного прогрева. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения «Origin 1.16» и «Origin 7.0» .

Динамическое светорассеяние (DLS) .

Измерения динамического светорассеяния проводили на приборе Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США), оборудованном регулятором температуры, как описывалось ранее [96]. Образец облучали светом лазера при длине волны 633 нм и рассеянный свет собирали под углом 90o. Данные собирали и анализировали при помощи мультифункционального коррелятора Photocor-FC в режиме реального времени. Анализ корреляционных функций выполняли при помощи программы DynaLS software (Alango, Израиль). Температурные зависимости агрегации S1 исследовали, измеряя прирост среднего гидродинамического радиуса частиц (Rh) при нагревании препаратов S1 (1 мг/мл) с постоянной скоростью 1°C/мин в среде, содержащей 30 мМ Hepes-KOH (pH 7,3) и 2 мМ MgCl2. Кинетику агрегации S1 изучали в тех же условиях, измеряя прирост Rh в процессе инкубации образцов S1 при постоянной температуре: при 35°C для S1 в отсутствие нуклеотидов, при 37°C для S1-ADP, или при 45°C для S1 в тройных комплексах S1-ADP-BeFx или S1-ADP-AlF4 .

Тепловая агрегация S1(A1) и S1(A2) .

Температурные зависимости агрегации изоформ S1 регистрировали по приросту кажущейся оптической плотности при 350 нм. Измерения проводили на спектрофотометре оснащенном температурной приставкой Cary-100 (Varian Inc.), Biomelt c термостатируемым кюветодержателем. Образцы S1 (1 мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1°C/мин от 25°C до 65°C. Измерения проводили в буфере 30 мМ Hepes-KOH (pH 7,3), содержащем 2 мМ MgCl2 .

Тепловую агрегацию S1(A1) и S1(A2) исследовали также путем измерения температурных зависимостей их осаждения. Этот подход основан на том, что необратимая тепловая денатурация S1 сопровождается его агрегацией, которая может быть определена значительным увеличением либо кажущейся оптической плотности, либо светорассеяния [92, 96, 112]. S1(A1) или S1(A2) (0,5 мг/мл) в отсутствие нуклеотидов или в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 прогревали с постоянной скоростью 1°C/мин в среде, содержащей 30 мМ Hepes-KOH (pH 7,3) и 2 мМ MgCl2, и агрегацию S1 регистрировали по приросту интенсивности светорассеяния при 350 нм на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian). В процессе нагревания из образца извлекали аликвоты по 100 мкл, охлаждали их и подвергали ультрацентрифугированию в течение 20 мин при 140,000 g на ультрацентрифуге с воздушным приводом (Beckman airfuge, Beckman Instruments Inc., USA). Белковый состав в супернатантах и осадках анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS [113, 114]. Количественный анализ белковых полос проводили путем денситометрии гелей с использованием сканера Astra 6700 (UMAX), и сканированные изображения анализировали, используя пакет программного обеспечения ImageJ 1.45s (Scion Corp., Frederick, MD, США) .

В результате этих экспериментов получали температурные зависимости содержания тяжелых и легких цепей S1 в супернатантах, и как следствие – температурные зависимости диссоциации ELC от тяжелой цепи S1 как в отсутствие нуклеотидов, так и в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 .

2.5. Другие аналитические методы исследования белков .

Определение концентрации белка .

–  –  –

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS .

Белковый состав проб анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS в камерах Mini-Protean 3 Сell (Bio-Rad) по методу Лэммли [113, 114] в 15% разделяющем геле при постоянном напряжении 200 В. Полимеризацию геля инициировали добавлением ТЕМЕД и ПСА. Толщина геля составляла 0,75 мм. При приготовлении проб к раствору белка добавляли 1/4 объема 4-х кратного буфера для образцов (0,25 М Tris-HCl, pH 6,8, 8% SDS, 40% глицерин, 0,004% бромфеноловый синий, 5% -меркаптоэтанол), а затем инкубировали в течение 5–10 мин при 98C. В качестве катодного буфера использовали 0,192 М глицин-Tris, pH 8,6, 0,1% SDS, а в качестве анодного – 0,25 М Tris-HCl, pH 8,6. После окончания электрофореза гели помещали в раствор уксусной кислоты (5–15%) и инкубировали в течение 5–10 мин для фиксации белков в геле. После этого гели окрашивали раствором Кумасси G-250 (0,3% Кумасси на 40% изопропаноле и 10% уксусной кислоте) при перемешивании на шейкере в течение 15–20 мин, а затем избыток красителя отмывали в кипящей дистиллированной воде .

Определение АТРазной активности S1 .

АТРазную активность S1 определяли по изменению содержания Рi в пробе [115] .

Пробы объемом 0,5 мл содержали, кроме S1 (конечная концентрация 0,04 мг/мл), следующие реактивы: для NH4+-ЭДТА-АТРазы – 25 мМ трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ ЭДТА и 0,5 М NH4Cl; для Са2+-АТРазы, измеряемой в присутствии KCI – 25 мМ трис-НСl (рН 7,5), 5 мМ СаСl2 и 0,5 М KCI. Реакцию инициировали добавлением АТР до конечной концентрации 1 мМ. Пробы инкубировали 10 мин для Са2+-АТРазы и 5 мин для NH4+ЭДТА-АТРазы при 25оС. Затем реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 2,1% HClO4 .

Далее пробы центрифугировали в течение 3 мин при 5000 g. По 0,3 мл полученных супернатантов добавляли к 0,47 мл 5,4 М натрий-ацетатного буфера (рН 4,0), содержащего 0,5% CuSO4·5H2O, и 0,38 мл свежеприготовленной смеси (1:1) 5%-го водного раствора молибдата аммония и 5% водного раствора Na2SO3, содержащего 0,2% метола. Пробы инкубировали 40 мин при 25оС. Развивающуюся синюю окраску регистрировали при длине волны 860 нм на спектрофотометре Cary 100 (Varian) .

3. Результаты и их обсуждение В соответствии с поставленными задачами результаты проведенного исследования представлены в виде двух больших разделов. Один из них (раздел 3.1) посвящен поиску подтверждений высказанной ранее гипотезы о том, что в процессе АTPазной реакции происходит взаимодействие между двумя главными доменами миозиновой головки – моторным и регуляторным, в котором ключевую роль играет связанная с регуляторным доменом С-концевая часть ELC, общая для двух ее изоформ – А1 и А2. В другом разделе (раздел 3.2) рассматриваются особенности функционирования N-концевого сегмента А1, отсутствующего у А2, а именно – особенности связывания этого сегмента с актином и возможность его взаимодействия с моторным доменом миозиновой головки в процессе АТРазного цикла .

3.1. Роль C-конецевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом миозиновой головки, во взаимодействии между моторным и регуляторным доменами головки в процессе АТРазного цикла .

Тепловая денатурация S1 в составе тройных комплексов S1-ADP-AlF4- и S1ADP-BeFx .

Перед тем, как перейти к основным результатам работы, представленным в данном разделе, стоит отметить, что в одной из предыдущих работ был применен метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для подробного сравнительного анализа тепловой денатурации и доменной структуры двух изоформ S1, содержащих различные ELC (A1 и A2) в состоянии без нуклеотидов [96]. Авторы обнаружили два калориметрических домена в молекуле S1, где более термостабильный домен денатурировал в два этапа. Некоторая разница между двумя изоформами S1 по данным ДСК была обнаружена только при тепловой денатурации наименее термостабильного домена в температурном диапазоне 35–45C, что может говорить о том, что этот калориметрический домен соответствует плавлению регуляторного домена S1, с которым связаны ELC (А1 или А2) .

В дальнейших исследованиях применялись специальные подходы (описанные в обзоре литературы) для идентификации этих калориметрических доменов, чтобы понять, какие из них соответствуют структурным доменам молекулы S1. С этой целью измеряли температурные зависимости параметров триптофановой флуоресценции S1 (напомним, что все остатки Trp, располагаются только в моторном домене S1) и сопоставляли их с данными ДСК. С помощью этого подхода на кривых ДСК более термостабильный калориметрический домен был идентифицирован как моторный домен S1, поскольку

–  –  –

калориметрический домен 2 отражает тепловую денатурацию моторного домена S1, и высказано предположение, что менее термостабильный калориметрический домен 1 соответствует регуляторному домену S1, не содержащему остатков триптофана .

–  –  –

вывод, что образование комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 резко увеличивает термостабильность теплового перехода 1, сдвигая этот переход на 10–12 C в направлении более высоких температур .

Таблица 2. Основные параметры, полученные из данных ДСК для каждого теплового перехода S1 в отсутствие нуклеотидов и в комплексах S1-ADP-BeFx или S1ADP-AlF4- (Hcal, Ea, T* и T0 .

5), а также из данных температурных изменений нормализованного параметра A (T0.5) .

–  –  –

переход 2 1210 670 330.6 56.5 55.8 Значения Hcal, Ea и T* были рассчитаны, как описано в статье [96]. Относительная погрешность значений калориметрической энтальпии Hcal не превышала ± 10%. Ошибка рассчитанных значений энергии активации Ea и T* составляла ± 40 кДж/моль и ± 0,4 К, соответственно .

Значения T0.5 для каждого калориметрического перехода и для параметра A были получены из данных, представленных на рис. 15 и 17. Абсолютная погрешность данных значений T0.5 не превышала ± 0,5C .

Данные для S1 в отсутствие нуклеотидов взяты из статьи [96] .

Принимая во внимание тот факт, что этот переход не сопровождается изменениями триптофановой флуоресценции (рис. 17), можно предположить, что он может соответствовать тепловой денатурации регуляторного домена S1, который не содержит остатков триптофана. Если это так, то приведенные выше результаты могут указывать на то, что при формировании тройных комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- происходит довольно плотное взаимодействием между двумя основными структурными доменами молекулы S1, регуляторным доменом и моторным доменом, и это взаимодействие приводит к значительному повышению термостабильности регуляторного домена. В пользу этого предположения может свидетельствовать тот факт, что для теплового перехода 1 в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- по сравнению с S1 в отсутствие нуклеотидов наблюдается существенное увеличение энергии активации Ea (таблица 2), которое может отражать увеличение числа связей в регуляторном домене, которые стабилизируют его. Однако следует отметить, что это предположение основано на косвенных данных, поскольку соответствие теплового перехода 1 регуляторному домену S1 выводится только из того факта, что этот домен не содержит остатков триптофана .

Чтобы быть уверенными, что тепловой переход 1, стабильность которого сильно возрастает при образовании комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4-, действительно соответствует тепловой денатурации регуляторного домена S1, было бы гораздо лучше иметь прямые данные, т. е. получить информацию о разворачивании регуляторного домена непосредственно с этого домена .

Для этой цели мы получали рекомбинантные ELC (LC1 или А1), которые имели единственный остаток цистеина в различных положениях в С-концевой части молекулы ELC. Такие ELC модифицировали флуоресцентной меткой по единственному остатку цистеина, после чего заменяли в молекуле S1 собственные ELC на модифицированные рекомбинантные и исследовали температурные изменения параметров ELC флуоресценции этих рекомбинантных ELC, связанных с регуляторным доменом S1, которые отражали процесс денатурации этого домена. Затем полученные данные сравнивали с соответствующими данными ДСК и с данными температурных изменений флуоресценции триптофана, которые отражали тепловую денатурацию моторного домена S1 .

Сравнение свойств рекомбинантных ELC дикого типа со свойствами ELC, выделенных из миозина скелетных мышц кролика .

Используемые в данной работе рекомбинантные ELC (А1) содержали на С-конце 6 остатков гистидина (His-tag) для удобства их получения. Мы не исключали, что присутствие His-tag может оказывать влияние на свойства флуоресцентно меченной ELC, связанной с регуляторным доменом S1. Чтобы это проверить, в первую очередь мы сравнили температурные зависимости флуоресценции рекомбинантных ELC дикого типа, связанных с тяжелой цепью S1, с такими зависимостями ELC, выделенных ранее из миозина скелетных мышц кролика. Оба этих вида ELC содержали один единственный остаток цистеина (Cys180) вблизи C-конца и были модифицированы по этому остатку флуоресцентной меткой 1,5-IAEDANS в одинаковых условиях, после чего вставлены в S1 .

–  –  –

Температурные изменения флуоресценции меченых рекомбинантных ELC, связанных с регуляторным доменом S1 в отсутствие нуклеотидов .

В нашей работе мы использовали несколько рекомбинантных препаратов ELC, каждый из которых содержал единственный остаток цистеина в разных положениях ее Сконцевой последовательности (Cys99, Cys127, Cys142, Cys160 или Cys180). Эти остатки Cys были модифицировали флуоресцентной меткой 1,5-IAEDANS, после чего в S1 собственные ELC заменяли на модифицированные. До экспериментов на комплексах S1ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- мы изучали температурные зависимости изменения параметров флуоресценции этих рекомбинантных ELC как в свободном состоянии, так и связанных с регуляторным доменом S1, свободного от нуклеотидов. В препаратах изолированных ELC мы не наблюдали никаких изменений флуоресцентного параметра L при нагревании (данные не показаны). Температурные изменения флуоресценции ELC, связанных с регуляторным доменом свободного от нуклеотидов S1 (параметр L), в сравнении с изменениями триптофановой флуоресценции (параметр А), которые отражают тепловую денатурацию моторного домена S1, представлены на рис. 19. Значения T0.5 и d, полученные в результате анализа температурных изменений параметров A и L, приведены в таблице 3 .

