WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«Кафедра биохимии Дипломная работа студента 5 курса Матлашова Михаила Егоровича Изучение влияния замен G126A и G126R на физикохимические и функциональные характеристики тропомиозина человека ...»

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Биологический факультет

Кафедра биохимии

Дипломная работа

студента 5 курса

Матлашова Михаила Егоровича

Изучение влияния замен G126A и G126R на физикохимические и функциональные характеристики

тропомиозина человека

Работа выполнена в лаборатории молекулярной

организации биологических структур

Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научные руководители:

д.б.н., профессор Д.И. Левицкий

аспирант И.А. Невзоров Москва 2010 Оглавление Список сокращений

Обзор литературы

1. Структурные основы мышечного сокращения

2. Регуляция мышечного сокращения

3. Тропонин

4. Тропомиозин

4.1 Структурные особенности

4.2 Участки дестабилизации в молекуле тропомиозина

Материалы и методы

1. Приготовление препаратов белков

Получение рекомбинантных препаратов тропомиозина

Получение тропомиозина, меченого N-(1-пирен)йодацетамидом

Выделение тропонина из ацетонового порошка

Выделение актина из ацетонового порошка

Получение F-актина, стабилизированного фаллоидином

Выделение субфрагмента 1 миозина

Определение концентрации белков

2. Ограниченный протеолиз тропомиозина

3. Изучение тепловой денатурации тропомиозина

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии



Метод кругового дихроизма

Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченого тропомиозина

4. Эксперименты по изучению взаимодействия тропомиозина с актином................ 28 Соосаждение тропомиозина с актином

Измерение температурных зависимостей диссоциации тропомиозина с поверхности актиновых филаментов по изменениям светорассеяния........ 28

5. Эксперименты с измерением актин-активируемой ATPазной активности S1...... 29 Определение зависимостей активности S1 от его концентрации в пробе

Определение Ca2+ -чувствительности реконструированного тонкого филамента

Результаты и их обсуждение

1. Гладкомышечный -тропомиозин

Ограниченный протеолиз -тропомиозина

Исследование тепловой денатурации -тропомиозина методом ДСК........... 32 Исследование температурных зависимостей эксимерной флуоресценции пиренил-меченого -тропомиозина

Влияние замены остатка G126 в молекуле гладкомышечного

-тропомиозина на его взаимодействие с актином

Влияние замены остатка G126 в молекуле гладкомышечного

-тропомиозина на кооперативность связывания S1 с тонким филаментом

2. Скелетный -тропомиозин

Ограниченный протеолиз -тропомиозина

Исследование тепловой денатурации скелетного -тропомиозина методом ДСК

Исследование тепловой денатурации скелетного -тропомиозина методом КД

Исследование температурных зависимостей эксимерной флуоресценции пиренил-меченого -тропомиозина

Влияние замены G126 в молекуле -тропомиозина на его взаимодействие с актином

Влияние замены G126 в молекуле -тропомиозина на кооперативность связывания S1 с тонким филаментом

Изучение влияния замены G126R в молекуле скелетного -тропомиозина на Ca-чувствительность регулируемого тонкого филамента

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия;



ДДТ – дитиотриетол;

КД – круговой дихроизм;

АDP – аденозиндифосфат;

АTP – аденозинтрифосфат;

F-актин – фибриллярный актин;

Hepes – 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновая кислота S1 – субфрагмент 1 миозина;

SDS – додецилсульфат натрия;

TLCK – тозил-L-лизин-хлорметилкетон;

TPCK – тозил-L-фенилаланин-хлорметилкетон;

Tris – трис(гидроксиметил)аминоэтан;

Tn – тропонин;

TnI - тропонин-I;

TnC – тропонин С;

TnT – тропонин-Т;

Tm – тропомиозин;

SmTm – тропомиозин гладких мышц;

SkTm – тропомиозин скелетных мышц .

Обзор литературы

Одной из главных характеристик живых систем является биологическая подвижность, в основе которой лежит множество различных молекулярных механизмов .

В эукариотических клетках наиболее распространённой является актомиозиновая система подвижности. Принцип её работы заключается в активном перемещении молекул миозина вдоль актиновых филаментов с использованием энергии гидролиза АТР. Эта система участвует в таких важных функциях как транспорт клеточных структур, деление клеток и т.д. [Lindberg et al., 2008]. В мышечной ткани актомиозиновая система выполняет также уникальную функцию мышечного сокращения, обусловливающую подвижность всего организма животных, а также стенок внутренних органов .

Все мышечные ткани обладают сходным механизмом сокращения, однако в его регуляции имеются различия. Сигналом для инициации сокращения является повышение концентрации ионов Ca2+ в клетке (c 10-7 до 10-5 М) [Гусев, 2000]. Этот сигнал передаётся на регуляторные белки, локализующиеся либо на миозине (миозиновый тип регуляции), либо на актине (актиновый тип регуляции). В результате последующих химических и конформационных превращений регуляторных белков становится возможным взаимодействие молекул актина и миозина, сопровождаемое перемещением тонких (актиновых) и толстых (миозиновых) филаментов друг относительно друга, что и обусловливает сокращение или передвижение клеток .

1. Структурные основы мышечного сокращения .

Мышечная ткань состоит из волокон, основной объём которых занимают миофибриллы, играющие главную роль в мышечном сокращении. Миофибриллы, в свою очередь, состоят из толстых (миозиновых) и тонких (актиновых) филаментов (нитей) .

Тонкий филамент состоит главным образом из актина, а также белков, принимающих участие в модуляции свойств филамента и регуляции мышечного сокращения. Актин представляет собой глобулярный АТР-связывающий белок с молекулярной массой около 43 кДа. Мономеры актина, называемые G-актином, в Ca2+ Mg2+ присутствии ионов или способны при повышении ионной силы полимеризоваться с образованием длинных филаментов При этом (F-актин) .

присоединение каждого мономера сопровождается гидролизом Скорость ATP .

полимеризации актина на разных концах нити различна. Различают быстрорастущий «+»конец и медленнорастущий «–»-конец. В равновесном состоянии добавление мономеров на «+»-конце сопровождается преимущественной диссоциацией мономеров на «–»-конце .





Таким образом, актиновый филамент является динамичной структурой, на свойства которой оказывают влияние как состав среды, в которой происходит полимеризация (наличие ионов двухвалентных металлов и нуклеотидов, ионная сила и т.д.), так и взаимодействия со специфическими актин-связывающими белками [Левицкий и др., 1995] .

Кроме того, F-актин способен взаимодействовать с пептидом фаллоидином, выделенным из бледной поганки (Amanita phalloides). Это взаимодействие стабилизирует нить актина и приводит к необратимости полимеризации [Prentki et al., 1979] .

Толстый филамент состоит в основном из молекул миозина второго типа. Миозин – белок с молекулярной массой около 500 кДа, состоящий из двух тяжёлых и четырёх лёгких цепей. В составе тяжёлой цепи можно выделить N-концевую глобулярную «головку», С-концевой «хвост» и соединяющий их шарнирный участок. Альфаспиральные С-концевые участки тяжёлых цепей закручены друг относительно друга и образуют стержень. В мышечной клетке стержни молекул миозина взаимодействуют, образуя нити, из которых выступают головки миозина. Головка обладает АТРазной активностью и непосредственно отвечает за движение миозина вдоль актинового филамента. При протеолитическом расщеплении миозина химотрипсином можно получить фрагмент, состоящий из головки с «существенной» (или «щелочной») лёгкой цепью (регуляторные лёгкие цепи в этих условиях деградируют) – так называемый субфрагмент 1 миозина (S1), который сохраняет главные свойства миозина – АТРазную активность и способность взаимодействовать с актином, и может быть успешно использован в энзимологических исследованиях [Поглазов, Левицкий, 1982] .

В скелетной и сердечной мышце актиновые и миозиновые филаменты строго упорядочены: «+»-концы актиновых филаментов закреплены в так называемых Z-дисках, тогда как «–»-концы связаны с белком тропомодулином, не дающим актину деполимеризоваться [Костюкова, 2008]. Фрагмент миофибриллы, ограниченный двумя соседними Z-дисками, называется саркомером, в составе которого толстые (миозиновые) филаменты расположены между тонкими (актиновыми) филаментами. Головки миозина, выступающие с поверхности толстых филаментов, имеют возможность напрямую взаимодействовать с актином тонких нитей .

Миозиновая головка, обладая АТРазной активностью, представляет собой уникальный пример преобразователя химической энергии в механическую. Сам по себе миозин гидролизует ATP с очень низкой скоростью, однако она сильно возрастает в присутствии актина. Последовательность событий в ходе цикла АТРазной реакции выглядит следующим образом. После завершения акта гидролиза АТР, миозиновая головка в комплексе с продуктами реакции – ADP и фосфатом – относительно слабо связывается с актином. Это связывание индуцирует выброс фосфата, что, в свою очередь, вызывает изменение конформации миозина. Молекула миозина изгибается в области шарнира, в результате чего происходит перемещение толстого филамента относительно тонкого. При этом возрастает аффинность миозина к актину – осуществляется так называемое «сильное связывание». Диссоциация миозина происходит только после выброса ADP и связывания ATP. [Поглазов, Левицкий, 1982; Левицкий и др., 1995] .

Движение миозиновых нитей вдоль актиновых приводит к сближению Z-дисков и уменьшению длины саркомера. Этот механизм получил название «теории скользящих нитей» .

В гладких мышцах сокращение идёт по такому же механизму, однако актиновые и миозиновые филаменты не организованы в саркомеры .

2. Регуляция мышечного сокращения .