Степень завершенности перехода

–  –  –

0,5 0,5 0,0 0,0

–  –  –

Рис. 19. Температурные зависимости флуоресценции рекомбинантных ELC, связанных с регуляторным доменом S1 (красные кружки), и остатков триптофана S1 (синие кружки) полученные для S1 в отсутствие нуклеотидов. Флуоресцентно меченые остатки Cys в ELC: Cys99 (A), Cys142 (Б), Cys127 (В) и Cys160 (Г). Изменения флуоресценции выражали с помощью специальных параметров L (для меченных AEDANS остатков Cys в ELC) и A (для остатков триптофана в S1), рассчитанных, как описано в разделе «Материалы и методы». Красные и синие сплошные линии представляют результаты анализа данных, обработанные с помощью сигмоидальной функции (Boltzman) для метки на ELC и триптофанов, соответственно .

Результаты, представленные на рис. 19 и в таблице 3, показывают, что для большинства мутантов ELC изменения параметра L происходят при несколько более низких температурах, чем изменения параметра A. В большинстве случаев, за исключением мутанта ELC Cys99, значение температуры полу-перехода (T0.5) для параметра L на 1–2C ниже, чем для параметра A (таблица 3) .

Следует также отметить, что во всех случаях наклон кривой для параметра L более пологий, чем для параметра A (рис. 19); поэтому значения d для параметра L значительно превышают эти значения для параметра A (таблица 3). Эти различия в значениях параметра d в основном связаны с различиями в температурах, при которых начинают меняться флуоресцентные параметры: параметр L начинает повышаться при более низкой температуре (~37–40 C), чем параметр A (~45C) (рис. 19) .

Таблица 3. Значения температуры полу-перехода (T0 .

5) и параметра d, отражающего наклон кривой температурной зависимости флуоресценции в точке полуперехода, полученные при анализе температурных зависимостей триптофановой флуоресценции (параметр А) и флуоресценции меченных AEDANS ELC (параметр L) для S1 в отсутствие нуклеотидов (рис. 19) .

–  –  –

Абсолютная погрешность значений T0.5 не превышала ± 0,5 C для параметра A и ± 1,0 C для параметра L. Абсолютная погрешность приведенных значений параметра d не превышала ± 0,1 для параметра A и ± 0,25 для параметра L .

В то же время заметных изменений параметра L не наблюдалось при 40C, т.е. при той температуре, при которой была предсказана тепловая денатурация регуляторного домена в свободном от нуклеотидов S1 [96]. Эти результаты наводят на мысль о том, что тепловая денатурация регуляторного домена S1, несущего ELC, является довольно сложным процессом. Например, необычное поведение параметра L (рис. 19) могло бы быть вызвано агрегацией белка, которая обычно сопровождает тепловую денатурацию S1 [96, 112, 118]. Чтобы проверить такую возможность, мы попытались отделить процесс тепловой денатурации S1 от процесса его агрегации, используя для этой цели малый белок теплового шока HspB5 (B-кристаллин) .

S1 Температурные зависимости флуоресценции и светорассеяния в присутствии малого белка теплового шока HspB5 .

Ранее было показано, что малый белок теплового шока HspB1 (Hsp27) эффективно предотвращает индуцированную нагреванием агрегацию S1, но при этом не влияет на тепловую денатурацию S1, измеряемую методом ДСК [112]. В нашей работе мы использовали другой малый белок теплового шока, HspB5 (B-кристаллин), чтобы подавить агрегацию вызванную его тепловой денатурацией. Мы изучили S1, температурные зависимости агрегации S1 путем измерения кажущейся оптической плотности или светорассеяния белка и сравнили их с температурными зависимостями флуоресцентного параметра L, полученными в отсутствие и в присутствии HspB5 .

Результаты свидетельствуют о том, что HspB5 эффективно предотвращает тепловую агрегацию S1, смещая кривую агрегации на ~ 20C в сторону более высоких температур (рис. 20А), вследствие чего S1 начинает агрегировать в присутствии HspB5 при гораздо более высоких температурах (выше 60C), то есть в условиях, когда тепловая денатурация S1 уже завершена. Напротив, мы не наблюдали заметного влияния HspB5 на температурные зависимости флуоресцентного параметра L (рис. 20Б,В) .

В этом случае мы не смогли проанализировать триптофановую флуоресценцию S1, поскольку HspB5 также содержит два остатка триптофана [119]. Поэтому мы проанализировали температурные зависимости параметра L для флуоресцентной метки (IAEDANS), специально присоединенной к SH1-группе остатка Cys707 в моторном домене тяжелой цепи S1. Эти зависимости, полученные в отсутствие или в присутствии HspB5 (рис. 20Б), были очень схожи с полученными ранее параметрами для триптофановой флуоресценции S1 (рис. 19, Таблица 3); величина T0.5 в обоих случаях составляла 47 ± 0,5 C. Температурные зависимости параметра L для флуоресцентной метки, прикрепленной к остатку Cys180 ELC дикого типа в регуляторном домене S1, также были почти одинаковыми в присутствии и в отсутствие HspB5 (рис. 20В). Таким образом, эффективное предотвращение агрегации S1 с помощью HspB5 (рис. 20А) практически не влияет на температурные зависимости флуоресценции S1 (рис. 20Б,В), которые отражают тепловую денатурацию моторного и регуляторного доменов молекулы S1. Это свидетельствует о том, что агрегация S1, обычно сопровождающая его тепловую денатурацию, не оказывает заметного влияния на структурные изменения моторного и регуляторного доменов молекулы Поэтому наблюдаемые нами изменения S1 .

флуоресцентных параметров А и L отражают, скорее всего, тепловую денатурацию доменов S1, а не следующую за ней агрегацию белка .

Б

–  –  –

Риc. 20. Температурные зависимости агрегации S1 (A) и флуоресценции меток, специфически прикрепленных к Cys707 в моторном домене S1 (Б), или к Cys180 в Сконцевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом S1 (В), полученные в присутствии или в отсутствие HspB5 .

(А) Агрегацию S1 измеряли по увеличению мутности (кажущейся оптической плотности при 350 нм) раствора в отсутствие (синяя кривая) или в присутствии (красная кривая) HspB5. Зеленая кривая представляет оптическую плотность HspB5 в отсутствие S1. (Б, В). Изменения флуоресценции выражали с помощью нормализованного параметра L для флуоресцентной метки (IAEDANS), прикрепленной к моторному (Б) или регуляторному (В) домену молекулы S1. Изменения параметра L в отсутствие или в присутствии HspB5 показаны, соответственно, синими и красными кружками .

Соответственно, синие и красные сплошные линии представляют результаты анализа данных с использованием сигмоидальной функции (Boltzmann). Скорость нагрева составляла 1C/мин .

Температурные зависимости флуоресценции меченых ELC, связанных с регуляторным доменом S1, в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4На рис. 21 представлены температурные зависимости изменений параметра L для флуоресцентно меченых ELC, связанных с регуляторным доменом S1 в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, в сравнении с изменениями параметра A, который отражает тепловую денатурацию моторного домена S1 в этих комплексах .

Значения T0.5 и d, полученные при анализе температурных зависимостей параметров A и L для всех изученных мутантов ELC, приведены в таблице 4 .

Результаты, представленные на рис. 21 и в таблице 4, показывают, что для всех изученных мутантов ELC изменения параметра L в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 происходят при значительно более низкой температуре, чем изменения параметра A. Во всех случаях значения T0.5 для параметра L существенно ниже, на 4–5 C, чем для параметра A. Как и в случае свободного от нуклеотидов S1 (рис. 19), в случае комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 наклон кривой для параметра L более пологий, чем для параметра A (рис. 21), и поэтому значение величины d для параметра L намного выше этого значения для параметра A (иногда даже в 7–9 раз, как в случае комплексов S1ADP-AlF4- с мутантами ELC, содержащими Cys160 или Cys99) (таблица 4). Ширина температурного диапазона, в котором происходят изменения флуоресцентных параметров, намного больше для параметра L, чем для параметра A (рис. 21), и это является причиной разницы в значениях величины d .

Рис. 21 .

Характерные температурные зависимости изменений флуоресценции S1 в тройных комплексах S1-ADP-BeFx (A–В) и S1-ADP-AlF4 (Г–Е). Красным цветом показаны изменения параметра L для флуоресцентно меченых рекомбинантных препаратов ELC, связанных с регуляторным доменом S1, а синим цветом – изменения параметра А для флуоресценции остатков триптофана в моторном домене S1. Флуоресцентно меченные AEDANS остатки Cys в ELC: Cys99 (A, Г), Cys127 (Б), Cys142 (Е), Cys160 (В), а также Cys180 в ELC(А1) дикого типа (Д). Принципы расчета нормированных параметров А и L описаны в разделе «Материалы и методы». Прочие обозначения – как на рис. 19 .

Таблица 4. Значения параметров T0 .

5 и d, полученных при анализе температурных зависимостей триптофановой флуоресценции (параметр А) и флуоресценции меченных AEDANS ELC (параметр L) для S1 в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 (рис. 21) .

–  –  –

Абсолютная погрешность значений T0.5 не превышала ±0,5C для параметра A и ± 1,0 C для параметра L. Абсолютная погрешность приведенных значений параметра d не превышала ± 0,2 для параметра A и ± 0,25 для параметра L .

Анализируя значения T0.5 для параметра L, представленные в таблице 4, можно сделать вывод, что они сходны со значениями T0.5 для калориметрического перехода 1, полученными при исследованиях тепловой денатурации S1 в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 методом ДСК (таблица 2). Кроме того, мы сравнили температурные зависимости нормализованных параметров L и A, полученных в экспериментах по флуоресценции (рис. 21), с тепловыми переходами 1 и 2, полученными в экспериментах методом ДСК на комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 (рис. 17). Результаты этого сравнения демонстрируют хорошую корреляцию между калориметрическим тепловым переходом 1 и температурными зависимостями нормализованного параметра L (рис. 22) .

Учитывая, что изменения параметра L отражают, скорее всего, структурные изменения, которые происходят в ELC (по крайней мере, в ее C-концевой части) в ходе тепловой денатурации, можно заключить, что калориметрический тепловой переход 1, наблюдаемый на термограммах ДСК комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, соответствует тепловой денатурации регуляторного домена S1, несущего ELC .

–  –  –

BeFx и S1-ADP-AlF4 (см. рис. 11 и 12 в обзоре литературы), должны быть чувствительными к структурным изменениям, происходящие при повороте регуляторного домена относительного моторного в процессе АТРазного цикла. Соответственно, мы ожидали обнаружить значительную разницу в температурных зависимостях флуоресценции таких остатков по сравнению с другими мечеными остатками в ELC .

Однако приведенные выше результаты (рис. 19 и 21, таблицы 3 и 4) однозначно указывают на то, что вся ELC (по крайней мере, вся ее C-концевая часть, ассоциированная с регуляторным доменом S1) подвергается в процессе тепловой денатурации S1 сходным структурным изменениям, и в результате изменения в микроокружении всех меченых остатков цистеина происходят аналогичным образом независимо от их местоположения относительно предполагаемой области контакта ELC с моторным доменом S1. Мы предположили, что это можно объяснить диссоциацией ELC от тяжелой цепи S1 в процессе тепловой денатурации S1, и решили экспериментально проверить это предположение .

Тепловая диссоциация ELC от тяжелой цепи S1 .

Как было описано выше, необратимая тепловая денатурация S1 обычно сопровождается его агрегацией (см. рис. 20A), за которой следует выпадение тяжелых цепей в осадок, который можно отделить от супернатанта с помощью S1 ультрацентрифугирования [112] Было также показано, что при нагревании ELC диссоциируют от тяжелых цепей S1 и остаются в супернатанте после интенсивного ультрацентрифугирования [112]. В нашей работе мы применили этот подход для исследования диссоциации ELC от тяжелых цепей S1 в комплексах S1-ADP-BeFx и S1ADP-AlF4 в процессе нагревания. Образцы нагревали с постоянной скоростью 1C/мин и при различных температурах отбирали аликвоты, которые затем охлаждали и подвергали ультрацентрифугированию для отделения ELC от денатурированных и выпавших в осадок тяжелых цепей S1, после чего белковый состав супернатантов определяли с помощью SDS-электрофореза. В результате этих экспериментов было показано, что тяжелая цепь S1 исчезала из супернатантов при температурах, соответствующих тепловой денатурации и последующей агрегации моторного домена S1, то есть выше 40C для свободного от нуклеотидов S1 и выше 50C для S1 в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4 (рис. 23) .

При этом, однако, ELC оставались в супернатанте даже тогда, когда процесс тепловой денатурации S1 был полностью завершен и тяжелые цепи S1 полностью исчезали из супернатантов (при температурах выше 48C для свободного от нуклеотидов S1 и выше 58C для S1 в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4). В этих условиях в супернатанте оставалось около 40% ELC для препаратов свободного от нуклеотидов S1 (рис. 23А) и около 50% ELC для S1 в составе комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- (рис. 23 Б,В) .

Следует отметить, что во всех случаях содержание ELC в супернатантах оставалось постоянным после полного осаждения тяжелых цепей S1 (рис. 23) .

Рис. 23. Температурные зависимости диссоциации ELC от тяжелых цепей S1 как в отсутствие нуклеотидов (A), так и в комплексах S1-ADP-BeFx (Б) и S1-ADP-AlF4 (В) .

Образцы нагревали с постоянной скоростью 1C/мин; по достижении указанной температуры отбирали аликвоты (100 мкл), охлаждали их и подвергали ультрацентрифугированию, после чего содержание ELC и тяжелых цепей S1 (HC) в супернатантах определяли с помощью SDS-ПААГ .

Частичное исчезновение ELC из супернатантов (рис. 23) можно объяснить следующим образом. Мы предполагаем, что все легкие цепи диссоциировали от тяжелых цепей S1 при тепловой денатурации регуляторного домена S1. При этом, однако, некоторые из них оказывались в растворе, а другие оставались частично связанными с нативными или только частично денатурированными молекулами S1 и поэтому могли быть механически вовлечены в аморфные агрегаты тяжелых цепей S1. Этот процесс может иметь место только до момента полной денатурации всех молекул S1. Этим можно объяснить, почему ELC исчезают из супернатантов в том температурном интервале, в котором происходит тепловая денатурация S1 (до 48C для S1 в отсутствие нуклеотидов и до 58C для комплексов S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4-), тогда как их содержание в супернатанте остается постоянным после полной денатурации всех молекул S1, когда все тяжелые цепи S1 выпадают в осадок и исчезают из супернатантов (рис. 23) .

В целом, приведенные выше результаты показывают, что тепловая денатурация S1 сопровождается диссоциацией ELC от тяжелой цепи S1 не только в отсутствие нуклеотидов, но также и в комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4. Эта диссоциация приводит к смещению спектра флуоресценции меченых ELC в сторону более коротких длин волн, что было продемонстрировано путем сравнения спектров, полученных для ELC, свободных в растворе и связанных с регуляторным доменом S1 (рис. 24). Этот спектральный сдвиг может объяснить увеличение параметра L, наблюдаемое для флуоресцентно меченных ELC при тепловой денатурации S1, которая сопровождается диссоциацией ELC от тяжелой цепи S1 .

–  –  –

Полученные данные указывают на то, что образование тройных комплексов S1ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4, которые имитируют промежуточные состояния АТРазного цикла S1 – S1*-AТP и S1**-ADP-Pi, соответственно, значительно стабилизирует не только моторный домен, но и регуляторный домен в молекуле S1. Сравнивая температурные зависимости флуоресценции меченных ELC, связанными с регуляторным доменом S1 в этих комплексах, с такими зависимостями для ELC в свободном от нуклеотидов S1, можно сделать вывод, что образование этих комплексов приводит к значительному увеличению величины T0.5 для параметра L, от 45–46 C (таблица 3) до 50–52 C (таблица 4). Это означает, что ELC, связанные с регуляторным доменом S1 в комплексах S1-ADPAlF4- и S1-ADP-BeFx, денатурируют при более высоких температурах, чем в случае с S1, свободным от нуклеотидов. Это увеличение термостабильности ELC отражает, вероятно, стабилизацию всего регуляторного домена, с которым они связаны. Мы можем предложить единственное объяснение этой стабилизации, которое сводится к тому, что она является результатом взаимодействия регуляторного домена S1 (точнее, ELC, связанной с регуляторным доменом) с моторным доменом в процессе АТРазного цикла (или в нашем случае – при образовании тройных комплексов S1-ADP-AlF4 и S1-ADPBeFx, имитирующих стадии АТРазного цикла). Это согласуется с выводами и предположениями, сделанными в некоторых более ранних работах [77, 89, 97, 120, 121] .

Наши результаты также демонстрируют сильную стабилизацию моторного домена S1 в комплексах S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx, образование которых приводит к значительному увеличению значения T0.5 для параметра A флуоресценции триптофана, от 46–47 C для S1 в отсутствие нуклеотидов (таблица 3) до 55–57 C в таких комплексах (таблица 4). Это согласуется с предыдущими данными ДСК о том, что термостабильность изолированного моторного домена головки миозина II из Dictyostelium discoideum (M765) сильно возрастает при образовании его тройных комплексов с ADP и аналогами Pi (Vi, BeFx или AlF4) [116, 122]. Значительная стабилизация моторного домена в молекуле S1 (повышение термостабильности на ~9C) также следует из сравнения калориметрических переходов, соответствующих этой области, в свободном от нуклеотидов S1 [96] (рис. 15, таблица 2) и в комплексах S1-ADP-AlF4- или S1-ADP-BeFx (рис. 14,16,17, таблица 2) .

Следует отметить, что во всех этих случаях наблюдалась хорошая корреляция между тепловыми переходами, полученными методом ДСК и при измерениях температурных зависимостей триптофановой флуоресценции (например, рис. 17 и 22) .

Более сложная ситуация наблюдается в случае регуляторного домена S1, для которого сходство между данными ДСК и температурными зависимостями флуоресценции четко наблюдалось только для комплексов S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx (рис. 22), но не для S1, свободного от нуклеотидов. В последнем случае для всех исследованных мутантных препаратов ELC изменения флуоресценции меченых ELC наблюдали при гораздо более высокой температуре (T0,5 = 45–46 C, таблица 3), чем это было предсказано ранее в экспериментах, проведенных методом ДСК, для тепловой денатурации регуляторного домена S1 в отсутствие нуклеотидов (т.е. ~ 40C) [96]. Более того, при этой температуре (~ 40C) мы вообще не наблюдали заметных изменений флуоресценции меченых ELC (рис. 19). Мы можем предложить следующие возможные объяснения этого противоречия между результатами, полученными в экспериментах методом ДСК и при измерениях температурных зависимостей флуоресценции меченых ELC .

Во-первых, следует отметить, что все флуоресцентно меченные остатки цистеина были расположены в С-концевой половине ELC, которая, согласно предсказаниям, взаимодействует с моторным доменом S1[63, 77, 89, 121] (см. рис. 11, 12). Мы не можем исключить возможность того, что N-концевая половина ELC, которая не содержала флуоресцентно меченых остатков цистеина, денатурирует при нагревании при более низкой температуре (например, около 40C), чем C-концевая часть ELC, демонстрируя, таким образом, наименее термостабильный калориметрический домен 1 с T0,5 при ~40C по данным ДСК. Это согласуется с данными кристаллографических исследований, которые показали, что N- и С-концевые части ELC характеризуются различными конформационными состояниями и по-разному связаны с тяжелой цепью S1 [27, 123]: Nконцевая часть ELC находится в «закрытой» конформации, тогда как С-концевая часть характеризуется «полуоткрытой» конформацией, которая обеспечивает более жесткое связывание с тяжелой цепью регуляторного домена S1. С другой стороны, возможно, что тепловая денатурация N-концевой части ELC не сопровождается ее диссоциацией от тяжелой цепи S1 и, соответственно, аналогичными изменениями флуоресценции меченых остатков Cys, расположенными в С-концевой части ELC. Этим можно объяснить, по крайней мере отчасти, упомянутое выше противоречие между результатами ДСК и флуоресценции, полученными для S1 в отсутствие нуклеотидов .

Другое возможное объяснение этого противоречия следует из результатов экспериментов, проведенных с помощью электронной микроскопии высокого разрешения, в которых было показано, что даже в отсутствие нуклеотидов молекула S1 обладает заметной гибкостью, которая выражается в изменении ориентации регуляторного домена S1 относительно моторного домена, а «шарнирная» область расположена между двумя доменами [90]. Мы не можем исключить возможность того, что эти изменения в ориентации регуляторного домена S1 могут сопровождаться дополнительными контактами С-концевой области ELC с моторным доменом S1, что, в свою очередь, может приводить к повышению температуры, при которой происходят изменения флуоресценции меченых ELC .

В любом случае, можно сказать, что результаты, полученные в наших экспериментах по тепловой денатурации S1, свидетельствуют в пользу ранее предложенной концепции взаимодействия между моторным доменом S1 и ELC, связанной с регуляторным доменом S1, в процессе АТРазного цикла. Используя флуоресцентно меченные ELC, мы идентифицировали наименее термостабильный тепловой переход на термограммах ДСК для комплексов S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx как регуляторный домен молекулы S1, а также показали, что образование этих комплексов (стабильных аналогов промежуточных состояний АТРазной реакции S1 – S1**-ADP-Pi и S1*-AТP) сильно увеличивает термостабильность регуляторного домена S1. Мы можем предложить единственно возможное объяснение этой стабилизации, а именно довольно тесное взаимодействие ELC в регуляторном домене с моторным доменом. Взаимодействие Сконцевой части ELC с моторным доменом S1 также может иметь место в отсутствие нуклеотидов [21, 88] (рис. 11). Однако наши результаты показывают, что это взаимодействие становится намного более прочным в комплексах S1-ADP-AlF4 и S1-ADPBeFx, которые имитируют основные промежуточные состояния АТРазного цикла S1, в которых С-концевая часть ELC взаимодействует с другими участками моторного домена S1 [89] (рис. 12), отличными от тех, с которыми она взаимодействует в отсутствие нуклеотидов (рис. 11). Это согласуется с результатами работ, в которых было показано, что связывание АТР с активным центром АТРазы в моторном домене S1 приводит к значительному уменьшению подвижности С-концевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом [77, 121] .

Согласно кристаллографическим данным, образование комплексов S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx приводит к повороту регуляторного домена (lever arm) относительно моторного домена, и, как следствие, к сближению обоих этих доменов [89] (рис. 12) .

Полученные нами результаты указывают на то, что в этих комплексах регуляторный и моторный домены не только расположены близко друг к другу из-за поворота регуляторного домена, но между этими двумя доменами головки миозина происходит довольно тесное взаимодействие. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что во время АТРазного цикла доменная структура головки миозина подвергается глобальным изменениям, которые выражаются в плотном взаимодействии между двумя ее главными структурными доменами, моторным и регуляторным. Представляется вполне вероятным, что такое междоменное взаимодействие, происходящее в процессе АТРазного цикла, может играть важную роль в функционировании головки миозина в качестве молекулярного мотора. Например, временная иммобилизация регуляторного домена на поверхности моторного домена может иметь важное значение для стабилизации головки в состоянии слабого связывания с актином в ходе АТРазного цикла .

Измерение дистанций между С-концевой частью ELC и активным центром S1 с помощью метода FRET .

Следует отметить, что полученные данные по сравнению температурных зависимостей флуоресценции с данными ДСК лишь косвенно свидетельствуют в пользу возможности взаимодействия С-концевой части ELC с моторным доменом молекулы S1 в процессе АТРазного цикла. Для того, чтобы получить более прямые подтверждения такого взаимодействия, на следующем этапе исследований в этом направлении мы применили метод Фёрстеровского резонансного переноса энергии (Frster Resonance Energy Transfer, FRET), который позволяет определять расстояния между двумя флуоресцентными метками и акцептором энергии флуоресценции), (донором присоединенными к остаткам в разных областях молекулы белка. Рекомбинантные ELC были модифицированы флуоресцентной меткой 1,5-IAEDANS (донор), после чего собственные легкие цепи в молекуле S1 были заменены на флуоресцентно меченные ELC .

В качестве акцептора использовали флуоресцентный аналог ADP (TNP-ADP), расположенный в активном центре АТРазы в моторном домене S1. Сначала мы получали спектры флуоресценции донора (1,5-IAEDANS), связанного с различными остатками Cys в С-концевой области ELC, и спектры флуоресценции донора в присутствии акцептора (TNP-ADP), связанного с активным центром S1, в препаратах S1–ADP-TNP и S1–TNPADP-BeFx (рис. 25). Полученные данные обрабатывали и во всех исследуемых препаратах S1 рассчитывали дистанции между донором и акцептором. Показано, что образование комплекса S1-ADP-BeFx (стабильного аналога интермедиата ATPазной реакции S1 – S1*AТP) снижало расстояния от остатков цистеина в C-концевой части ELC до TNP-ADP в активном центре S1, причем этот эффект зависел от положения остатка Cys в последовательности ELC (таблица 5). Наименьший эффект наблюдался для остатка Cys180, расположенного поблизости от C-конца ELC: в этом случае расстояние от этого остатка до TNP-ADP в активном центре S1 (5,5 нм) снижалось на 0,7 нм (до 4,8 нм) в комплексе S1–TNP-ADP-BeFx (таблица 5). Эти данные (как расстояние между Cys180 и TNP-ADP в активном центре S1, так и его снижение в комплексе S1-ADP-BeFx) хорошо согласуются с ранее опубликованными данными FRET, доступными из литературы [38], что подтверждает корректность наших измерений. Самые сильные эффекты наблюдались для остатков Cys99 и Cys160 в ELC: в этом случае расстояния от этих остатков до TNPADP в активном центре S1 резко снижались при образовании комплекса S1-ADP-BeFx, от 5,7 нм (для Cys160) или даже 6,5 нм (для Cys99) до 3,3–3,7 нм (таблица 5). Важно отметить, что эти остатки, Cys99 и Cys160, расположены как раз в той области последовательности ELC, которая, согласно предсказаниям, вступает в контакт с моторном доменом S1 в комплексе S1-ADP-BeFx [89]. Эти результаты свидетельствуют о том, что в комплексе S1-ADP-BeFx может иметь место взаимодействие между С-концевой частью ELC и моторным доменом S1 .

Рис. 25. Тушение флуоресценции донора (1,5-IAEDANS), связанного с остатком Cys160 в С-концевой части ELC, акцептором (TNP-ADP), расположенным в активном центре АТРазы S1. Концентрация S1 составляла 0,22 мкМ. Спектры флуоресценции донора (1,5-IAEDANS) регистрировали в присутствии 10 мкМ TNP-ADP (кривые 1 и 2) или в комплексах S1–TNP-ADP-BeFx (кривые 3 и 4). Для коррекции спектров донора на неспецифическое связывание TNP-ADP с S1 в контрольных экспериментах к S1 добавляли 3 мМ ADP перед добавлением 10 мкМ TNP-ADP (кривые 1 и 3); в этих условиях TNP-ADP не мог специфически связываться с нуклеотид-связывающим центром S1 [38, 110]. Видно, что образование комплекса S1-ADP-BeFx вызывало сильное тушение флуоресценции донора (1,5-AEDANS), связанного с остатком Cys160 в ELC (кривая 4) .