В живых организмах процессы сокращения мышечной ткани должны чередоваться с процессами расслабления. Для этого необходимы регуляторные белки, которые локализуются на актине (актиновый тип регуляции) или на миозине (миозиновый тип регуляции). Миозиновый механизм задействован, главным образом, в гладких мышцах .

При повышении концентрации Ca2+ в клетке активируется кальмодулин-зависимая киназа лёгких цепей миозина. Фосфорилирование лёгких цепей делает возможным связывание миозина с актином .

В скелетной и сердечной мышце основную роль играет более быстрый актиновый тип регуляции, который осуществляется белками тропомиозином и тропонином. В состоянии расслабления, когда концентрация свободного Ca2+ в мышце мала, тропомиозин затрудняет эффективное связывание миозина с актином, стерически блокируя участки их взаимодействия. Во время активации мышечного сокращения происходит повышение концентрации кальция в цитозоле мышечной клетки и его связывание с тропониновым комплексом, что, в результате последовательности согласованных конформационных изменений компонентов тонкого филамента, приводит к сдвигу молекулы тропомиозина на поверхности F-актина и делает возможным взаимодействие миозиновых головок с актином. Таким образом, происходит своего рода переключение актинового филамента из заблокированного состояния (состояние «OFF»), соответствующего расслаблению мышечного волокна, в активированное состояние («ON»). Ca-зависимое перемещение молекулы тропомиозина по поверхности актина было подтверждено методами рентгеноструктурного анализа [Holmes et al., 1990], а также с помощью изучения изменения доступности растворителю различных участков тропомиозина в тонком филаменте [Holthauzen et al., 2004] .

Актиновая регуляция в определенной мере характерна и для гладкомышечных клеток, однако ее белковый аппарат отличается от такового в скелетных мышцах .

Функцию, сходную с функцией тропонина, в этом случае выполняет белок кальдесмон [Alahyan et al., 2006] .

В многочисленных исследованиях показано, что тропомиозин привносит кооперативность во взаимодействие миозина и актина. Так, например, на рисунке 1 представлена зависимость активности актин-активируемой АТРазы от его S1 концентрации в пробе [Lehrer & Morris, 1982]. На рисунке видно, что в отсутствие регуляторных белков эта зависимость линейна, однако в присутствии тропомиозина и тропонина кривая АТРазной активности резко уходит вверх при повышении концентрации головок миозина. Причём для проявления этого эффекта необходимо и достаточно наличие тропомиозина в пробе. Таким образом, тропомиозин оказывает двойной эффект на активность АТРазы миозина, подавляя её при низких и активируя при высоких концентрациях S1 .

Рис. 1. Зависимость актин-активируемой ATPазной активности S1 от его концентрации в пробе. Пробы содержат актин в отсутствие регуляторных белков (белые круги), а также в присутствии скелетного тропомиозина (чёрные ромбы), и тропомиозина с тропонином в присутствии (перевёрнутые белые треугольники) и отсутствие Ca2+ (белые треугольники). Из статьи [Lehrer & Morris, 1982] с некоторыми изменениями .

Чтобы объяснить этот эффект, предположили существование не двух (ON и OFF), а, по крайней мере, трёх состояний тонкого филамента, обозначаемых «blocked»

(«блокированное»), «closed» («закрытое») и «open» («открытое») (рис. 2) [Squire & Morris, 1998]. Состояние «blocked» реализуется только при наличии тропонина в отсутствие ионов Ca2+. При этом тропомиозин экранирует участки связывания миозина с актином. При повышении концентрации ионов Ca2+ происходит его связывание с тропонином С, что сопровождается диссоциацией тропонинового комплекса с поверхности актинового филамента. Это позволяет тропомиозину свободно перемещаться на поверхности актина, в свою очередь делая возможным слабое связывание миозиновой головки с актином (состояние «closed») .

После активации миозиновой головки и высвобождения фосфата миозин переходит в состояние сильного связывания, что сопровождается переходом тонкого филамента в состояние «open». При этом связывание новых молекул S1 с тонким филаментом, находящемся в состоянии «open», происходит значительно эффективнее. Таким образом, связывание и активация (т.е. выброс фосфата и переход от слабого связывания к сильному) нескольких миозиновых головок облегчает связывание следующих [Lehrer & Morris, 1982; McKillop & Geeves, 1993] .

Blocked Closed Open

Рис. 2. Схема регуляции актинового типа, включающая три разных состояния тонкого филамента: “blocked”, “closed” и “open”. Цветами обозначены: синий – тропонин, красный – мономеры актина, зелёная полоса – тропомиозин, жёлтые треугольники – миозиновые головки. Из обзора [Squire & Morris, 1998] с некоторыми изменениями .

Следует заметить, что некоторые детали, рассматриваемые в данной модели, по сей день остаются спорными. Так, например, до сих пор неясно, почему при высоких концентрациях S1 его АТРазная активность в отсутствие регуляторных белков (когда все участки связывания миозина на тонком филаменте открыты) ниже, чем в присутствии тропомиозина (рис. 1). Недавно было показано, что актин претерпевает значительные конформационные перестройки при связывании тропомиозина, а также под воздействием тропонинового комплекса и S1, не учитываемые в модели трёх состояний [Borovikov et .

al., 2009]. Вероятно, конформационные изменения актина также вносят свой вклад в кооперативность связывания S1 с тонким филаментом .

В математической форме модель трёх состояний изображена на рисунке 3. Тонкий филамент существует в динамическом равновесии между тремя вышеупомянутыми состояниями, переходы между которыми определяются константами KB (между «blocked»

и «closed») и KT (между «closed» и «open»). Состояние «blocked», как уже упоминалось выше, реализуется только в отсутствие Ca2+, когда тропонин прочно связан с актином; в присутствии Ca2+ KB велика, и филаменты находятся преимущественно в состояниях «closed» или «open» [Maytum et al., 1999] .

Рис. 3. Модель «трёх состояний» регуляции тонкого филамента. Изображен фрагмент тонкого филамента, состоящий из 7 мономеров актина (белые круги), тропомиозина (чёрная полоса) и тропонина (не показан). Данная структурная единица существует в динамическом равновесии между блокированным, закрытым и открытым состояниями, обозначенными различным положением тропомиозина на поверхности актина. Чёрными треугольниками обозначены присоединяющиеся головки миозина. Из статьи [Maytum et al., 1999] с некоторыми изменениями .

Связывание S1 и переход тонкого филамента в состояние «open» определяется, как минимум, четырьмя параметрами. Прежде всего, к ним относятся константа перехода актинового филамента в состояние «open» KT, сродство S1 к актину (определяемая константой K1) и константа перехода миозина в состояние сильного связывания (K2) .

Четвёртым определяющим параметром является величина, обозначающая количество мономеров актина, которые переходят в «открытое» состояние при связывании одной молекулы S1 – так называемая «длина кооперативной единицы» (n). С помощью введения флуоресцентной метки в молекулу тропомиозина и анализа кинетики присоединения и диссоциации S1 с поверхности актинового филамента было показано, что длина кооперативной единицы различна для скелетной (SkTm) и гладкомышечной (SmTm) изоформ тропомиозина [Lehrer et al., 1997]. В случае гладкомышечного тропомиозина при связывании одной молекулы S1 около 9 мономеров актина переходили в открытое состояние, тогда как в случае скелетного тропомиозина – только 5. Полученные результаты были объяснены тем, что молекулы тропомиозина объединяются за счёт концевых взаимодействий в длинные эластичные тяжи (см. ниже) на поверхности актиновых филаментов (Рис. 4). Длина кооперативной единицы в этом случае определяется гибкостью самих молекул тропомиозина, а также силой концевых взаимодействий между соседними мономерами. Действительно, изучение зависимостей вязкости растворов гладкомышечного и скелетного тропомиозинов от ионной силы показало, что SmTm обладает более прочными концевыми взаимодействиями, нежели SkTm. Более того, добавление тропонина увеличивало длину кооперативной единицы SkTm до 10–12 мономеров актина [Geeves, Lehrer, 1994]. Возможно, это происходит потому, что тропонин, связываясь с тропомиозином, перекрывает концевые участки тропомиозина, стабилизируя таким путем его концевые взаимодействия с соседними мономерами .

Рис. 4. Схематическая диаграмма перемещения тропомиозина между «закрытым» и «открытым» состояниями. В случае слабых концевых взаимодействий (вверху) длина кооперативной единицы была бы близка к числу актиновых мономеров в структурной единице тонкого филамента, т.е. 7. Благодаря сильным концевым взаимодействиям (внизу) длина кооперативной единицы может иметь разные значения – от 7 до 21 – в зависимости от гибкости молекулы тропомиозина. Из статьи [Lehrer et al., 1997] .

Нарушения регуляторного аппарата тонкого филамента, вызываемые, в частности, некоторыми мутациями в молекуле тропомиозина, ассоциированы с целым рядом тяжелых наследственных заболеваний [Gunning et al., 2008]. Наиболее подробно изучены мутации тропомиозина, ассоциированные с такими заболеваниями, как немалиновые миопатии, дистальные артрогрипозы и кардиомиопатии .

После рассмотрения механизма регуляции мышечного сокращения, перейдём к более подробному рассмотрению структуры и свойств регуляторных белков скелетных мышц – тропонина и тропомиозина .

3. Тропонин .

Тропонин (Tn) представляет собой комплекс трёх белков – тропонина Т (TnT), тропонина С (TnC) и тропонина I (TnI). В тонком филаменте на семь мономеров актина приходится один тропониновый комплекс [Filatov et al., 1999] .