Таблица 5. Расстояния между 1,5-IAEDANS, связанным с остатками Cys в различных положениях С-концевой области ELC, и TNP-ADP в нуклеотидсвязывающем сайте моторного домена S1 .

–  –  –

Значения эффективности переноса были получены из данных тушения донора, как показано на рис. 25. Представленные данные являются результатом обработки трех независимо проведенных экспериментов. Стандартная ошибка при определении расстояний составляла около 0,2 нм. Когда эффективность переноса энергии была слишком мала (E 0,05), дистанции были слишком большими (6,5 нм), чтобы можно было точно измерить их значения .

Таким образом, данные, полученные с помощью метода FRET, вместе с результатами, описанными выше в этом разделе, подтверждают гипотезу о том, что поворот регуляторного домена относительно моторного домена в ходе АТРазного цикла может сопровождаться взаимодействием между С-концевой частью ELC, ассоциированным с регуляторным доменом, и моторным доменом головки миозина [77, 89] .

Можно предположить, что такой дополнительный контакт между С-концевой областью ELC, связанной с регуляторным доменом S1, и моторным доменом головки миозина позволяет регуляторному домену временно зафиксироваться в конформационном состоянии, соответствующем слабому связыванию миозина с актином в процессе АТРазного цикла .

3.2. Особенности функционирования N-концевого сегмента А1 .

В этом разделе приведены результаты исследований, посвященных выяснению особенностей функционирования N-концевого сегмента «длинной» изоформы ELC (А1), отсутствующего у другой («короткой») изоформы ELC – А2. Для удобства изложения ниже мы будем обозначать эти изоформы ELC как А1 и А2 .

Взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином .

Главной функцией N-концевого сегмента А1 несомненно является его достаточно хорошо изученное взаимодействие с актином. В состоянии сильного связывания во время ATPазного цикла, когда миозиновая головка не содержит нуклеотид или содержит связанную ADP, высокоактивный "липкий" участок на самом N-конце этого сегмента, содержащий несколько положительно заряженных остатков лизина, связывается с кластером С-концевых кислых остатков 360–364 актина на актиновом мономере, отличном от того, с которым связывается моторный домен головки. При этом формируется дополнительный актин-связывающий участок на миозиновой головке. На основании данных структурного моделирования было высказано предположение, что участок N-концевого сегмента А1, содержащий многочисленные повторы Ala-Pro (остатки 15–28), может функционировать, благодаря своей полужесткой антенно-подобной структуре, как вытянутый "мостик", который соединяет С-концевую часть А1, ассоциированную с регуляторным доменом миозиновой головки, с участком связывания положительно заряженного N-конца А1 на актиновом филаменте [71]. Следует отметить, однако, что взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином ранее наблюдали, как правило, лишь при очень низких значениях ионной силы раствора, вследствие чего не раз высказывались сомнения в том, что такое взаимодействие может иметь место при физиологических условиях. Нам удалось развеять эти сомнения в результате экспериментов, проведенных методом FRET при физиологических значениях ионной силы, в которых было показано заметное сближение N-конца А1 с F-актином .

На первом этапе работы методом сайт-направленного мутагенеза мы получали рекомбинантные препараты А1, несущие единственный остаток цистеина в различных положениях N-концевого сегмента. Положения остатков цистеина в N-концевой области А1 были выбраны неслучайно: Cys6 (мутация V6C) располагался в области положительно заряженного кластера на самом N-конце А1, Cys15 (мутация A15C) – в области Ala-Pro повторов, а Cys40 (мутация S40C) – в С-концевой части N-концевого сегмента. Помимо этого, был получен мутант А1, в котором остаток Cys был расположен практически на самом N-конце цепи, куда была введена дополнительная последовательность CGI сразу после двух N-концевых остатков (Met-Ala); такой мутант получил название CysN. Такие препараты A1 с остатком Cys на самом N-конце (CysN) использовались нами в качестве контроля, который позволял оценить дистанции от N-конца дополнительного сегмента A1 до Cys374 на F-актине. В таких препаратах A1-CysN не была нарушена структура аминокислотной последовательности N-концевого сегмента А1 из-за введения в нее остатка Cys, поскольку дополнительно введенный остаток Cys располагался за пределами основной аминокислотной последовательности и не должен был влиять на процесс взаимодействия с актином N-концевого сегмента А1 (а именно, его N-концевого положительно заряженного кластера). (Естественно, собственный остаток Cys180 в Сконцевой части A1 был предварительно заменен на остаток Ala мутацией С180A). После этого мы применили метод FRET чтобы впервые определить расстояния между остатком Cys374 на актине и различными участками N-концевого сегмента A1, ассоциированной с регуляторным доменом S1. Остаток Cys374 актина метили флуоресцентной меткой 1,5IAEDANS (донор); собственные ELC в S1 замещали на рекомбинантные мутантные формы A1 с остатками Cys, введенными в разные места N-концевого сегмента, к которым присоединяли флуоресцентную метку 5-IAF (акцептор). На рис. 26 приведены спектры флуоресценции акцептора (5-IAF), присоединенного к остаткам Cys40 или Cys6 в Nконцевом сегменте A1, в присутствии и в отсутствие донора (1,5-IAEDANS). Под присутствием и отсутствием донора подразумеваются комплексы S1, несущего флуоресцентно меченую А1, с флуоресцентно меченым F-актином и с немеченым Fактином, соответственно .

Эти спектры, полученные при физиологических значениях ионной силы (120– 150 мM NaCl) и молярном отношении S1 к актину, равном 1:3 (т.е. в условиях, когда Nконцевой сегмент A1 способен взаимодействовать с актином), использовали для определения дистанций между двумя флуоресцентными метками (донором и акцептором) .

Мы определили следующие расстояния от остатка Cys374 в актине до различных остатков Cys в N-концевом сегменте A1: 5,2 нм до Cys40, 3,7 нм до Cys15, расположенного между повторами Ala-Pro, и меньше 2,5 нм до остатков Cys, расположенных поблизости от остатков Lys на N-конце А1 (Cys6 или CysN) (таблица 6). При повышении ионной силы (выше 300 мМ NaCl) и при молярном отношении S1:актин, равном 1:1 (т.е. в условиях, предотвращающих взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином), все эти расстояния сильно увеличивались .

Рис. 26. Спектры флуоресценции акцептора (1,5-IAF) в N-концевом сегменте A1, ассоциированной с S1 комплексе S1 с F-актином. Спектры получены в отсутствие (синие пунктирные линии) и в присутствии (черные пунктирные линии) донора (1,5-IAEDANS), присоединенного к остатку Cys374 в актине. Сплошные линии представляют собой результаты деконволюции экспериментальных данных для донора в присутствии акцептора: красная линия – донор, синяя линия – акцептор .

Интересно, что уменьшение расстояний от остатков цистеина в N-концевом сегменте А1 до актина происходит последовательно, по мере удаления этих остатков от Nконца A1: самый удаленный от актина остаток – это Cys40, ближе к актину располагается Cys15 и совсем близко к актину находятся остатки Cys6 и CysN, расположенные, скорее всего, непосредственно в зоне контакта N-концевого сегмента А1 с актином. Это свидетельствует о том, что непосредственно с актином взаимодействует кластер положительно заряженных остатков лизина на N-конце этого сегмента, а следующая за ним область повторов Ala-Pro вытягивается в длину и представляет собой «мостик» или «щуп», который позволяет N-концу сегмента дотянуться до мономера актина в филаменте, соседнего с тем, с которым взаимодействует моторный домен головки миозина (рис. 27) .

В целом, эти результаты подтверждают ранее высказанные предположения о том, что взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином может происходить при физиологических значениях ионной силы и играть важную роль при взаимодействии миозина с актином в процессе мышечного сокращения .

–  –  –

Значения эффективности переноса были получены из данных тушения донора, как показано на рис. 26. Представленные данные являются результатом обработки трех независимо проведенных экспериментов. Стандартная ошибка при определении расстояний составляла около 0,5 нм. Когда эффективность переноса энергии была очень большая (E 0,95), дистанции были слишком маленькими (2,5 нм), чтобы точно измерять их значения .

Рис. 27. Структура комплекса актомиозина скелетных мышц кролика (PDB 5H53) и предполагаемое положение N-концевого сегмента А1 в этом комплексе, основанное на результатах экспериментов методом FRET (таблица 6). Актиновые мономеры в филаменте F-актина выделены зеленым и желтым цветом, моторный домен миозиновой головки – серым цветом, тяжелая цепь регуляторного домена миозиновой головки – темно-серой спиралью; С-концевая часть А1, ассоциированная с регуляторным доменом головки, показана синим цветом, а N-концевой сегмент А1, который взаимодействует с актином, показан как синяя линия. Остаток Cys374 на актине выделен красным цветом. Желтые кружки на N-концевом сегменте А1 показывают местоположения флуоресцентно меченых остатков Cys в этом сегменте (Cys6, Cys15 или Cys40) .

Необычные агрегационные свойства препарата S1(А1) .

Как описано в обзоре литературы, в разделе, посвященном взаимодействию Nконцевого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки, интересным свойством этого сегмента является его способность индуцировать межмолекулярные взаимодействия между молекулами S1, содержащими A1, приводящие к их необычной агрегации, которая была впервые описана ранее при сравнении агрегационных свойств двух изоформ S1, содержащих разные существенные легкие цепи – S1(A1) и S1(A2) [78-80]. Мы продолжили исследования в этом направлении и провели подробный сравнительный анализ агрегационных свойств этих изоформ. Прежде всего, мы исследовали тепловую денатурацию S1(A1) и S1(A2) методом ДСК и не обнаружили заметной разницы между этими изоформами S1 как в отсутствие добавленных нуклеотидов, так и в комплексах S1ADP-BeFx или S1-ADP-AlF4. Это значит, что присутствие дополнительного N-концевого сегмента в А1 не оказывает заметного влияния на тепловую денатурацию S1. Для последующего сравнительного анализа агрегационных свойств S1(A1) и S1(A2) нам важно было знать, при каких значениях температуры начинается процесс их тепловой денатурации, сопровождаемой аморфной агрегацией белка. По данным ДСК эти значения составили для обеих изоформ S1 36–37C в отсутствие нуклеотидов, 38–39C в присутствии ADP и 47–48 C для S1 в комплексах S1-ADP-BeFx или S1-ADP-AlF4 (рис .

16) .

Ранее методом ДСК было показано, что образование тройных комплексов S1-ADPBeFx или S1-ADP-AlF4 вызывает глобальные изменения конформации S1, которые выражаются в резком повышении термостабильности S1, тогда как связывание ADP не оказывает существенного влияния на температуру теплового перехода S1 [1, 109, 116, 117, 124]. В хорошем соответствии с результатами предыдущих исследований [78-80], между S1(A1) и S1(A2) наблюдались значительные различия в температурных зависимостях их тепловой агрегации, измеряемой при низкой ионной силе в отсутствие нуклеотидов (рис .

28а). В этих условиях агрегация S1(A2) определялась исключительно тепловой денатурацией его моторного домена [96]. С другой стороны, агрегация S1(A1) наблюдалась при значительно более низкой температуре, начиная с 33–34 C (рис. 28а), т.е. до начала процесса денатурации. В обоих этих случаях агрегация определялась только тепловой денатурацией белка, поскольку оба эти процесса происходили в одном и том же температурном диапазоне .

Напротив, никаких заметных различий в агрегационных свойствах S1(A1) и S1(A2) не наблюдалось в их тройных комплексах S1-ADP-BeFx или S1-ADP-AlF4 (рис. 30б,в). В обоих этих случаях агрегация определялась только тепловой денатурацией белка, поскольку оба эти процесса происходили в одном и том же температурном диапазоне. Эти результаты указывают на то, что образование тройных комплексов S1-ADP-BeFx или S1ADP-AlF4 полностью предотвращает те межмолекулярные взаимодействия, которые вызываются N-концевым сегментом легкой цепи A1 и выражаются в существенных различиях между S1(A1) и S1(A2) в их агрегационных свойствах .

–  –  –

S1(A1), но не S1(A2), осаждался в этих условиях (рис. 29в), когда агрегация и последующая преципитация S1(A1) вызывается не тепловой денатурацией S1, а межмолекулярными взаимодействиями, индуцируемыми N-концевым сегментом легкой цепи A1. К удивлению, только ~20 % молекул S1(A1) исчезали из супернатантов в этом температурном диапазоне (до 40C) (рис. 29в). Представляется вполне очевидным, что именно индуцируемые А1 взаимодействия между этими молекулами S1(A1) отвечают за необычные агрегационные свойства S1(A1) при низкой ионной силе, которые резко отличаются от агрегации S1(A2), вызываемой тепловой денатурацией белка .

–  –  –

S1(А1) S1(А2) Исследования препаратов и методом динамического светорассеяния .

Для более подробного анализа уникальных агрегационных свойств S1(A1), проявляющихся при низкой ионной силе, мы применили метод динамического светорассеяния (Dynamic Light Scattering, DLS), который позволяет определять размер частиц, образующихся в процессе агрегации белка при его нагревании .

На рисунке 30а представлены температурные зависимости интенсивности светорассеяния, измеренные методом DLS для свободных от нуклеотидов S1(A1) и S1(A2) в процессе их нагревания с постоянной скоростью 1°C/мин при низкой ионной силе .

–  –  –

нм (рис. 30б). Сходные и даже еще более ярко выраженные различия в значениях Rh между двумя изоформами S1 наблюдались в условиях, когда белки прогревали при постоянной температуре 35C, т.е. при той температуре, при которой начинается агрегация S1(A1) (рис. 30в). Через 15 минут такого прогрева величина Rh для S1(A1) могла достигать 800–1000 нм, но оставалась неизменной и равной 16 ± 4 нм для S1(A2) (рис. 30в и 32а) .

–  –  –

распределении частиц по значениям Rh давать пик, представляющий более 90% интенсивности рассеяния [125] .

Следует отметить, что необычная агрегация оказалась очень S1(A1) чувствительной к ионной силе, поскольку она не наблюдалась уже в присутствии 25 мМ KCl. В этих условиях величина Rh для S1(A1) не отличалась от Rh для S1(A2) и оставалась неизменной и равной 16 ± 4 нм при нагреве до 40C. Более того, такая агрегация S1(A1), индуцируемая А1, была полностью обратимой, поскольку добавление 100 мМ KCl к агрегатам S1(A1), полученным после его прогрева до 40C и последующего охлаждения, приводило к их полной диссоциации, сопровождаемой немедленным снижением величины Rh от ~600 нм до 16–20 нм .

Подобные эксперименты проводили методом DLS с S1(A1) и S1(A2) в их комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4. Мы не обнаружили никаких различий между этими изоформами S1 в их комплексах S1-ADP-BeFx ни по температурным зависимостям роста светорассеяния и значений Rh (рис.31а,б), ни по кинетике прироста Rh в процессе инкубации при 45C (т.е. при той температуре, при которой начинается тепловая денатурация и агрегация S1 в комплексе S1-ADP-BeFx) (рис.31в). Через 15 минут такого прогрева величина Rh увеличивалась до 800 ± 150 нм для обеих изоформ S1 (рис.31в и 32б). Такие же результаты были получены на комплексах S1-ADP-AlF4, для которых также не наблюдалось заметной разницы между S1(A1) и S1(A2) (данные не представлены). Таким образом, результаты, полученные методом DLS, еще раз свидетельствуют о том, что образование тройных комплексов S1-ADP-BeFx или S1-ADPAlF4 полностью предотвращает межмолекулярные взаимодействия, вызываемые Nконцевым сегментом легкой цепи А1, которые проявляются в необычных агрегационных свойствах S1(A1) при низкой ионной силе .

Мы также применили метод DLS для исследования влияния ADP на агрегационные свойства S1(A1) и S1(A2) при низкой ионной силе. Результаты, полученные в присутствии ADP, мало отличались от результатов, полученных для изоформ S1 в отсутствие нуклеотидов, хотя и были выражены не столь ярко (рис. 33). В этих условиях светорассеяние S1(A1) начинало увеличиваться при более низкой температуре (42C), чем для S1(A2) (~47C), и его максимальная интенсивность (при температурах выше 52C) была для S1(A1) выше, чем для S1(A2) (рис. 33а). Когда белки прогревали при постоянной температуре 37C, интенсивный рост величины Rh наблюдался только для S1(A1), но не для S1(A2) (рис. 33б). Через 15 минут такого прогрева величина Rh достигала 670 ± 130 нм для S1(A1), но оставалась неизменной и равной 16–20 нм для S1(A2) (рис. 33б, в) .

Рис. 32. Агрегация S1(A1) и S1(A2), регистрируемая методом DLS в отсутствие нуклеотидов (а) и в комплексах S1-ADP-BeFx (б) при низкой ионной силе. Распределение частиц по их размерам (Rh), зарегистрированное после 15 мин инкубации при 35°C (а) и 45°C (б) .

–  –  –

Представленные результаты свидетельствуют о том, что N-концевой сегмент легкой цепи А1 способен вызывать взаимодействия между молекулами S1, которые выражаются в необычной агрегации S1(A1), и эти взаимодействия полностью предотвращаются глобальными конформационными перестройками, происходящими в миозиновой головке в процессе АТРазного цикла. Мы предполагаем, что эти межмолекулярные взаимодействия отражают те внутримолекулярные взаимодействия Nконцевого сегмента легкой цепи А1 с моторным доменом миозиновой головки, возможность которых описана в более ранних работах [71, 76, 77] и подробно проанализирована в обзоре литературы (в разделе, посвященном взаимодействию Nконцевого сегмента А1 миозина с моторным доменом миозиновой головки) .

Главной функцией сегмента А1 несомненно является его N-концевого взаимодействие с актином. В состоянии сильного связывания во время ATPазного цикла, когда миозиновая головка не содержит нуклеотид или содержит связанную ADP, высокоактивный "липкий" участок на самом N-конце этого сегмента, содержащий несколько положительно заряженных остатков лизина, связывается с кластером Сконцевых кислых остатков 360–364 актина [60, 126] на актиновом мономере, отличном от того, с которым связывается моторный домен головки [34, 65, 72]. При этом формируется дополнительный актин-связывающий участок на миозиновой головке. На основании данных структурного моделирования было высказано предположение, что участок Nконцевого сегмента А1, богатый повторами Ala-Pro, может функционировать, благодаря своей полужесткой антенно-подобной структуре, как вытянутый "мостик", который соединяет С-концевую часть А1, ассоциированную с регуляторным доменом миозиновой головки, с участком связывания положительно заряженного N-конца А1 на актиновом филаменте [71]. Когда миозиновая головка связывает АТР во время АТРазного цикла, она подвергается глобальной конформационной перестройке и диссоциирует от актинового филамента. Совершенно очевидно, что при этом высоко-заряженный N-конец А1 также должен отсоединиться от актина, и любые его контакты с актином должны предотвращаться в процессе связывания и гидролиза АТР. Мы предполагаем, что на этих стадиях АТРазного цикла может происходить внутримолекулярное взаимодействие заряженного N-конца A1 с миозиновой головкой, предположительно с ее моторным доменом. Допуская такое внутримолекулярное взаимодействие, сразу же возникает вопрос: а что же происходит с N-концом A1 в растворе S1 в отсутствие как актина, так и нуклеотидов? Мы предполагаем, что в этих условиях N-конец A1 не способен, повидимому, к внутримолекулярному взаимодействию из-за глобальных конформационных изменений, происходящих в миозиновой головке в процессе АТРазного цикла, но он может взаимодействовать с моторным доменом другой молекулы S1. Такими межмолекулярными и внутримолекулярными взаимодействиями N-конца A1 можно объяснить как необычную агрегацию S1(A1) в отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP (рис. 30 и 33), так и предотвращение этой агрегации в комплексах S1-ADP-BeFx или S1-ADP-AlF4, имитирующих промежуточные состояния ATPазного цикла S1 – S1*-AТP и S1**-ADP-Pi, соответственно (рис. 31). Эти предполагаемые взаимодействия между Nконцевым сегментом A1 и моторным доменом S1 схематически изображены на рис. 34 .

–  –  –

связывании и гидролизе ATP в процессе ATPазного цикла, и может играть важную роль при функционировании головки в качестве молекулярного мотора .

Измерение расстояний между N-концевым сегментом A1 и моторным доменом S1 методом FRET .

Следует отметить, что описанные в предыдущем разделе данные лишь косвенно свидетельствуют в пользу возможности взаимодействия N-концевого сегмента А1 с моторным доменом молекулы S1 в процессе АТРазного цикла. Для того, чтобы получить более прямые подтверждения такого взаимодействия, мы применили метод FRET, позволяющий определять расстояния между двумя флуоресцентными метками (донором и акцептором энергии флуоресценции), присоединенными к остаткам в разных областях молекулы белка. Для этого был получен целый ряд рекомбинантных препаратов А1 с SHгруппой в разных участках последовательности N-концевого сегмента А1: Cys6 (мутация V6C) в области положительно заряженного кластера на N-конце А1, Cys15 (мутация A15C) – в области Ala-Pro повторов и Cys40 (мутация S40C) – в С-концевой части Nконцевого сегмента, а также CysN, в котором остаток Cys был расположен практически на самом N-конце цепи; все эти цистеиновые мутанты были уже описаны выше в этой главе, в разделе, посвященном взаимодействию N-концевого сегмента А1 с актином. Эти рекомбинантные препараты А1 были модифицированы флуоресцентной меткой 1,5IAEDANS (донор), после чего собственные ELC в молекуле S1 были заменены на флуоресцентно меченые A1. В качестве акцептора использовали флуоресцентный аналог ADP (TNP-ADP), расположенный в активном центре АТРазы S1. На рисунке 35 представлены спектры флуоресценции препаратов S1-ADP и S1-ADP-BeFx, содержащих А1, меченные по Cys6 флуоресцентной меткой 1.5-IAEDANS (донор), в присутствии и в отсутствие тушителя TNP-ADP. Видно, что в препарате S1-ADP-BeFx наличие тушителя (TNP-ADP) резко снижает интенсивность флуоресценции донора, связанного с Cys6 в Nконцевом сегменте А1 (риc. 35) .

Аналогичные эксперименты были проведены для препаратов S1-ADP и S1-ADPBeFx, содержащих А1, флуоресцентно меченные по разным остаткам цистеина (Cys15, Cys40 и CysN) в N-концевом сегменте A1 (данные не приведены). Для всех этих препаратов были рассчитаны расстояния от донора (AEDANS), связанного с различными остатками Cys в N-концевом сегменте A1, до тушителя (TNP-ADP) в активном центре S1 (таблица 7) .

Рис. 35. Тушение флуоресценции донора (1,5-IAEDANS), связанного с остатком Cys6 в N-концевом сегменте А1, акцептором (TNP-ADP), расположенным в активном центре АТРазы S1. Концентрация S1 составляла 0,22 мкМ. Спектры флуоресценции донора (1,5IAEDANS) регистрировали в присутствии 10 мкМ TNP-ADP (кривые 1 и 2) или в комплексах S1–TNP-ADP-BeFx (кривые 3 и 4). Для коррекции спектров донора на неспецифическое связывание TNP-ADP с S1 в контрольных экспериментах к S1 добавляли 3 мМ ADP перед добавлением 10 мкМ TNP-ADP (кривые 1 и 3); в этих условиях TNP-ADP не мог специфически связываться с нуклеотид-связывающим центром S1 [38, 110]. Видно, что образование комплекса S1-ADP-BeFx вызывало сильное тушение флуоресценции донора (1,5-AEDANS), связанного с остатком Cys6 в N-концевом сегменте А1 (кривая 4) .

Было показано, что образование комплекса S1-ADP-BeFx (стабильного аналога интермедиата ATPазной реакции S1 – S1*-AТP) резко снижает расстояния от остатков цистеина в N-концевом сегменте А1 до TNP-ADP в активном центре S1. Особенно ярко этот эффект проявлялся для флуоресцентных меток, расположенных поблизости от Nконца этого сегмента (Cys6 и CysN): в этом случае расстояние до TNP-ADP в активном центре S1 снижалось при образовании комплекса S1-ADP-BeFx от 5,7 нм до 3,5–3,7 нм (таблица 7). Интересно, что дистанции от меченых остатков Cys в N-концевом сегменте А1 до активного центра АТРазы S1 по-разному снижались при образовании комплекса S1ADP-BeFx для разных препаратов, несущих флуоресцентно меченые остатки Cys в разных положениях N-концевого сегмента А1 (таблица 7). Если сравнить между собой эти дистанции для разных препаратов, то окажется, что N-концевой сегмент последовательно приближается к активному центру АТРазы S1, начиная от своего C-конца (остаток Cys40, для которого эта дистанция оставалась достаточно большой в комплексе S1-ADP-BeFx) и заканчивая аминокислотными остатками на самом N-конце сегмента, Cys6 и CysN, для которых эта дистанция снижались при образовании комплекса S1-ADP-BeFx на 2,0– 2,2нм (таблица 7, риc. 36) .

Таблица 7. Расстояния, рассчитанные методом FRET между 1,5-IAEDANS, связанным с остатками Cys в разных положениях N-концевого сегмента A1, и TNP-ADP в активном центре АТРазы S1 .

–  –  –

Значения эффективности переноса были получены из данных тушения донора, как показано на рис. 35. Представленные данные являются результатом обработки трех независимо проведенных экспериментов. Стандартная ошибка при определении расстояний составляла около 0,35 нм. Когда эффективность переноса энергии была слишком мала (E 0,05), дистанции были слишком большими (6,5 нм), чтобы можно было точно измерить их значения .

В отсутствие BeFx (т.е. к комплексах S1–TNP-ADP) все эти расстояния, измеренные методом FRET, были довольно большими, ~6 нм или даже больше (таблица 7), что указывает на то, что в этих условиях N-концевой сегмент А1 находится достаточно далеко от активного центра АТРазы S1. Литературные данные о возможном расположении N-конца А1 на моторном домене S1 весьма противоречивы: согласно этим данным он может быть расположен либо вблизи области «конвертера» [76], либо вблизи области SH3-домена [71] (рис. 36). Однако представляется более вероятным, что в этих условиях (в отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP) N-концевой сегмент А1 расположен произвольным образом и не способен взаимодействовать с моторным доменом свой собственной молекулы S1, но зато он способен индуцировать межмолекулярные взаимодействия между молекулами S1(А1), что проявляется в их необычной агрегации, описанной в предыдущем разделе .