Тропонин I – белок с молекулярной массой около 21 кДа, играющий ключевую роль в ингибировании ATPазной активности миозина в отсутствие Ca2+. В принципе, TnI способен проявлять ингибирующую активность даже в отсутствие двух других элементов комплекса. В отсутствие тропомиозина максимальное ингибирование наблюдается при соотношении Aктин:TnI = 1:1, тогда как в его присутствии – 7:1 [Perry, 2001] .

Тропонин С – белок с молекулярной массой около 18 кДа. Он состоит из двух глобулярных доменов (N- и С-концевой домены), каждый из которых содержит по два центра связывания двухвалентных металлов. Участки связывания металлов N-концевого домена Ca2+-специфичны; считается, что именно они отвечают за регуляцию активации сокращения. Тропонин C взаимодействует как с TnT, так и с TnI, причём взаимодействие с TnI является Ca2+-зависимым .

Тропонин Т – белок с молекулярной массой около 30 кДа, обладающий высоким сродством к тропомиозину. Он является необходимым компонентом для связывания тропонинового комплекса с тонким филаментом в правильной пропорции и ориентации .

При протеолитическом расщеплении TnT образуются два фрагмента: длинный Nконцевой фрагмент TnT1 и С-концевой фрагмент TnT2, связывающий TnI и TnC. Оба фрагмента могут связываться с С-концевым участком тропомиозина; фрагмент TnT1 перекрывает область контакта концевых остатков двух соседних молекул тропомиозина .

Было показано, что фрагмент TnT1 также способен подавлять актин-активируемую активность миозина, однако в меньшей степени, чем нативный тропониновый комплекс [Maytum et al., 2002] .

В двух словах механизм работы тропонинового комплекса заключается в следующем. В состоянии мышечного расслабления тропонин прочно связан с актином и тропомиозином и ингибирует ATPазную активность миозина. При активации мышечного сокращения N-концевой домен TnC связывает Ca2+ и претерпевает конформационные перестройки. При этом он связывает специальный регуляторный участок TnI. Это, в свою очередь, вызывает перестройки белка TnI, сопровождающиеся потерей его сродства к актину, а также изменения в структуре TnT. В итоге тропониновый комплекс теряет способность сдерживать молекулу тропомиозина на поверхности тонкого филамента, и в результате перемещения тропомиозина по поверхности актина происходит открывание участков связывания миозина [Vinogradova et al., 2007] .

–  –  –

4.1. Структурные особенности .

Теперь перейдём к рассмотрению структуры и свойств другого регуляторного белка

– тропомиозина .

Тропомиозины (Tm) – семейство фибриллярных димерных актин-связывающих белков, обладающих 100%-ой -спиральной структурой [Perry, 2001], присутствующие практически во всех типах эукариотических клеток (в мышечной ткани, дрожжах, тромбоцитах, клетках мозга и т.д.). По количеству аминокислотных остатков все тропомиозины разделяются на две группы: 1) тропомиозины с высокой молекулярной массой (HMW), содержащие от 281 до 284 аминокислотных остатков; 2) тропомиозины с низкой молекулярной массой (LMW), состоящие из 245–251 аминокислотных остатков .

Мышечные тропомиозины относятся к группе HMW, в то время как немышечные – преимущественно к группе LMW .

В геноме млекопитающих обнаружено 4 гена, с которых происходит экспрессия около 20 изоформ тропомиозина благодаря альтернативному сплайсингу и наличию альтернативных промоторов. Эти гены были названы TPM1 (), TPM2 (), TPM3 и TPM4 .

В нашей работе особое внимание было уделено –изоформе скелетномышечного тропомиозина и -изоформе гладкомышечного тропомиозина .

В скелетной мышце тропомиозин составляет примерно 3% от общего количества клеточного белка и в основном представлен - и -изоформами. При этом они существуют как в виде гомодимеров, так и в виде гетеродимеров, преимущественно образуя формы и [Boussouf et al., 2007]. В гладких мышцах тропомиозин более чем на 90% представлен

-гетеродимерами [Perry, 2001] .

Как отмечалось ранее, нативная молекула тропомиозина состоит из двух полипептидных цепей, обладающих 100%-ой -спиральной структурой. В результате взаимодействия двух субъединиц тропомиозина образуется структура типа coiled-coil – левозакрученная “перевитая спираль”, которая характерна не только для тропомиозина, но и для фибриллярного хвостового участка миозина, а также множества других белков (рис .

5). Образование такой структуры возможно благодаря особенностям первичной структуры этих белков. Их аминокислотная последовательность организована в виде повторяющихся мотивов из семи остатков Полипептидная цепь скелетномышечного (гептад) .



тропомиозина состоит из 284 остатков, что эквивалентно 40 гептадам. Если каждой аминокислоте в одной гептаде присвоить латинскую букву, то в положении a и d будут находиться аминокислотные остатки с неполярный радикалами, а в положении e и g – заряженные аминокислоты (рис. 6). Взаимодействия между остатками а и d образуют гидрофобный кор молекулы. Данную структуру дополнительно стабилизируют электростатические взаимодействия заряженных аминокислот в положениях e и g .

Остатки b, c и f экспонированы и могут участвовать во взаимодействии с актином. Таким образом, две правозакрученные -спирали тропомиозина димеризуются, образуя одну левозакрученную спираль [Perry, 2001] .

Рис. 5. Структура молекулы скелетного -тропомиозина. На рисунке обозначены остатки цистеина, находящиеся в разных цепях друг против друга. Из обзора [Perry, 2001] с изменениями .

Кроме того, все молекулы Tm при низкой ионной силе способны полимеризоваться по типу “голова к хвосту” с образованием длинных нитей. Это происходит за счёт так называемых «концевых взаимодействий», в которых принимают участие терминальные 8– 9 аминокислотных остатков обоих концов молекулы. Зависимость от ионной силы можно объяснить электростатической природой этих взаимодействий. Отметим, что для полимеризации скелетного -Tm необходимо ацетилирование N-концевого аминокислотного остатка. Для получения рекомбинантных препаратов тропомиозина данную модификацию имитируют добавлением к N-концевой части Tm дипептида Ala-Ser [Gunning et al., 2008] .

–  –  –

Б Рис. 6. Схема взаимодействий, стабилизирующих coiled-coil-спираль молекулы тропомиозина. Буквы a-g соответствуют положению аминокислотного остатка в составе гептадного повтора. А) взаимодействие двух спиральных цепей Tm; Б) то же в виде линейных аминокислотных последовательностей. N, А и B означают гидрофобные, кислые и основные аминокислоты, соответственно; X – любая аминокислота. Из обзора [Perry, 2001] .

Способность связывать актин является одной из важнейших характеристик тропомиозина. В тонком филаменте на семь мономеров F-актина приходится один димер тропомиозина. Тропомиозин, помимо регуляции сокращения в мышечных клетках, выполняет важную функцию стабилизации тонкого филамента: защищает его от разрезающих и деполимеризующих факторов, подавляет его ветвление, вместе с тропомодулином стабилизирует «–»-конец актинового филамента и т.д. Было показано, что тропомиозин принимает непосредственное участие в регуляции функций актиновых нитей в немышечных клетках, определяя специфический набор актин-связывающих белков для каждого типа филаментов [Gunning et al., 2008] .

Аминокислотная последовательность Tm может быть поделена на участки, богатые остатками глутаминовой кислоты, чередующиеся с участками, бедными отрицательно заряженными аминокислотными остатками. Такие участки называются квазиэквивалентными, поскольку они не идентичны по аминокислотному составу .

Предполагают, что они являются местами связывания тропомиозина с участками актина, богатыми положительно заряженными аминокислотами. В пользу идеи электростатической природы взаимодействий говорит наличие данных о зависимости взаимодействия между актином и тропомиозином от ионной силы [Perry, 2001] .

При введении искусственных делеций [Hitchcock-DeGregori et al., 2002] или замене целых актин-связывающих участков тропомиозина [Singh, Hitchcock-DeGregori, 2007] были получены белки, в большинстве случаев сохранявшие способность связывать актин, но, как правило, теряющие способность к Ca2+-зависимой регуляции, поскольку нарушалось правильное связывание молекул тропонина. Было показано, что некоторые актин-связывающие участки вносят больший вклад в способность тропомиозина связывать актин, по сравнению с другими актин-связывающими участками. Это объяснялось наличием в тропомиозине дестабилизирующих участков, позволяющих белку изгибаться в нескольких местах. Предполагается, что структура coiled-coil сама по себе является слишком жёсткой, и что эти лабильные участки необходимы для принятия молекулой тропомиозина формы, способствующей правильному расположению молекулы на поверхности тонкого филамента (рис. 7) [Holmes, Lehman, 2008] .

4.2. Участки дестабилизации в молекуле тропомиозина .

К одним из таких участков, локально дестабилизирующих структуру тропомиозина, относятся так называемые аланиновые кластеры (рис. 8). Эти участки характеризуются большим содержанием остатков Ala в положениях d спирали coiled-coil [Hitchcock DeGregori, 2008]. Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что из-за небольшого размера боковых групп этих аминокислотных остатков расстояние между спиралями тропомиозина уменьшается, что приводит к нарушению упаковки цепей белка .

Также было показано, что в этих участках могут происходить изгибы молекулы тропомиозина [Nitanai et al., 2007] .

Кроме того, в гептадных повторах могут встречаться неканонические аминокислотные остатки, т.е. полярные остатки в положениях a и d или гидрофобные остатки в положениях e и g. Логично предположить, что наличие таких остатков значительно дестабилизирует coiled-coil структуру тропомиозина .