Рис. 36. Предполагаемое положение N-концевого сегмента А1 в комплексе S1ADP-BeFx. Была использована атомная структура S1 из мускульного желудка курицы в комплексе S1-ADP-BeFx (PDB 1BR4). Моторный домен показан светло-серым цветом, тяжелая цепь регуляторного домена – темно-серым цветом, а С-концевая часть ELC (А1), ассоциированная с регуляторным доменом – лиловым цветом. Области конвертера и SH3домена в моторном домене S1, которые предположительно могут являться сайтами для взаимодействия с N-концом А1 [71, 76], выделены золотым цветом. ADP, расположенный в нуклеотид-связывающем центре S1, показан красным цветом. Предполагаемое расположение N-концевого сегмента А1 показано толстой черной линией. Желтые кружки обозначают позиции остатков Cys (Cys40 и Cys6) в N-концевом сегменте A1, которые в данном исследовании были модифицированы флуоресцентной меткой 1,5-IAEDANS (донор). Тонкие черные стрелки соответствуют измеренным методом FRET расстояниям от флуоресцентно меченных остатков Cys в N-концевом сегменте А1 (Cys40 или Cys6) до TNP-ADP, связанного с активным центром АТРазы S1 .

Предполагаемые межмолекулярные и внутримолекулярные взаимодействия Nконцевого сегмента А1 в процессе АТРазного цикла миозиновой головки .

Завершая эту главу «Результатов», рассмотрим те внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия, в которых может участвовать N-концевой сегмент A1 в процессе АТРазного цикла миозиновой головки как в присутствии, так и в отсутсвие актина. Эти взаимодействия схематически изображены на рис. 37. В состоянии сильного связывания миозина с актином во время ATPазного цикла, когда миозиновая головка не содержит нуклеотид или содержит связанную сегмент ADP, N-концевой A1 взаимодействует с актиновым филаментом (с соседним актиновым мономером относительно того, с которым связывается моторный домен головки), создавая на миозиновой головке дополнительный актин-связывающий участок и повышая прочность ее связывания с актиновым филаментом [34, 65, 71] (рис. 37А). Когда миозиновая головка связывает АТР во время АТРазного цикла, она подвергается глобальной конформационной перестройке и диссоциирует от актинового филамента. Совершенно очевидно, что при этом N-концевой сегмент A1 также должен отсоединиться от актина, и любые его контакты с актином должны предотвращаться в процессе связывания и гидролиза АТР. Мы предполагаем, что это осуществляется путем внутримолекулярного взаимодействия N-концевого сегмента A1 с миозиновой головкой, предположительно с ее моторным доменом (рис. 37Б). Таким образом, в присутствии актина можно предположить два главных взаимодействия, в которых участвует N-концевой сегмент А1 в процессе АТРазного цикла: он взаимодействует либо с актином (в состоянии “сильного” связывания миозина с актином в отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP), либо с моторным доменом миозиновой головки (когда она связывает ATP и диссоциирует от актина) .

Рис. 37. Схематическое представление предполагаемых внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий, в которых участвует N-концевой сегмент A1 в процессе АТРазного цикла миозиновой головки как в присутствии, так и в отсутствие актина. А,Б – Взаимодействия в присутствии актина: при сильном связывании головки с актином в присутствии ADP (А) и при диссоциации головки от актинового филамента в присутствии ATP (Б). В,Г – Состояния N-концевого сегмента A1 в молекуле S1(А1) в отсутствие актина: в присутствии ADP (В) и в тройном комплексе S1-ADP-BeFx (Г) .

Актин показан зеленым цветом, моторный домен головки изображен как желтый овал, Cконцевая часть А1 показана синим цветом, а N-концевой сегмент А1 представлен в виде толстой черной линии. Красный кружок показывает положение нуклеотид-связывающего центра в моторном домене S1. Подробнее см. в тексте .

Рассмотрим теперь, что же происходит с N-концевым сегментом A1 в растворе S1(А1) в отсутствие актина (рис. 37В,Г). В отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP этот сегмент (по крайней мере, его положительно заряженный N-конец) находится слишком далеко от того участка в моторном домене собственной молекулы S1, с которым он может взаимодействовать в процессе АТРазного цикла (рис. 37В). При этом он может, по-видимому, взаимодействовать с таким участком моторного домена другой молекулы S1, что отражается в необычной агрегации S1(A1) (рис. 30, 33, 34а). Такая агрегация полностью предотвращается в комплексе S1-ADP-BeFx (рис. 31), имитирующем промежуточное состояние ATPазной реакции S1 – S1*-AТP, т.е. то самое состояние, в котором N-концевой сегмент A1 предположительно взаимодействует с моторным доменом миозиновой головки в процессе АТРазного цикла (рис. 37Б,Г). Это внутримолекулярное взаимодействие, которое может играть важную роль при функционировании головки в качестве молекулярного мотора, вызывается, по-видимому, глобальными конформационными перестройками, происходящими в головке при связывании и гидролизе ATP и приводящими к сближению N-концевого сегмента А1 с моторным доменом головки вследствие поворота регуляторного домена относительно моторного домена .

В заключение хочется сказать, что полученные нами результаты подтверждают гипотезу о взаимодействии N-концевого сегмента А1 с моторным доменом головки миозина, которое может происходить в процессе АТРазного цикла и играть важную роль в молекулярном механизме сокращения скелетных и сердечных мышц. Это согласуется с результатами исследований поляризованной флуоресценции S1, содержащего A1, флуоресцентно меченую по N-концу, в которых было продемонстрировано значительное увеличение анизотропии флуоресценции при добавлении ATP, что, по мнению авторов, подразумевало взаимодействие N-конца A1 с тяжелой цепью S1, которое приводило к иммобилизации флуоресцентной метки [77]. С другой стороны, наши результаты несколько противоречат данным, свидетельствующим о взаимодействии N-концевого сегмента А1 с областями конвертера [76] или SH3-домена [71] моторного домена S1 в отсутствие АТР, то есть в условиях, когда он должен связываться с актином .

Представляется более вероятным, что во время АТРазного цикла N-концевой сегмент А1 может взаимодействовать либо с актином (в отсутствие нуклеотидов или в присутствии ADP), либо с моторным доменом головки миозина (в присутствии АТР) (см. рис. 37), и эти взаимодействия могут играть важную роль в тонкой настройке правильного функционирования актомиозиновой системы в скелетных и сердечных мышцах .

Заключение Результаты наших исследований позволяют расширить представления о функциях «существенных» легких цепей миозина (ELC) в процессе работы головки миозина в качестве молекулярного мотора. Так, нами было показано, что в процессе АТРазного цикла, когда происходит поворот регуляторного домена миозиновой головки относительно моторного домена, С-концевая область ELC, связанная с регуляторным доменом головки, образует контакт с ее моторным доменом. По-видимому, такое взаимодействие ELC с моторным доменом миозиновой головки позволяет головкам миозина временно зафиксироваться в конформационном состоянии, необходимом для их «слабого» связывания с актином в процессе АТРазного цикла .

Другая часть нашей работы была посвящена изучению роли дополнительного Nконцевого сегмента ELC (А1) в функционировании головки миозина в качестве молекулярного мотора. Известно, что при взаимодействии головки миозина с актином этот сегмент А1 также связывается с актином, образуя дополнительный контакт головки на актине, что позволяет ей развивать большую силу сокращения. Нами впервые были измерены расстояния от N-концевого дополнительного сегмента ELC (A1) до F-актина .

Полученные результаты подтверждают ранее высказанные предположения о том, что взаимодействие этого сегмента с актином может происходить при физиологических значениях ионной силы и играть важную роль при взаимодействии миозина с актином в процессе мышечного сокращения .

Одной из главных задач работы являлась экспериментальная проверка гипотезы о том, что в процессе АТРазной реакции может происходить взаимодействие уникального дополнительного N-концевого сегмента «существенной» легкой цепи А1 с моторным доменом миозиновой головки. С использованием целого ряда методов и подходов нам удалось получить достаточно убедительные, на наш взгляд, экспериментальные подтверждения этой гипотезы. Это взаимодействие, которое вызывается, по-видимому, глобальными конформационными перестройками, происходящими в головке миозина при связывании и гидролизе ATP и приводящими к сближению N-концевого сегмента А1 с моторным доменом головки вследствие поворота регуляторного домена относительно моторного домена, может играть важную роль при функционировании миозиновой головки в качестве молекулярного мотора .

Полученные результаты исследований позволяют сделать следующие выводы:

1. Показано, что формирование стабильных тройных комплексов изолированной головки миозина (субфрагмент 1 миозина, S1) с ADP и аналогами Pi – S1-ADP-BeFx и S1ADP-AlF4, имитирующих главные интермедиаты АТРазной реакции S1 – S1-ATP и S1ADP-Pi, приводит к резкому повышению термостабильности регуляторного домена S1 .

Это свидетельствует о взаимодействии между регуляторным доменом (точнее – ассоциированной с ним ELC) и моторным доменом S1. Такое взаимодействие подтверждается резким снижаением расстояния между активным центром АТРазы в моторном домене S1 и C-концевой частью ELC, ассоциированной с регуляторным доменом, при формировании комплекса S1-ADP-BeFx

2. В комплексах S1(А1) (т.е. препарата S1, содержащего А1 – изоформу ELC с дополнительным N-концевым сегментом) c F-актином определены расстояния между остатками Cys в разных местах N-концевого сегмента А1 и Cys374 в актине. Показано, что при физиологических значениях ионной силы эти расстояния снижаются в зависимости от положения остатка Cys в N-концевом сегменте А1 и достигают самых низких значений (менее 2,5 нм) для остатков Cys, расположенных поблизости от N-конца этого сегмента .

Таким образом, взаимодействие N-концевого сегмента A1 с актином может происходить при физиологических значениях ионной силы и играть важную роль при взаимодействии головок миозина с актином в процессе мышечного сокращения .

–  –  –

4. Показано, что формирование комплекса S1-ADP-BeFx резко снижает расстояния от остатков цистеина в N-концевом сегменте A1 до активного центра АТРазы в моторном домене S1. Эти данные подтверждают предположение о том, что в процессе АTPазного цикла происходит взаимодействие N-концевого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки .

Список используемой литературы

Левицкий, Д.И. Актомиозиновые системы биологической подвижности// Биохимия – 1 .

2004. – Т. 69. – С. 1447-1462 .

2. Kachur, T., Pilgrim, D. Myosin assembly, maintenance and degradation in muscle: Role of the chaperone UNC-45 in myosin thick filament dynamics// Int. J. Mol. Sci. – 2008, – V .

9, P. 1863–1875 .

Поглазов, Б.Ф., Левицкий, Д.И. Миозин и биологическая подвижность// Изд-во 3 .

“Наука”, Москва – 1982, – С. 162 .

4. Engelhardt, V.A., Ljubimova, M.N. Myosine and adenosinetriphosphatase// Nature – 1939,

– V.144, – P. 668–669 .

5. Kominz, D.R., Hough, A., Symonds, P., Laki, K. The amino acid composition of some purified proteins // Biochem. Biophys. Acta – 1954, – V. 84, – P. 342 .

Поглазов, Б.Ф., Структура и функции сократительных белков//. Изд-во «Наука», 6 .

Москва – 1965 .

7. Lowey, S., Slayter, H.S., Weeds, A.G., Baker, H. Substructure of the myosin molecule. I .

Subfragments of myosin by enzymic degradation // J. Mol. Biol. – 1969, – V. 42, – P. 1– 29 .

8. Kachur, T., Pilgrim, D. Myosin assembly, maintenance and degradation in muscle: Role of the chaperone UNC-45 in myosin thick filament dynamics // Int. J. Mol. Sci. – 2008, – V .

9, – P. 1863–1875 .

9. Cheney, R., Mooseker, M. Unconventional myosins // Curr. Opin. Cell Biol. – 1992, – V .

4, – P. 7-35 .

10. Uyeda T., Abramson, P., Spudich, J. The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement// Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1996, – V. 93, – P. 4459Vale, R.D. The molecular motor toolbox for intracellular transport // Cell. – 2003, – V .

112, – P. 467-480 .

12. Betapudi, V. Life without double-headed non-muscle myosin II motor proteins// Front .

Chem. – 2014, – V. 2, – P. 45 .

13. Richards, T.A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes// Nature – 2005, – V. 436, – P. 1113–1118 .

14. Berg, J.S., Powell, B.C., Cheney, R.E. A millennial myosin census // Mol. Biol. Cell – 2001, – V. 12, –P. 780–794 .

15. Golomb, E., Ma, X., Jana, S. S., Preston, Y. A., Kawamoto, S., Shoham, N. G., et al .

Identication and characterization of nonmuscle myosin II-C, a new member of the myosin II family // J. Biol. Chem. – 2004, – V. 279, – P. 2800–2808 .

16. Rodgers, B.D. Insulin-like growth factor-I downregulates embryonic myosin heavy chain (eMyHC) in myoblast nuclei// Growth Horm. IGF. Res. – 2005, – V. 15, – P. 377–383 .

17. Betapudi, V., Rai, V., Beach, J.R., Egelhoff T. Novel regulation and dynamics of myosin II activation during epidermal wound responses // Exp. Cell Res. – 2010, –V. 316, – P. 980– 991 .

18. Betapudi, V., Egelhoff, T.T. Roles of an unconventional protein kinase and myosin II in amoeba osmotic shock responses // Trafc – 2009, – V. 10, – P. 1773–1784 .

19. Conti, M.A., Adelstein, R.S. Nonmuscle myosin II moves in new directions // J. Cell Sci. – 2008, – V. 121, – P. 11–18 .

20. Toyoshima, Y.Y., Kron, S.J., McNully, E.M., Niebling, K.R., Toyoshima, C., Spudich, J.A. Myosin subfragment-1 is sufficient to move actin filaments in vitro // Nature – 1987 – V. 328, – P. 536–539 .

21. Rayment, I., Rypniewski, W., Schmidt-Base, K., Smith, R., Tomchick, D., Benning, M., Winkelmann, D., Wesenberg, G., Holden, H. Three-dimentional structure of myosin subfragment 1: A molecular motor // Science – 1993, – V. 261, – P. 50-58 .

22. Heissler, S.M. Sellers, J.R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks // Bioarchitecture – 2014, – V. 4, – P. 169-88 .

Левицкий, Д.И. Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения 23 .

// Успехи биол. химии – 1986, – V. 27, – P. 74-101 .

24. Wagner, P.D., Giniger, E. Hydrolysis of ATP and reversible binding to F-actin by myosin heavy chains free of all light chains// Nature – 1981, – V. 292, – P. 560-562 .

25. Hernandez, O.M., Jones, M., Guzman, G., Szczesna-Cordary, D. Myosin essential light chain in health and disease // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2007, – V. 292, – P .

1643–1654 .

26. Wu, C.C., Yang, J.T. Reexamination of the conformation of muscle proteins by optical activity // Biochemistry – 1976, – V. 15, – P. 3007-3014 .

27. Houdusse, A, Cohen, C. Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2 A resolution: implications for regulation // Structure – 1996, – V. 4, – P. 21–32 .

28. Buckingham, M, Kelly, R, Tajbakhsh, S, Zammit, P. The formation and maturation of skeletal muscle in the mouse: the myosin MLC1F/3F gene as a molecular model // Acta Physiol. Scand/ – 1998, – V. 163, – P. 3–5 .

29. Kelly, R, Alonso, S, Tajbakhsh, S, Cossu, G, Buckingham, M. Myosin light chain 3F regulatory sequences confer regionalized cardiac and skeletal muscle expression in transgenic mice // J. Cell Biol. – 1995, – V. 129, – P. 383–396 .

30. Cummins, P, Price, K.M, Littler, W.A. Foetal myosin light chain in human ventricle // J .

Muscle Res. Cell Motil. – 1980, – V. 1, – P. 357–366 .

31. Morano, I. Tuning the human heart molecular motors by myosin light chains // J. Mol .

Med. – 1999, – V. 77, – P. 544–555 .

32. Prince, H.P., Trayer, H.R, Henry, G.D., Trayer, I.P., Dalgarno, D.C., Levine, B.A., Cary, P.D., Turner, C. Proton nuclear-magnetic-resonance spectroscopy of myosin subfragment 1 isoenzymes // Eur. J. Biochem. – 1981, – V. 121, – P. 213-219 .

33. Kurabayashi, M., Komuro, I., Tsuchimochi, H., Takaku, F., Yazaki, Y. Molecular cloning and characterization of human atrial and ventricular myosin alkali light chain cDNA clones // J. Biol. Chem. – 1988, – V. 263, – P. 13930–13936 .

34. Timson, D.J., Trayer, H.R., Trayer, I.P. The N-terminus of A1-type myosin essential light chains binds actin and modulates myosin motor function // Eur. J. Biochem. – 1998, – V .

255, – P. 654–662 .

35. Yamashita, H., Sugiura, S., Fujita, H., Yasuda, S., Nagai, R., Saeki, Y., Sunagawa, K., Sugi, H. Myosin light chain isoforms modify force-generating ability of cardiac myosin by changing the kinetics of actin-myosin interaction // Cardiovasc. Res. – 2003, – V. 60, – P .

580–588 .

36. Morano, M., Zacharzowski, U., Maier, M, Lange, P.E., Alexi-Meskishvili, V., Haase, H., Morano, I. Regulation of human heart contractility by essential myosin light chain isoforms // J. Clin. Invest. – 1996, – V. 98, – P. 467–473 .

37. Abdelaziz, A., Segaric, J., Bartsch, H., Petzhold, D., Schlegel, W.P., Kott, M., Seefeldt, I., Klose, J., Bader, M., Haase, H., Morano, I. Functional characterization of the human atrial essential myosin light chain (hALC-1) in a transgenic rat model // J. Mol. Med. – 2004, – V. 82, – P. 265–274 .

38. Smyczynski, C., Kasprzak, A.A. Effect of nucleotides and actin on the orientation of the light chain-binding domain in myosin subfragment 1 // Biochemistry – 1997, – V. 36, – P .

13201-13207 .

39. Diffee, G.M., Seversen, E.A., Stein, T.D., Johnson, J.A. Microarray expression analysis of effects of exercise training: increase in atrial MLC-1 in rat ventricles // Am. J. Physiol .

Heart Circ. Physiol. – 2003, – V. 284, – P. 830–837 .

40. Khalina, Y.N., Bartsch, H., Petzhold, D., Haase, H., Podlubnaya, Z.A., Shpagina, M.D., Morano, I. Reconstitution of ventricular myosin with atrial light chains 1 improves its functional properties// Acta Biochim. Pol. – 2005, – V. 52, – P. 443–448 .

41. Spirito, P., Bellone, P., Harris, K.M., Bernabo, P., Bruzzi, P., Maron, B.J. Magnitude of left ventricular hypertrophy and risk of sudden death in hypertrophic cardiomyopathy // N .

Engl. J. Med. – 2000, – V. 342, – P. 1778–1785 .

42. Richard, P., Charron, P., Carrier, L., Ledeuil, C., Cheav, T., Pichereau, C., Benaiche, A., Isnard, R., Dubourg, O., Burban, M., Gueffet, J.P., Millaire, A., Desnos, M., Schwartz, K., Hainque, B., Komajda, M. Hypertrophic cardiomyopathy: distribution of disease genes, spectrum of mutations, and implications for a molecular diagnosis strategy // Circulation – 2003, – V. 107, – P. 2227-2232 .

43. Olson, T.M., Karst, M.L., Whitby, F.G., Driscoll, D.J. Myosin light chain mutation causes autosomal recessive cardiomyopathy with mid-cavitary hypertrophy and restrictive physiology // Circulation – 2002, – V. 105, – P. 2337-2340 .

44. Poetter, K., Jiang, H., Hassanzadeh, S., Master, S.R., Chang, A., Dalakas, M.C., Rayment, I., Sellers, J.R., Fananapazir, L., Epstein, N.D. Mutations in either the essential or regulatory light chains of myosin are associated with a rare myopathy in human heart and skeletal muscle // Nat. Genet. – 1996, – V. 13, – P. 63-69 .

45. Jay, A., Chikarmane, R., Poulik, J., Misra, V.K. Infantile hypertrophic cardiomyopathy associated with a novel MYL3 mutation // Cardiology – 2013, – V. 124, – P. 248-251 .

46. Lee, W., Hwang, T.H., Kimura, A., Park, S.W., Satoh, M., Nishi, H., Harada, H., Toyama, J., Park, J.E. Different expressivity of a ventricular essential myosin light chain gene Ala57Gly mutation in familial hyper-trophic cardiomyopathy // Am. Heart J. – 2001, – V .

141, – P. 184–189 .

47. Morita, H., Rehm, H.L., Menesses, A., McDonough, B., Roberts, A.E., Kucherlapati, R., Towbin, J.A., Seidman, J.G., Seidman, C.E. Shared genetic causes of cardiac hypertrophy in children and adults // N. Engl. J. Med. – 2008, – V. 358, – P. 1899–1908 .

48. Yuan, C.C., Kazmierczak, K., Liang, J., Kanashiro-Takeuchi, R., Irving, T.C., Gomes, A.V., Wang, Y., Burghardt, T.P., Szczesna-Cordary, D. Hypercontractile mutant of ventricular myosin essential light chain leads to disruption of sarcomeric structure and function and results in restrictive cardiomyopathy in mice // Cardiovasc. Res. – 2017, – V .

113, – P. 1124-1136 .

49. Huang, W., Szczesna-Cordary, D. Molecular mechanisms of cardiomyopathy phenotypes associated with myosin light chain mutations // J. Muscle Res. Cell Motil. – 2015, – V. 36,

– P. 433-45 .

50. Lossie, J., Ushakov, D.S., Ferenczi, M.A., Werner, S., Keller, S., Haase, H., Morano, I .

Mutations of ventricular essential myosin light chain disturb myosin binding and sarcomeric sorting // Cardiovasc. Res.- 2012, – V. 93, – P. 390–396 .

51. Lossie, J., Kehncke, C., Mahmoodzadeh, S., Steffen, W., Canepari, M., Maffei, M., Taube, M., Larchevque, O., Baumert, P., Haase, H., Bottinelli, R., Regitz-Zagrosek, V., Morano, I. Molecular mechanism regulating myosin and cardiac functions by ELC // Biochem .

Biophys. Res. Commun. – 2014, – V. 450, – P. 464–469 .

52. Weeds, A.G., Taylor, R.S. Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin // Nature – 1975, – V. 257, – P. 54-56 .

53. Trayer, H.R., Trayer, I.P. Fluorescence resonance energy transfer within the complex formed by actin and myosin subfragment 1. Comparison between weakly and strongly attached states // Biochemistry – 1988, – V. 27, – P. 5718–5727 .

Ушаков, Д.С. Структура и функция существенной легкой цепи миозина// Биофизика 54 .

– 2008, – V. 53, – P. 950-955 .

55. Wagner, P.D., Stone, D.B. Myosin heavy chain-light chain recombinations and interactions between the two classes of light chains // J. Biol. Chem. – 1983, – V. 258, – P. 8876-8882 .

56. Winstanley, M.A., Trayer, H.R., Trayer, I.P. Role of the myosin light chains in binding to actin // FEBS Lett. – 1977, – V. 77, – P. 239-242 .

57. Wagner, P.D., Weeds, A.G. Studies on the role of myosin alkali light chains .

Recombination and hybridization of light chains and heavy chains in subfragment-1 preparations//. J. Mol. Biol. – 1977, – V. 109, – P. 455-473 .

58. Chalovich, J.M., Stein, L.A., Greene, L.E., Eisenberg, E. Interaction of isozymes of myosin subfragment 1 with actin: effect of ionic strength and nucleotide // Biochemistry – 1984, – V. 23, – P. 4885-4889 .

59. Poole, K.J., Lorenz, M., Evans, G., Rosenbaum, G., Pirani, A., Craig, R., Tobacman, L.S., Lehman, W., Holmes, K.C. A comparison of muscle thin lament models obtained from electron microscopy reconstructions and low-angle X-ray bre diagrams from non-overlap muscle // J. Struct. Biol. – 2006, – V. 155, – P. 273–284 .

60. Sutoh, K. Identification of myosin-binding sites on the actin sequence // Biochemistry – 1982, – V. 21, – P. 3654-3661 .

61. Yamamoto, K, Sekine, T. Interaction of alkali light chain 1 with actin: effect of ionic strength on the cross-linking of alkali light chain 1 with actin // J. Biochem. – 1983, – V .

94, – P. 2075-2078 .

62. Henry, G.D., Winstanley, M.A., Dalgarno, D.C., Scott, G.M., Levine, B.A., Trayer, I.P .

Characterization of the actin-binding site on the alkali light chain of myosin // Biochim .

Biophys. Acta – 1985, – V. 830, – P. 233-243 .

63. Milligan, R.A., Whittaker, M., Safer D. Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites // Nature – 1990, – V. 348, – P. 217–221 .

64. Timson, D.J., Trayer, H.R., Smith, K.J., Trayer, I.P. Size and charge requirements for kinetic modulation and actin binding by alkali 1-type myosin essential light chains // J .

Biol. Chem. - 1999, – V. 274, – P. 18271–18277 .

65. Hayashibara, T., Miyanishi, T. Binding of the amino-terminal region of myosin alkali 1 light chain to actin and its effect on actin-myosin interaction // Biochemistry – 1994, – V .

33, – P. 12821-12827 .

66. Morano, I., Ritter, O., Bonz, A., Timek, T., Vahl, C.F., Michel, G. Myosin light chain-actin interaction regulates cardiac contractility // Circ. Res. – 1995, – V. 76, – P. 720–725 .

67. Potter, J. D. Preparation of troponin and its subunits // Methods Enzymol. – 1982. – V. 85 (Part B). – P. 241263 .

68. Rarick, H.M., Opgenorth, T.J., von Geldern, T.W., Wu-Wong, J.R., Solaro, R.J. An essential myosin light chain peptide induces supramaximal stimulation of cardiac myobrillar ATPase activity // J. Biol. Chem. – 1996, – V. 271, – P. 27039–27043 .

69. Abillon, E., Bremier, L., Cardinaud, R. Conformational calculations on the Ala14-Pro27 LC1 segment of rabbit skeletal myosin // Biochim. Biophys. Acta. – 1990, – V. 1037, – P .

394-400 .

70. Aydt, E.M., Wolff, G., Morano, I. Molecular modeling of the myosin-S1(A1) isoform // J .

Struct. Biol. – 2007, – V. 159, – P. 158-63 .

71. Lowey, S., Saraswat, L.D., Liu, H., Volkmann, N., and Hanein, D. Evidence for an interaction between the SH3 domain and the N-terminal extension of the essential light chain in class II myosins // J. Mol. Biol. – 2007, – V. 371, – P. 902–913 .

72. Andreev, O.A., Boreido, J. Binding of heavy-chain and essential light-chain 1 of S1 to actin depends on the degree of saturation of F-actin filaments with S1 // Biochemistry – 1995, – V. 34, – P. 14829–14233 .

Valentin-Ranc, С., Carlier, M.-F. Characterization of oligomers as kinetic intermediates in 73 .

myosin subfragment 1-induced polymerization of G-actin // J. Biol. Chem. – 1992, – V .

267, – P. 21543–21550 .

74. Tokunaga, M., Suzuki, M., Saeki, K., and Wakabayashi, T. Position of the amino terminus of myosin light chain 1 and light chain 2 determined by electron microscopy with monoclonal antibody // J. Mol. Biol. – 1987, – V. 194, – P. 245–255 .