Примером таких неканонических остатков являются Gly126 и Asp137. В данном случае гидрофобный, дестабилизирующий -спираль оcтаток глицина находится в gположении спирали coiled-coil, а отрицательно заряженный остаток аспартата – в dположении. Снижение стабильности структуры coiled-coil в этом участке молекулы впервые было показано методом трипсинолиза [Pato et. al., 1981]. Несмотря на наличие большого числа мест узнавания трипсином, реакция протеолиза скелетного тропомиозина в стандартных условиях проходила преимущественно по Arg133, поскольку плотная упаковка цепей тропомиозина препятствовала расщеплению молекулы по другим остаткам .

Рис. 7. Схема расположения скелетного -тропомиозина (жёлтый и красный) на поверхности актинового филамента (белые, голубые и синие глобулы) при высоких (а) и низких (b) концентрациях Ca2+. Прозрачная область – реконструкция тонкого филамента, полученная на основании данных рентгеноструктурного анализа. Из обзора [Holmes, Lehman, 2008] .

Рис. 8. Схема расположения участков дестабилизации в молекуле скелетного тропомиозина. Розовыми кругами показаны аланиновые кластеры, зелёными – нарушения гидрофобных взаимодействий между молекулами тропомиозина. Обведены сегменты молекулы, подвергавшиеся рентгеноструктурному анализу. Из статьи [Minakata et al., 2008] с некоторыми изменениями .

Рис. 9. Сравнение плотности упаковки coiled-coil структуры молекулы тропомиозина в районе остатков Leu207 и Asp137. Из статьи [Sumida et al., 2007] .

Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что в данном участке тропомиозина расстояние между его цепями увеличивается и гидрофобные остатки в положениях a и d становятся доступными растворителю, что сильно снижает стабильность всей молекулы (Рис. 9) [Brown et. al., 2005]. Заметим, что этот участок является весьма консервативным среди тропомиозинов как человека, так и других высших позвоночных животных, из чего можно предположить его важность для функционирования этого белка (Рис. 10) .

Рис. 10. Выравнивание фрагментов некоторых тропомиозинов человека, а также крысы, кролика и цыплёнка в программе ClustalW (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2). Слева указаны номера белков в базе данных Uniprot; цифрами по краям последовательностей обозначены номера аминокислотных остатков. Остатки Gly126 и Asp137 помечены рамками .

Ранее было детально исследовано влияние одного из этих остатков, Asp137, на дестабилизацию структуры молекулы, и высказано предположение о его роли в функционировании тропомиозина Для этого получили [Sumida et al., 2007] .

рекомбинантный скелетный -тропомиозин, содержащий замену D137L, с целью стабилизировать центральный участок молекулы. И действительно, мутантный белок проявлял намного более высокую устойчивость к действию трипсина по сравнению с белком дикого типа .

Эксперименты по соосаждению с F-актином не выявили значимых различий в сродстве исследуемых тропомиозинов к актину. Этот результат несколько противоречит теории, согласно которой участки дестабилизации тропомиозина необходимы для связывания с актиновыми филаментами [Holmes, Lehman, 2008] .

Однако значительный эффект исследуемой замены на функциональные характеристики тропомиозина был обнаружен в экспериментах с измерениями АТРазной активности миозина (рис. 11). В отсутствие тропонина, а также в присутствии тропонина и Са2+ актин-активируемая активность S1 в случае мутантного белка была заметно выше, чем в случае тропомиозина дикого типа. При этом Ca2+-чувствительность, т.е .

концентрация Ca2+, при которой происходит переход тонкого филамента из состояния «blocked» в состояние «closed», была одинаковой для двух исследуемых тропомиозинов (Рис. 11А) .

Рис. 11. Эффект замены D137L в молекуле скелетного -тропомиозина на актинактивируемую АТРазную активность S1. A) Ca2+ чувствительность реконструированного тонкого филамента. B) Зависимость активности S1 от его концентрации в пробе без тропонина, а также с тропонином в присутствии и в отсутствие Ca2+. Круглыми символами обозначены пробы, содержащие тропомиозин с остатком D137, квадратными – белок с лейциновой заменой. Из статьи [Sumida et al., 2007] .

В связи с этим авторы предположили, что лабильный участок необходим для придания молекуле тропомиозина достаточной гибкости, необходимой для тонкого регулирования кооперативной активации тонкого филамента миозином .

В нашей лаборатории было уделено внимание другому консервативному неканоническому остатку – Gly126. Как уже упоминалось выше, он находится в gположении структуры тропомиозина, и, вероятно, вносит вклад в coiled-coil дестабилизацию центрального участка молекулы, наравне с остатком D137. Его наличие в данном положении тем более интересно, поскольку известно, что замена 91-го остатка аргинина, также находящегося в положении g, на остаток глицина вызывает значительную дестабилизацию молекулы -тропомиозина [Nevzorov et. al., 2009] и ассоциирована с тяжёлым наследственным заболеванием – дистальным артрогрипозом .

Таким образом, выяснение возможной функциональной роли остатка G126 в тропомиозине человека и явилось главной целью данной работы .

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

Получить рекомбинантные препараты скелетного -тропомиозина и 1) .

гладкомышечного -тропомиозина человека, содержащих замены G126A и G126R .

С помощью методов трипсинолиза, дифференциальной сканирующей 2) .

калориметрии и кругового дихроизма проверить высказанные предположения о стабилизирующем эффекте исследуемых мутаций на молекулу тропомиозина .

Исследовать влияние замен G126A и G126R на способность 3) .

исследуемых изоформ тропомиозина к связыванию с актином .

Исследовать влияние замен остатка G126 на Ca2+-чувствительность 4) .

реконструированного тонкого филамента, а также на зависимость актинактивируемой АТРазной активности S1 от его концентрации в пробе .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

1. Приготовление препаратов белков Получение рекомбинантных препаратов тропомиозина Препараты гладкомышечного -тропомиозина были получены аспирантом И.А .

Невзоровым в лаборатории доктора Чарльза Редвуда (Оксфордский университет, Г .

Оксфорд, Великобритания) .

Для получения рекомбинантного скелетного -тропомиозина как дикого типа, так и содержащего замены G126A и G126R, осуществляли трансформацию клеток E. сoli штамма BL21 (DE3) плазмидами pMW172, содержащими ген тропомиозина под контролем Т7 промотора. После электропорации клетки высевали на чашки Петри с агаром, содержащим ампицилин, и оставляли при 37оС. Далее одну из колоний клеток переносили в колбы, содержащие 50 мл среды LB с ампицилином, и инкубировали в течение ночи при 37оС в инкубаторе с частотой вращения платформы 250 об/мин .

Экспрессию белка инициировали добавлением 0,4 мМ изопропил-1-тио--Dгалактопиранозида (IPTG) и инкубацией в течение 3 ч. Тестовую экспрессию тропомиозина проводили в 50 мл среды LB с ампицилином; пробы бактерий до и после индукции анализировали методом SDS-электрофореза .

Для выделения тропомиозина, 1,5 л клеточной культуры центрифугировали 30 минут при 10000 g и оставляли полученные осадки на ночь при –70оС. Затем клетки размораживали, ресуспендировали в 15 мл лизис-буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, содержащий 25% сахарозы) и подвергали обработке ультразвуком для лучшего разрушения бактериальных клеток. Далее к полученной суспензии добавляли 0,5 мМ PMSF, ~5 мкг/мл ДНКазы 1 и ~2,0 мМ MnCl2 и инкубировали 20 минут при 4оС. После этого в полученную суспензию добавляли равный объём лизис-буфера, содержащего 2 М NaCl, и инкубировали еще 20 минут на льду для деполимеризации тропомиозина и понижения вязкости раствора .

Полученные клеточные лизаты инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10 минут на водяной бане при 80оС, а затем охлаждали на льду. При этом обломки клеточной мембраны и большинство белков E. coli денатурировали и агрегировали, тогда как тропомиозин ренатурировал после нагрева и снова переходил в растворимое состояние. Денатурированные белки удаляли центрифугированием в течение 30 минут при 20000 об/мин в роторе Ti-60 (на центрифуге «Beckman» серии L, США) .

Дальнейшее выделение тропомиозина проводили с помощью изоэлектрического осаждения при pH 4,5, который достигали путём добавления концентрированного Naацетатного буфера (4 М) до конечной концентрации 60 мМ. Суспензию белка центрифугировали 30 минут при 20000 об/мин (ротор Ti-60); осадок тропомиозина ресуспендировали в 10 мл буфера А (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ -МЭ), содержащего 6 М мочевину, и диализовали против того же буфера без мочевины в течение ночи .

Дальнейшую очистку тропомиозина проводили на хроматографической колонке HiTrapTM Q (GE Healthcare) c помощью хроматографической системы Varian ProStar. На колонку наносили 10 мл раствора белка. Колонку промывали буфером А, затем осуществляли градиентную элюцию в интервале 0–1000 мМ NaCl со скоростью 3 мл/мин .

Фракции объёмом 3 мл анализировали с помощью SDS-электрофореза в 14% полиакриламидном геле. Фракции, содержащие наиболее очищенный белок, объединяли и подвергали изоэлектрическому осаждению для концентрирования препарата. На финальной стадии проводили диализ против 30 мМ Hepes-NaOH, pH 7,3, содержащего 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2. Пробы хранили при –70оС .

Перед проведением экспериментов тропомиозин восстанавливали путём добавления 8 мМ -МЭ (в случае экспериментов по изучению тепловой денатурации) или 4 мМ ДТТ и инкубации в течение 45 минут при 60оС .

Получение тропомиозина, меченого N-(1-пирен)йодацетамидом

Приготовление пиренил-меченого тропомиозина осуществляли по методике, исходно предложенной Ш. Лерером и соавт. [Ishii & Lehrer, 1990], с некоторыми модификациями. Для этого сначала 1 мл тропомиозина с концентрацией ~1,5 мг/мл восстанавливали 4 мМ ДТТ в течение 45 минут при 60оС. Затем проводили его изоэлектрическое осаждение, добавляя концентрированный Na-ацетатный буфер, рН 4,5, до конечной концентрации 80 мМ. Полученную суспензию инкубировали 10 минут при 4оС и центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин. Осадок белка растворяли в 1 мл 30 mM Hepes, pH 7,3, не содержащем восстановителя. Процедуру изоэлектрического осаждения повторяли два раза .

Осадок, полученный после третьего осаждения, растворили в мл 0,8 денатурирующего буфера, содержащего 30 мM Hepes, pH 7,3, 5 М гуанидин гидрохлорид и 1 мM MgCl2. Используя универсальный индикатор, доводили рН раствора белка до ~8,0–9,0 добавлением небольшого количества 6 М NaOH. Далее к раствору тропомиозина добавляли 10-кратный молярный избыток пирен-йодацетамида (Molecular Probes), свежерастворенного в диметилформамиде, оборачивали пробирку фольгой и оставляли на ночь при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Для удаления свободной метки пробу центрифугировали и проводили диализ супернатанта (2 смены) против буфера, содержащего 30 мM Hepes, pH 7,3, 100 мM NaCl и 1 мM MgCl2 .

Концентрацию меченого белка определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкции 344 = 2,2,104.М-1.см-1. Общую концентрацию белка определяли с помощью набора реактивов «BCA protein assay» («Thermo scientific»). Во всех случаях выход меченого белка составлял около 100 % .

Выделение тропонина из ацетонового порошка .

Тропонин был получен из ацетонового порошка мышц кролика аспирантом И.А .

Невзоровым. Выделение тропонина проводилось параллельно с выделением актина из ацетонового порошка .

Выделение актина из ацетонового порошка [Spudich, Watt, 1971] .

Ацетоновый порошок был ранее приготовлен сотрудниками лаборатории из мышц кролика. К навеске ацетонового порошка (1,0–1,5 г) добавляли 20 мл буфера G (2 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,2 мМ АТР, 0,2 мМ CaCl2, 0,5 мM -МЭ) и проводили экстракцию на льду в течение 45 минут при постоянном перемешивании. Нерастворенные остатки тканей удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 20000 об/мин в роторе Ti-60. Актин, содержащийся в супернатанте, полимеризовали постепенным добавлением при постоянном перемешивании растворов KCl и MgCl2 до конечных концентраций 50 мМ и 2 мМ, соответственно. После 2 часов инкубации при 4оС добавляли KCl до конечной концентрации 0,6 М. Раствор белка оставляли на несколько часов при 4оС .

Полимеризованный актин собирали центрифугированием в роторе Ti-75 при 30000 об/мин в течение 2 часов. Осадок ресуспендировали в нескольких миллилитрах буфера G и измельчали в гомогенизаторе Поттера. Полученный раствор диализовали в течение двух дней против трёх смен буфера G для постепенной деполимеризации актина. Последний диализ осуществляли против буфера G, содержащего 0,1 мМ NaN3. Остатки полимеризованного F-актина удаляли центрифугированием в роторе Ti-75 при 30000 об/мин в течение 2 часов. Собирали супернатант и хранили до трёх недель при 4оС .

Получение F-актина, стабилизированного фаллоидином .

Для получения филаментов F-актина, мономерный G-актин разводили буфером G до концентрации 1,5 мг/мл, добавляли MgCl2 до конечной концентрации 5 мМ и инкубировали при комнатной температуре 30 мин .

Для получения F-актина, стабилизированного фаллоидином, G-актин разводили буфером G до концентрации 4,2 мг/мл (100 мкM), добавляли фаллоидин до концентрации 133 мкМ и MgCl2 до конечной концентрации 5 мМ и инкубировали при комнатной температуре 30 мин .

Выделение субфрагмента 1 миозина (S1) .

Миозин, полученный ранее из скелетных мышц кролика, хранили при –20оС в 50% глицерине. К 2 мл раствора миозина (~20 мг/мл) добавляли 10-кратный избыток холодной деионизованной воды и инкубировали 10 минут при 4оС. Образовавшиеся при пониженной ионной силе агрегаты миозина осаждали центрифугированием (20 минут при охлаждении в роторе Ti-60, скорость 20000 об/мин). К осадку добавляли 0,5 мл 2 М NaCl, затем 0,5 мл буфера разглицеринизации (20 мМ NaH2PO4, 0,5 М NaCl, рН 7,0) и размешивали до полного растворения миозина. Затем добавляли холодную воду до 10кратного избытка, инкубировали 10 минут и снова центрифугировали 20 минут при тех же условиях. После центрифугирования осадок вновь растворяли в 0,5 мл 2 М NaCl и 0,5 мл буфера разглицеринизации. Формировали миозиновые филаменты, диализуя раствор миозина при 4оС против буфера следующего состава: 20 мМ NaH2PO4, pH 7,0, 0,12 M NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ .

Приготовление осуществляли методом ограниченного химотрипсинолиза S1 миозина [Weeds, Taylor, 1975] .

Переваривание миозиновых филаментов -химотрипсином, обработанным ингибитором трипсина TLCK, проводили при весовом соотношении химотрипсин/миозин, равном 1/250. Протеолиз осуществляли в диализном буфере в течение 10 минут при температуре 25oC при постоянном перемешивании; реакцию останавливали добавлением 0,1 мМ раствора PMSF в этиловом спирте. Объем раствора PMSF составлял 1/500 от объема инкубационной среды. Переваренный препарат миозина центрифугировали 30 минут в роторе Ti-75 при 30000 об/мин. После центрифугирования препарат диализовали против буфера следующего состава: 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,3, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ДТТ и 0,1 мМ PMSF. После диализа суспензию центрифугировали 30 минут при тех же условиях для удаления нерастворимых продуктов переваривания .

Супернатант диализовали против буфера 30 мМ Hepes (pH 7,3), содержащего 1 мМ MgCl2 .

По окончании диализа раствор белка центрифугировали при 30000 об/мин в роторе Ti-60 .

Дальнейшая очистка S1 проводилась на хроматографической колонке HiTrapTM Q (GE Healthcare) c помощью хроматографической системы Varian ProStar. На колонку наносили 10 мл раствора белка. Колонку промывали буфером, содержавшим 10 мМ Hepes, pH 7,0, 0,1 мМ ДТТ, 0,1 мМ PMSF и 1 мМ MgCl2; затем осуществляли градиентную элюцию в интервале 0–1000 мМ NaCl со скоростью 3 мл/мин .

Фракции объёмом 3 мл анализировали с помощью SDS-электрофореза в 14% полиакриламидном геле. Полученный препарат S1 диализовали против 10 мМ HepesNaOH (pH 7,3), содержащего 50 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2 .

Определение концентрации белков .

Концентрацию белков определяли с помощью набора реактивов «BCA protein assay»

(Thermo scientific) с использованием бицинхониновой кислоты, позволяющего определять от 2 до 40 мкг белка в пробе объёмом 50 мкл. Концентрацию белка определяли по калибровочному графику, полученному для раствора БСА известной концентрации .

2. Ограниченный протеолиз тропомиозина

Для проведения ограниченного протеолиза использовали трипсин, обработанный ингибитором химотрипсина TPCK. Реакцию проводили в 30 мM буфере Hepes-NaOH, pH 7,3, содержащем 100 мM NaCl и 1 мM MgCl2. К раствору белка (0,66 мг/мл) добавляли раствор трипсина (0,2 мг/мл в 1 мM HCl) до весового соотношения 1/250. Трипсинолиз проводили при 25оС в течение часа, отбирая равные аликвоты через определенные промежутки времени. Реакцию останавливали добавлением к аликвоте равного объема 2кратного буфера для образцов (0,125 M Трис-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 40% глицерин, 0,004% бромфеноловый синий, 5% -ME). Пробы анализировали с помощью SDS-электрофореза в 16% полиакриламидном геле по методу Лэммли [Laemmli, 1970] .

3. Изучение тепловой денатурации тропомиозина Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) .

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (производства Института биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Измерения проводили при скорости нагрева 1 градус в минуту в диапазоне температур от 15С до 70С. Для предотвращения возможного дегазирования растворов при повышении температуры, в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 2–2,5 атмосферы. Калибровочная мощность W составляла 25 мкВт .

Пробы, содержащие 1,0 мг/мл тропомиозина и 8 мМ -МЭ помещали в опытную ячейку, а контрольный буфер (30 мM Hepes, pH 7,3, 100 мM NaCl и 1 мM MgCl2) – в ячейку сравнения. Осуществляли несколько съёмок до тех пор, пока полученные в результате последних съёмок кривые денатурации тропомиозина не совпадали практически полностью. Затем проводили т. н. «обратные» или «реверсные» съёмки, когда та же проба с белком помещалась в ячейку сравнения, а буфер – в опытную ячейку .

Далее из кривой, полученной при прямой съёмке, вычитали кривую, полученную при обратной съёмке. Этот подход, ранее разработанный в нашем научном коллективе [Kremneva et al., 2006], позволял избежать артефактов, вызываемых вычитанием инструментальной базовой линии, и удвоить белковый сигнал. Затем результирующую кривую делили на два для получения реального значения этого сигнала .