75. Labbe, J.P., Audemard, E., Bertrand, R., Kassab, R. Specific Interactions of the alkali light chain 1 in skeletal myosin heads probed by chemical cross-linking // Biochemistry – 1986,

– V. 25, – P. 8325–8330 .

76. Pliszka, B., Redowicz, M.J., Tokowski, D. Interaction of the N-terminal part of the A1 essential light chain with the myosin heavy chain // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001, – V. 281, – P. 924–928 .

77. Borejdo, J., Ushakov, D.S., Moreland, R., Akopova, I., Reshetnyak, Y., Saraswat, L.D., Kamm, K., Lowey, S. The power stroke causes changes in the orientation and mobility of the termini of Essential light chain 1 of myosin // Biochemistry – 2001, – V. 40, – P. 3796Mrakovcic-Zenic, A., Oriol-Audit, C., Reisler, E. On the alkali light chains of vertebrate skeletal myosin. Nucleotide binding and salt-induced conformational changes // Eur. J .

Biochem. – 1981, – V. 115, – P. 565–570 .

79. Levitsky, D.I., Nikolaeva, O.P., Vedenkina, N.S., Shnyrov, V.L., Golitsina, N.L., Khvorov, N.V., Permyakov, E.A., Poglazov, B.F. The effect of alkali light chains on the thermal stability of myosin subfragment 1 // Biomed. Sci. – 1991, – V. 2, – P. 140–146 .

Марков Д.И., Николаева О.П., Левицкий Д.И. Влияние «существенной» легкой цепи 80 .

А1 миозина на агрегационные свойства миозиновой головки // Acta Naturae – 2010, – Т. 2(5), – С. 77–81 .

81. Trayer, H.R., Trayer, I.P. Differential binding of rabbit fast muscle myosin light chain isoenzymes to regulated actin // FEBS Lett. – 1985, – V. 180, – P. 170–173 .

82. Jiang, P., Song, J., Gu, G., Slonimsky, E., Li, E., Rosenthal, N. Targeted deletion of the MLC1f/3f downstream enhancer results in precocious MLC expression and mesoderm ablation // Dev. Biol. – 2002, – V. 243, – P. 281–293 .

83. VanBuren, P., Waller, G.S., Harris, D.E., Trybus, K.M., Warshaw, D.M., Lowey, S. The essential light chain is required for full force production by skeletal muscle myosin // Proc .

Natl. Acad. Sci. USA – 1994, – V. 91, – P. 12403–12407 .

84. Wagner, P.D., Slater, C.S., Pope, B., Weeds, A.G. Studies on the actin activation of myosin subfragment-1 isoezymes and the role of myosin light chains// Eur. J. Biochem. – 1979, – V. 99, – P. 385394 .

85. Sweeney, H.L., Kushmerick, M.J., Mabuchi, K., Sreter, F.A., Gergely, J. Myosin alkali light chain and heavy chain variations correlate with altered shortening velocity of isolated skeletal muscle fibers // J. Biol. Chem. – 1988, – V. 263, – P. 9034–9039 .

86. Kazmierczak, K., Xu, Y., Jones, M., Guzman, G., Hernandez, O.M., Kerrick, W.G., Szczesna-Cordary, D. The role of the N-terminus of the myosin essential light chain in cardiac muscle contraction // J. Mol. Biol. – 2009, – V. 387, – P. 706–725 .

87. Haase, H., Dobbernack, G., Tunnemann, G., Karczewski, P., Cardoso, C., Petzhold, D., Schlegel, W.P., Lutter, S., Pierschalek, P., Behlke, J., Morano, I. Minigenes encoding Nterminal domains of human cardiac myosin light chain-1 improve heart function of transgenic rats // FASEB J. – 2006, – V. 20, – P. 865–873 .

88. Milligan, R.A. Protein-protein interactions in the rigor actomyosin complex/ / Proc. Natl .

Acad. Sci. USA – 1996, – V. 93, – P. 21-26 .

89. Dominguez, R., Freyzon, Y., Trybus, K.M., Cohen, C. Crystal structure of a vertebrate

smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain:

visualization of the pre-power stroke state // Cell – 1998, – V. 94, – P. 559–571 .

90. Billington, N., Revill, D.J., Burgess, S.A., Chantler P.D., Knight, P.J. Flexibility within the heads of muscle myosin-2 molecules // J. Mol. Biol. – 2013, –V. 426, – P. 894-907 .

Левицкий Д.И. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии 91 .

для структурно-функциональных исследований мышечных белков // Успехи биол .

химии – 2004, – Т. 44, – С. 133-170 .

92. Levitsky, D.I., Shnyrov, V.L., Khvorov, N.V., Bukatina, A.E., Vedenkina, N.S., Permyakov, E.A., Nikolaeva, O.P., Poglazov, B.F. Effects of nucleotide binding on thermal transitions and domain structure of myosin subfragment 1 // Eur. J. Biochem. – 1992, – V. 209, – P. 829-835 .

93. Bobkov, A.A., Khvorov, N.V., Golitsina, N.L., Levitsky, D.I. Calorimetric characterization of the stable complex of myosin subfragment 1 with ADP and beryllium fluoride // FEBS Lett. – 1993, – V. 332, – P. 64–66 .

94. Turoverov, K.K.; Haitlina, S.Yu.; Pinaev, G.P. Ultra-violet fluorescence of actin .

Determination of native actin content in actin preparations // FEBS Lett. – 1976, – V. 62, – P. 4–6 .

95. Turoverov, K.K.; Kuznetsova, I.M. Intrinsic fluorescence of actin // J. Fluoresc. – 2003, – V. 13, – P. 41–57 .

96. Markov, D.I., Zubov, E.O., Nikolaeva, O.P., Kurganov, B.I., Levitsky, D.I. Thermal denaturation and aggregation of myosin subfragment 1 isoforms with different essential light chains// Internat. J. Mol. Sci. – 2010, – V. 11, – P. 4194–4226 .

97. Marsh, D.J., Lowey, S. Fluorescence energy transfer in myosin subfragment-1 // Biochemistry – 1980, – V. 19, – P. 174-184 .

98. Moss, D.J., Trentham, D.R. Distance measurement between the active site and cysteineof the alkali one light chain of subfragment 1 from rabbit skeletal muscle // Biochemistry – 1983, – V. 22, – P. 5261-5270 .

99. Takashi, R. Fluorescence energy transfer between subfragment-1 and actin points in the rigor complex of actosubfragment-1// Biochemistry, – 1979, – V. 18(23), – P. 5164-5169 .

100. Trayer, H.R., Trayer, I.P. Fluorescence energy transfer between the myosin subfragment-1 isoenzymes and F-actin in the absence and presence of nucleotides// Eur. J. Biochem. – 1983, – V. 135, – P. 47-59 .

101. Miki, M., Wahl, P. Fluorescence energy transfers between points in acto-subfragment-1 rigor complex // Biochim. Biophys. Acta – 1984, – V. 790, – P. 275-283 .

102. Dos Remedios, C.G., Cooke, R. Fluorescence energy transfer between probes on actin and probes on myosin // Biochim. Biophys. Acta – 1984, – V. 788, – P. 193-205 .

103. Bhandari, D.G., Trayer, H.R., Trayer, I.P. Resonance energy transfer evidence for two attached states of the actomyosin complex // FEBS Lett. – 1985, – V. 187, – P. 160-166 .

104. Guhathakurta, P., Prochniewicz, E., Thomas, D.D. Amplitude of the actomyosin power stroke depends strongly on the isoform of the myosin essential light chain // Proc. Natl .

Acad. Sci. USA – 2015, – V. 112, – P. 4660–4665 .

105. Guhathakurta, P., Prochniewicz, E., Roopnarine, O., Rohde, J.A., Thomas, D.D. A cardiomyopathy mutation in the myosin essential light chain alters actomyosin structure // Biophys. J. – 2017, – V. 113, – P. 91-100 .

106. Potter, J. D. Preparation of troponin and its subunits // Methods Enzymol. – 1982. – 85 (Part B). – P. 241263 .

107. Zaager, S., Burke, M. Temperature and ionic strength dependence of the subunit interactions in vertebrate skeletal myosin. A comparison of the interaction between the alkali light and heavy chains of mammalian and avian myosin // J. Biol. Chem. – 1988, – V. 263, – P. 13891–13895 .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 44, 4, 2010 УДК576.895.1: 598.2 СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА ТРЕМАТОДОФАУНЫ СЕРЕБРИСТОЙ ЧАЙКИ (LARUS ARGENTATUS PONTOPP.) КОЛЬСКОГО ЗАЛИВА © В. В. Куклин, М. М . Куклина, Н. Е. Кисова Мурманский морской б...»

«Бюллетень Союза по сохранению сайгака Saiga News зима 2007/08: Выпуск 6 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Культурный обмен между Великобританией и Калмыкией стал Содержание источником вдохновения для всех участников В мае-ию...»

«Афонин А.Н., Соколова Ю.В. Эколого-географический анализ и моделирование распространения биологических объектов с использованием ГИС Учебное пособие (Практикум) УДК 91 ББК 26.17 А94 Одобрено Учебно-методической комиссии Института наук о Земле Санкт-Петербургского государственного университета 21 ноября 2...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г.ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра уголовного, экологического права и кримин...»

«Saiga News лето 2006: Выпуск 3 Рисунок В. Смирина Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Открытие визит-центра в сайгачьем питомнике "Яшкульский" Содержание 15 мая 200...»

«ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН Том 8, № 1, 2012, стр. 47–53 БИОЛОГИЯ УДК 569.61(1-924.8) ДЕЙНОТЕРИИ (MAMMALIA, PROBOSCIDEA) В ПОЗДНЕТРЕТИЧНЫХ БИОМАХ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ Академик Г....»

«тов, например, мороженое с использованием натуральных сливок из коровьего молока, сахара, а из стабилизаторов муки или крахмала. С другой стороны, традиционные виды сырья в настоящее время могут быть подвержены нежела...»

«© С.Н. Молчанов. CODEX ROSSICA. Культурный КОДЕКС Естественного права (Jus cultura) Европы и Азии. Российский кодекс Jus naturale (cultura Rossica) Нового века и Нового тысячелетия (с комментариями). 2010. – 101 с. Международный институт космической эколо...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ Министерство образования Иркутской области Рабочая программа по факультативу: "Анатомия человека" 8 класс 2015-2016 учебный год Составитель: Жданова Н.В., учитель биологии и химии ГОКУ "Санаторная школа-интернат № 4, первая квалификационная категория Усолье-Сибирское ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Программа элективног...»

«United Nations Development Program – Global Environmental Facility (UNDP-GEF) Black Sea Environmental Programme Black Sea Ecosystems Recovery Project Т.А. Беленко Экологические проблемы Чёрного и Азовского морей – естественнонаучные и социальные аспе...»

«Отделение Пенсионного фонда РФ по Республике Мордовия Новая отчетность в ПФР: "Сведения о страховом стаже застрахованных лиц" (СЗВ-СТАЖ), "Сведения по страхователю, передаваемые в ПФР для ведения индивидуального (персонифицированного) учета" (ОДВ-1). Декабрь 2017 г. Нор...»

«НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2014. – Т. 23, № 4. – С. 61-75. УДК 597.6 (470.43) ОЧЕРК ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ЗЕМНОВОДНЫХ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ (ЧАСТЬ 2. 1991-2013 гг.) © 2014 А.И. Файзу...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2010, Том 19, Экспресс-выпуск 584: 1239-1242 О заселении малой пестрогрудкой Tribura (Dumeticola) davidi восточной окраины Азии: новое, недавнее и изолированное, местонахождение на крайнем западе Уссурийского края А.А...»

«Особенности реализации на физическом факультете ОПОП с использованием ресурсных центров Научного парка СПбГУ на примере образовательной программы "Нейтронная и синхротронная физика" Структура Научного парка СПбГУ Биомедицина и Нанотехнологии здоровье человека и материаловед...»

«АНАЛИЗ спортивно-оздоровительной работы за 2016 – 2017 учебный год Цель методической работы: Развитие личности школьников в процессе овладения ими теоретическими знаниями, формирование у учащихся устойчивых мотивов и потребностей в бережном отношении к своему здоровью, целостном развитии физических и психических качеств, твор...»

«ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СТРУКТУРЫ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ИНСТИТУТЕ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА РАН (к 80-летию создания Института) А.Д. Ноздрачев Начиная с 60-х годов, после избрания директором акад. В.Н. Черниговского, основные направления исследований Института, начатые еще при жизни И.П. Павлова, продолжа...»

«Министерство образования Российской Федерации Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова Кафедра экологии и зоологии Общая экология Методические указания к семинарским занятиям Ярославль 2002 ББК Е9я73 Т99 Составитель: проф. Н.Н. Тяте...»

«О НЕКОТОРЫХ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМАХ ГИДРОХИМИИ И ГИДРОЭКОЛОГИИ В СВЕТЕ РЕАЛИЗАЦИИ ВОДНОЙ СТРАТЕГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПЕРИОД ДО 2020 ГОДА Никаноров А.М. Институт водных проблем Р...»

«Номер: KZ22VCY00075057 Дата: 29.08.2016 “азастан Республикасы Энергетика Республиканское государственное учреждение министрлігі Экологиялы реттеу жне Департамент экологии по Павлодарской баылау комитетіні Павлодар облысы области Комитета экологического бойынша экология департаменті" регулирования и...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ВОДНЫХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИВЭП СО РАН) УТВЕРЖДАЮ: ВрИО директора ИВЭП СО РАН _ д.б.н. А.В. Пузанов "29" апреля 2...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.