Процедуру деконволюции кривых теплопоглощения на отдельные тепловые переходы проводили по методу [Freire & Biltonen, 1978] с использованием программы «Origin 1.16» (MicroCal). Вкратце, суммарную эндотерму с помощью функции наименьших квадратов разлагали на несколько независимых переходов, подчиняющихся закону распределения Гаусса. Другими словами, эта программа позволяла определить количество независимых двухстадийных тепловых переходов (калориметрических доменов), участвующих в формировании суммарной кривой тепловой денатурации тропомиозина. Было показано, что для адекватного описания кривых ДСК вполне хватало, как правило, трех независимых калориметрических доменов, для каждого из которых определялись параметры калориметрической энтальпии (Hcal), дающей представление о величине поглощаемой энергии, и температуры максимума тепловых переходов (Tm) .

Метод кругового дихроизма (КД)

Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области записывали на дихрографе Chirascan Circular Dichroism Spectrometer (Applied Photophysics) при 20оС в кварцевой кювете с длиной оптического пути 0,2 мм .

Температурные зависимости средней остаточной эллиптичности при 222 нм (222) регистрировали в интервале от 5оС до 60оС при скорости нагрева 1оС/мин, т. е. при той же скорости нагрева, что и в калориметрических исследованиях. Концентрация тропомиозина в пробе составляла 1 мг/мл; измерения проводили в том же буфере, что и в экспериментах методом ДСК .

Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченоготропомиозина

Метод измерения эксимерной флуоресценции основан на способности пиренилйодацетамидной мекти образовывать возбуждённые димеры – так называемые эксимеры .

Эти эксимеры излучают флуоресценцию при длине волны 485 нм, тогда как мономерная метка – при 390 нм. Поскольку цепи в димерах тропомиозина располагаются параллельно, остатки цистеина (Cys36 гладкомышечного и Cys190 скелетного тропомиозинов) двух мономеров белка располагаются друг напротив друга. При денатурации же цепи тропомиозина расходятся, и расстояние между остатками цистеина увеличивается. Таким образом, по тушению эксимерной флуоресценции меченого пиренил-йодацетамидом тропомиозиина можно наблюдать его тепловую денатурацию [Nevzorov et.al, 2008] .

Эксперименты проводились на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse фирмы оборудованном термоприставкой для поддержания Varian (Австралия), постоянной заданной скорости нагрева. Пробы объёмом 0,5 мл содержали 1–20 мкМ меченого белка в буфере следующего состава: 30 мМ Hepes-NaOH, pH 7,3, 100 мМ NaCl (если не оговорено особо) и 1 мМ MgCl2. Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 5 мм; эксимерную флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 340 нм и регистрировали при 485 нм. Эксперименты проводили, нагревая образец белка от 10оС до 65оС с постоянной скоростью, равной 1oC/мин .

4. Эксперименты по изучению взаимодействия тропомиозина с актином Соосаждение тропомиозина с актином .

Для определения сродства различных препаратов тропомиозина к актину готовили пробы объёмом 100 мкл, содержащие 10 мкМ F-актин, стабилизированный фаллоидином, а также 0,0–6,0 мкМ тропомиозин, в буфере 30 мМ Hepes-NaOH, рН 7,3, содержащем 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2. Пробы инкубировали 30 минут при комнатной температуре, затем центрифугировали 30 минут при 100000g (Airfuge TL100A, Beckman). Осадок растворяли в исходном объеме буфера, затем к супернатанту и осадку добавляли 100 мкл буфера для образцов, инкубировали 5 минут при 90оС и исследовали белковый состав супернатантов и осадков с помощью SDS-электрофореза в 14%-м полиакриламидном геле по методу Лэммли. Для определения количества белка гели сканировали (сканер Umax Astra 6700) и анализировали с помощью пакета программного обеспечения Matlab R2006b (Mathworks Inc.) .

Измерение температурных зависимостей диссоциации тропомиозина с поверхности актиновых филаментов по изменениям светорассеяния Температурные зависимости диссоциации комплексов F-актин-тропомиозин, вызванной постепенным нагревом, регистрировали по изменению светорассеяния под углом в 90о [Wegner, 1979]. Метод основан на возрастании светорассеяния тонких филаментов пропорционально количеству тропомиозина, связанного с актином. После диссоциации комплекса Тm–F-актин в результате нагрева величина светорассеяния становилась равной светорассеянию свободного F-актина, так как свободный Тm практически не демонстрирует собственного светорассеяния. Таким образом, температурная зависимость снижения величины светорассеяния комплекса Тm–F-актин отражает диссоциацию Тm с поверхности актиновых филаментов .

Измерения проводили при длине волны 350 нм при нагреве от 30оС до 65оС с постоянной скоростью 1оС/мин на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Пробы содержали 20 мкМ F-актин, стабилизированный фаллоидином, и 15 мкМ тропомиозин. Параллельно регистрировали светорассеяние пробы не F-актина, содержащей тропомиозин. Кривые диссоциации комплексов F-актина с тропомиозином, а также температурные зависимости светорассеяния свободного F-актина, анализировали с помощью программного обеспечения «Origin 7.0» (MicroCal) .

5. Эксперименты с измерением актин-активируемой ATPазной активности S1 Определение зависимостей активности S1 от его концентрации в пробе Определение зависимости актин-активируемой ATPазной активности S1 от концентрации S1 осуществляли следующим образом. В пробирки, содержащие реакционный буфер (10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,3, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ДТТ и 0,1 мМ PMSF), добавляли F-актин и тропомиозин так, чтобы их конечные концентрации в пробах составляли 4 мкМ и 1 мкМ, соответственно. Пробы затем инкубировали 20 минут при комнатной температуре, после чего в них добавляли S1 до конечных концентраций 0–15 мкМ. Реакцию инициировали добавлением ATP до конечной концентрации 5 мМ .

Конечный объём проб составлял 50 мкл. Пробы быстро перемешивали и инкубировали 10 мин при 25оС. Затем реакцию останавливали добавлением равного объёма (50 мкл) 5% HClO4 и центрифугировали пробы 5 минут при 10000 об/мин на центрифуге MPW-310 (Польша) .

Активность S1 в супернатанте определяли путём измерения концентрации неорганического фосфата (Pi) [Panusz et al., 1970]. Для этого 30 мкл супернатанта разводили до 300 мкл, добавляя по 135 мкл реакционного буфера и 5% HClO4. Затем в пробы добавляли 0,47 мл 5,4 М натрий-ацетатного буфера (рН 4,0), содержащего 0,5% CuSO4, и 0,38 мл свежеприготовленной смеси (1:1) 5%-го водного раствора молибдата аммония и 5%-го водного раствора Na2SO3, содержащего 0,2% метола. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали 40 минут при 25оС. Развивающуюся синюю окраску регистрировали при длине волны 860 нм на спектрофотометре Cary-100 (Varian) .

Концентрацию неорганического фосфата определяли по калибровочному графику .

Определение Ca2+ -чувствительности реконструированного тонкого филамента

Приготовили ряд 10 мМ Ca2+/EGTA буферов с pCa от 4,5 до 8,5. Отношения Ca/EGTA, необходимые для достижения определённого pCa, рассчитывали с помощью программы MaxChelator; при этом делалась поправка на ионную силу раствора и температуру. Концентрацию исходного раствора кальция определяли с помощью колориметрического метода, основанного на образовании окрашенного комплекса ионов кальция с комплексоном арсеназо III. Для построения калибровочного графика использовали стандартный раствор нитрата кальция (Merck) .

Определение Ca2+-чувствительности тонкого филамента осуществляли в пробах объёмом 50 мкл, содержащих 4 мкМ F-актин, 2 мкМ тропонин, 1 мкМ скелетный тропомиозин и 2 мкМ S1. В пробирки добавляли реакционный буфер (см. выше), все белки, кроме S1, а также Ca2+/EGTA буфер до конечной концентрации 1 мМ, затем инкубировали 20 минут при комнатной температуре, после чего добавляли S1. Реакцию инициировали добавлением ATP до конечной концентрации 5 мМ. Пробы быстро перемешивали и инкубировали 10 мин при 37оС; реакцию останавливали добавлением 50 мкл 5% HClO4. Далее пробы центрифугировали и определяли концентрацию Pi в 50 мкл супернатанта (см. выше) .

Результаты и их обсуждение

Чтобы исследовать влияние остатка Gly126 на структуру тропомиозина были получены белки, содержащие замены Gly126Ala и Gly126Arg. В первом случае остаток Gly, обладающий дестабилизирующим влиянием на -спирали белков, заменили на остаток Ala, не препятствующий образованию -спиральной структуры. Во втором случае осуществляли замену на остаток Arg, который может образовать ионную связь с остатком Glu131, находящемся в положении e следующего по цепи гептадного повтора. Таким образом, в случае замены G126R ожидается дополнительная стабилизация молекулы .

На первом этапе работы мы проводили исследования, подтверждающие гипотезу о том, что замены G126A и G126R приводят к стабилизации молекулы тропомиозина. Затем мы проводили эксперименты с целью определения возможного значения остатка G126 для выполнения наиболее важных функций тропомиозина – связывания актина и регуляции мышечного сокращения .

Изначально исследования в данной работе проводились на гладкомышечном тропомиозине. Однако затем полученные на гладкомышечной изоформе результаты было решено дополнить экспериментами на скелетном -тропомиозине. Это было сделано по нескольким причинам. Во-первых, поскольку остаток является G126 высококонсервативным среди тропомиозинов человека, было бы интересно сравнить результаты, полученные на разных изоформах. Во-вторых, большинство структурных и функциональных исследований было проведено к настоящему времени именно на скелетном -тропомиозине. Такова, в частности, работа группы Шервина Лерера [Sumida et. al., 2007] (см. выше), и поскольку исследованный ими остаток D137 находится на небольшом расстоянии от остатка G126, исследуемом в нашей работе, сопоставление результатов двух работ может оказаться весьма продуктивным .

1. Гладкомышечный -тропомиозин (-SmTm) .

Ограниченный протеолиз -тропомиозина Для предварительной оценки эффекта замены остатка G126 на стабильность молекулы тропомиозина его подвергли воздействию трипсина. Как уже упоминалось ранее, в молекуле тропомиозина имеется много мест узнавания трипсином, однако, благодаря плотной упаковке структуры coiled-coil, реакция протеолиза в стандартных условиях проходит преимущественно по центральному участку молекулы, а именно по остатку Arg133 .

Рис. 12. Трипсинолиз гладкомышечного -тропомиозина дикого типа (wt), а также содержащего замены G126A и G126R. Реакцию проводили при 25оС при весовом соотношении трипсин/тропомиозин, равном 1/250. Об эффективности протеолиза судили по уменьшению интенсивности окрашивания полос геля, соответствующих нерасщеплённому тропомиозину (отмечены пунктиром) .

Мы предположили, что стабилизация центрального участка молекулы тропомиозина должна значительно ограничить его доступность для протеолиза трипсином. И действительно, в случае тропомиозина дикого типа практически весь белок расщепляется за 60 минут, тогда как в случае белка с заменами G126A и G126R реакция трипсинолиза практически не идёт (рис 12.). Это говорит о том, что обе замены – как G126A, так и G126R – стабилизируют центральный участок молекулы тропомиозина, и этот стабилизирующий эффект распространяется на остаток Arg133 .

Аналогичные данные были получены в группе Ш. Лерера при замене остатка D137 в скелетном -тропомиозине [Sumida et. al., 2007]. Это говорит о том, что оба остатка, G126 и D137, участвуют в образовании лабильного центрального участка молекулы тропомиозина, что в свою очередь является ещё одним аргументом в пользу гипотезы о необходимости этого нестабильного участка для функционирования различных изоформ тропомиозина .

Исследование тепловой денатурации -тропомиозина методом ДСК .

Для дальнейшего изучения влияния замены остатка G126 на стабильность тропомиозина методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) были проведены эксперименты по изучению тепловой денатурации исследуемых белков. После вычитания химической базовой линии, полученные кривые теплопоглощения подвергались деконволюции, т.е. разложению на несколько одностадийных обратимых переходов, соответствующих плавлению отдельных кооперативных участков в молекуле – так называемых калориметрических доменов. Результаты данного анализа представлены на рис. 13. Температуры максимумов пиков (Tm), а также значения калориметрической энтальпии тепловых переходов (Hcal), рассчитанные как площадь под пиком, представлены в таблице 1 .

–  –  –

Кривые теплопоглощения -тропомиозина были разложены на 3 калориметрических домена: низкокооперативный домен с Tm ~35oC и два высококооперативных домена с Tm ~40–42oC и ~47–49оС. Ранее было высказано предположение, что первый из них соответствует кооперативному плавлению N-концевого участка молекулы, а другой – Сконцевого участка [Nevzorov et. al., 2008]. Наличие же низкотемпературного перехода с максимумом в области ~35oC свидетельствует о том, что некоторые участки молекулы тропомиозина начинают медленно плавиться с низкой кооперативностью уже при низкой температуре (ниже 30oC) .

Табл. 1. Калориметрические характеристики (Tm и Hcal) для отдельных доменов, полученных при разложении кривых теплопоглощения -SmTm на индивидуальные тепловые переходы. В скобках указаны значения Hcal для отдельных переходов, выраженные в % от общего значения энтальпии .

–  –  –

Как видно из таблицы 1, обе замены остатка G126 стабилизируют молекулу тропомиозина, причём происходит увеличение термостабильности как 2-го, так и 3-го калориметрических доменов. Замена G126A вызывает увеличение Tm 2-го и 3-го переходов на ~1,5oC и ~0,9 oC, соответственно, а замена G126R – на ~1,6oC и ~2,7oC .

Также интересно, что в случае мутантных белков сильно уменьшается энтальпия некооперативного низкотемпературного перехода, при этом заметно увеличивается вклад энтальпии домена 2 в общую энтальпию тепловой денатурации тропомиозина (табл. 1) .

Можно предположить, что стабилизированные в результате мутации участки тропомиозина начинают плавиться совместно с N-концевым калориметрическим доменом (домен 2), увеличивая тем самым теплопоглощение 2-го перехода. Следует, однако, иметь в виду, что точное определение энтальпии низкокооперативного плавления тропомиозина при низких температурах представляет собой достаточно сложную задачу, решить которую зачастую не удаётся ввиду некоторых особенностей метода .

Таким образом, замена G126 на стабилизирующий остаток приводит к увеличению термостабильности всей молекулы тропомиозина, причём, как и ожидалось, замена G126R вызывает больший стабилизирующий эффект, чем замена G126A .

Исследование температурных зависимостей эксимерной флуоресценции пиренилмеченого -тропомиозина .

–  –  –

Рис. 14. Температурные зависимости интенсивности эксимерной флуоресценции для -SmTm wt (зелёная кривая), G126A (синяя кривая) и G126R (красная кривая), измеренной при 485 нм. Длина волны возбуждения 340 нм. Концентрация белков составляла ~20 мкМ, скорость прогрева 1оС/мин .

Чтобы оценить стабилизирующее влияние замены остатка G126, мы измеряли температуру, при которой наблюдалось уменьшение интенсивности эксимерной флуоресценции вдвое. Она оказалась равна 45,0оС, 46,5оС и 48оС для wt, G126A и G126R

-Tm, соответственно. Таким образом, мы получили ещё одно подтверждение того, что замены G126A и G126R стабилизируют молекулу тропомиозина. Более того, поскольку метка присоединена к остатку Cys36, этот эффект распространяется, судя по всему, на всю N-концевую часть молекулы белка .

–  –  –

Рис. 15. Температурные зависимости интенсивности эксимерной флуоресценции для -SmTm G126R, измеренной при разных концентрациях белка в присутствии 100 мМ KCl (А) и при разных ионных силах (Б) (концентрация белка в этом случае составляла ~1 мкМ). Во всех экспериментах длина волны возбуждения 340 нм, длина волны излучения – 485 нм, скорость прогрева 1оС/мин .

Интересно отметить, что форма кривых в случае мутантного тропомиозина обнаруживает наличие двух максимумов интенсивности флуоресценции. Особенно чётко этот пик виден у -SmTm с заменой G126R (рис. 14). Чтобы определить природу процесса, вызывающего появление второго (более высокотемпературного) максимума, мы исследовали температурные зависимости эксимерной флуоресценции -SmTm G126R при разных концентрациях белка (рис. 15А). Оказалось, что выраженность этого максимума сильно зависит от концентрации белка, что характерно для диссоциативных процессов .

Исходя из этого, мы предположили, что появление второго максимума эксимерной флуоресценции может быть обусловлено структурными изменениями C-концевого участка белка .

Остаётся неясным, каким образом денатурация C-концевого участка молекулы тропомиозина может оказывать влияние на структурные изменения N-концевого участка .

Увеличение ионной силы путём добавления 500 мМ NaCl (в этих условиях не происходит межмолекулярных концевых взаимодействий тропомиозинов) не только не привело к исчезновению второго максимума флуоресценции, но даже увеличило его (Рис. 15Б) .

Очевидно, столь необычный характер температурных зависимостей эксимерной флуоресценции -smTm с заменами и обусловлен какими-то G126A G126R внутримолекулярными перестройками в молекуле тропомиозина, происходящими в результате этих мутаций .

На основании этих данных, а также результатов экспериментов ДСК и трипсинолиза мы предполагаем, что вызываемая мутациями стабилизация центрального участка тропомиозина частично препятствует расхождению цепей N-концевого участка молекулы .

Таким образом, метка может образовывать эксимеры даже в процессе денатурации Nконцевого участка, и полное тушение флуоресценции происходит только после плавления C-концевого участка и полного расхождения цепей тропомиозина. Однако для проверки этой гипотезы необходимы дополнительные исследования .

Влияние замены остатка G126 в молекуле гладкомышечного -тропомиозина на его взаимодействие с актином Проанализировав структурные свойства полученных мутантных белков и убедившись в наличии эффекта стабилизации их молекулы, мы приступили к изучению влияния замены остатка G126 на функциональную активность гладкомышечного тропомиозина .

Связывание актина является одной из самых главных функций тропомиозина. В данной работе взаимодействие гладкомышечного -тропомиозина с F-актином мы исследовали методом измерения температурных зависимостей диссоциации комплексов F-актин–Tm. Полученные кривые светорассеяния приведены на рис. 16 .

–  –  –

Рис. 16. Температурные зависимости светорассеяния комплексов -SmTm wt (зелёная кривая), G126A (синяя кривая) и G126R (красная кривая) с F-актином, стабилизированным фаллоидином .

Кривые получены путём вычитания светорассеяния пробы, не содержащей тропомиозина, из исходных кривых светорассеяния комплексов Tm с F-актином. Измерения проводили при 340 нм .

Концентрация белков: 20 мкМ актин и 15 мкМ тропомиозин; скорость прогрева 1оС/мин .

Снижение интенсивности светорассеяния отражает диссоциацию комплексов Fактин–Tm (см. раздел «Материалы и методы»). Оказалось, что -SmTm wt диссоциирует с поверхности F-актина при более низкой температуре (температура полумаксимального снижения светорассеяния составляла 41,4оС), чем в случае белков с заменами G126A и G126R (44,6оС и 45,7оС соответственно). Следовательно, замена остатка G126 на стабилизирующий аминокислотный остаток не только не ослабляет, но вероятно даже повышает прочность взаимодействия тропомиозина с F-актином. Аналогичные данные были получены в группе Ш. Лерера [Sumida et. al., 2007] при изучении функциональных свойств -SkTm с мутацией D137L. Эти результаты показывают несостоятельность гипотезы о том, что участки дестабилизации тропомиозина необходимы для его связывания с актином [Holmes, Lehman, 2008] .

Влияние замены остатка G126 в молекуле гладкомышечного -тропомиозина на кооперативность связывания S1 с тонким филаментом Как известно, наиболее важной функцией гладкомышечного тропомиозина является регуляция мышечного сокращения. Существует мнение, что гибкость молекулы тропомиозина влияет на кооперативность связывания S1, что в свою очередь влияет на динамику перехода тонкого филамента в состояние «open» [Lehrer et al., 1997]. Поскольку стабилизация молекулы тропомиозина скорее всего вызывает снижение гибкости белка, нам было интересно узнать, влияет ли замена остатка G126 на кооперативные свойства тонкого филамента .

–  –  –

Рис. 17. Зависимости актин-активируемой ATPазной активности S1 от его концентрации в пробе .

Пробы содержали 4 мкМ F-актин, 1 мкМ тропомиозин (как дикого типа, так и с мутациями G126A и G126R). Реакцию начинали добавлением ATP до 5 мМ и проводили 10 минут при 25оС .

График зависимостей ATPазной активности S1 от его концентрации в пробе представлен на рис. 17. В случае пробы, не содержащей тропомиозина, эта зависимость является линейной (черная кривая на рис. 17), тогда как в пробах, содержащих -Tm, эта зависимость носит экспоненциальный характер. Для -Tm G126A полученная зависимость практически идентична таковой, полученной для белка дикого типа. В случае -Tm G126R (красная кривая на рис. 17) наблюдается значительное увеличение наклона кривой, что может говорить об увеличении кооперативности связывания S1 .

Мы предполагаем, что стабилизация молекулы тропомиозина, вызванная заменой G126A, недостаточна для уменьшения гибкости молекулы, существенного для изменения кооперативных свойств тонкого филамента. Вероятно, лабильность молекулы в этом участке продолжает поддерживаться благодаря другому дестабилизирующему остатку – D137. В то же время замена G126R вызывает увеличение жёсткости молекулы, а следовательно и всей тропомиозиновой нити на поверхности актинового филамента. В этом случае связывание и активация S1 влечёт за собой перемещение большего участка тропомиозиновой нити и, соответственно, активацию большего количества мономеров актина, т.е. увеличивается длина кооперативной единицы (см. обзор литературы) .

Аналогичные данные были получены в группе Ш. Лерера [Sumida et. al., 2007] при изучении кооперативности тонкого филамента, содержащего -SkTm с мутацией D137L .

Таким образом, замена остатка G126 на стабилизирующий структуру coiled-coil остаток Arg усиливает кооперативные свойства тонкого филамента. Возможно, лабильный участок тропомиозина необходим для тонкой регуляции мышечного сокращения, предотвращая возможность спонтанной активации филамента в клетке в условиях высоких концентраций миозина .

2. Скелетный -тропомиозин (-SkTm) .

Ограниченный протеолиз -тропомиозина Исследовав влияние замен G126A и G126R на структурные и функциональные характеристики гладкомышечного -тропомиозина, мы решили проверить, насколько эти эффекты проявляются для другой изоформы тропомиозина мышечных тканей – скелетномышечного -тропомиозина (-SkTm). Так же, как и в случае гладкомышечного тропомиозина, для оценки эффекта замены G126 на стабильность центрального участка молекулы тропомиозина его подвергли воздействию трипсина. Как и ожидалось, в случае тропомиозина дикого типа практически весь белок расщепляется за 60 минут, тогда как в случае белка с заменами G126A и G126R реакция трипсинолиза практически не идёт (рис 18). Это говорит о том, что обе замены, как G126A, так и G126R, обладают стабилизирующим эффектом на центральный участок тропомиозина, и этот результат хорошо согласуется с данными, полученными для -SmTm .

Рис. 18. Трипсинолиз скелетного -тропомиозина дикого типа (wt), а также содержащего замены G126A и G126R. Реакцию проводили при 25оС при весовом соотношении трипсин/тропомиозин равном 1/250. Об эффективности протеолиза судили по уменьшению интенсивности полос геля, соответствующих нерасщеплённому тропомиозину (отмечены пунктиром) .

Исследование тепловой денатурации скелетного -тропомиозина методом ДСК .

Для дальнейшего изучения влияния замены G126 на стабильность -тропомиозина, методом ДСК были проведены эксперименты по изучению тепловой денатурации исследуемых белков. Полученные кривые теплопоглощения представлены на рис. 19, а кривые, полученные в результате вычитания химической базовой линии и последующего разложения на отдельные калориметрические домены, представлены на рис. 20 .

Температуры максимумов пиков (Tm), а также значения калориметрической энтальпии тепловых переходов (Hcal), рассчитанные как площадь под пиком, представлены в таблице 2 .

–  –  –

Рис. 19. Температурные зависимости тепловой денатурации скелетного -тропомиозина дикого типа (зелёная кривая), а также содержащего замены G126A (синяя кривая) и G126R (красная кривая). Концентрация белков составляла 1,0 мг/мл, скорость прогрева – 1оС/мин .

–  –  –

Рис. 20. Температурные зависимости тепловой денатурации, полученные в результате вычитания химической базовой линии, и их разложение на калориметрические домены для скелетного тропомиозина дикого типа (WT), а также содержащего замены G126A и G126R. Буквами N и C обозначены переходы, соответствующие N- и C-концевым доменам, соответственно .

Концентрация белков составляла 1,0 мг/мл, скорость прогрева 1оС/мин .

Таблица 2. Калориметрические характеристики отдельных доменов, полученных при разложении кривых теплопоглощения -SkTm на индивидуальные калориметрические переходы .

В скобках указаны значения Hcal для отдельных переходов, выраженные в % от общего значения энтальпии .

–  –  –

Исследование тепловой денатурации скелетного -тропомиозина методом КД Тепловое разворачивание -спиральной структуры тропомиозина наблюдали также с помощью метода КД. Нормированные температурные зависимости средней остаточной эллиптичности при 222 нм, а также профили их производных представлены на рис. 21 .

На рисунке видно, что тепловая денатурация тропомиозина дикого типа происходит при менее высоких температурах по сравнению с мутантными белками. При рассмотрении профиля первой производной полученных зависимостей было выявлено наличие двух пиков, которые, предположительно, соответствуют разворачиванию C- и Nконцевых участков тропомиозина. Температуры минимумов первой производной для SkTm wt составляют ~42,5оС и ~50,5оС, для белка с заменой G126A – ~45,0оС и ~51,5оС, а для -SkTm G126A – ~45,5оС и ~55,0оС. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными методом ДСК (рис. 20, табл. 2) .

Таким образом, как и в случае гладкомышечного -тропомиозина, замена неканонического остатка G126 на остатки аланина или аргинина стабилизирует структуру тропомиозина, причём замена G126R обладает более выраженным эффектом и стабилизирует как C-, так и N-концевые участки молекулы .

А 1.0

–  –  –

0.6 0.4 0.2 0.0 Б 0.00

–  –  –

Рис. 21. А) Нормированные температурные зависимости тепловой денатурации -SkTm wt (зелёная кривая), G126A (синяя кривая) и G126R (красная кривая), измеренные методом КД по изменению эллиптичности при 222 нм. Б) Профили первой производной средней остаточной эллиптичности по температуре. Концентрация белков в пробе составляла 1,0 мг/мл, скорость прогрева 1оС/мин .

Исследование температурных зависимостей эксимерной флуоресценции пиренил-меченого -тропомиозина В отличие от -SmTm, у -SkTm единственный остаток цистеина, а именно Cys190, находится в C-концевой области тропомиозина. Следовательно, изучение эксимерной флуоресценции пиренил-меченого скелетного -тропомиозина позволяет наблюдать за процессами, происходящими в C-концевой области молекулы тропомиозина при ее тепловой денатурации, сопровождаемой диссоциацией цепей .

Температурные зависимости интенсивности эксимерной флуоресценции пиренилмеченых препаратов -SkTm wt, а также содержащих замены G126A и G126R, представлены на рис. 22. Чтобы оценить стабилизирующее влияние замен остатка G126, измеряли ту температуру, при которой наблюдалось уменьшение интенсивности эксимерной флуоресценции вдвое. Она оказалась приблизительно равна 44оС, 46оС и 48оС для белка дикого типа и мутантов G126A и G126R, соответственно. Таким образом, мы получили ещё одно подтверждение того, что замены G126A и G126R стабилизируют Сконцевой участок молекулы тропомиозина .

–  –  –

Рис. 22. Температурные зависимости интенсивности эксимерной флуоресценции для -SkTm wt (зелёная кривая), G126A (синяя кривая) и G126R (красная кривая), измеренной при 485 нм. Длина волны возбуждения 340 нм. Концентрация белков составляла ~10 мкМ, скорость прогрева – 1оС/мин .

Как и в случае -SmTm, на кривых температурных зависимостей интенсивности эксимерной флуоресценции мутантных тропомиозинов обнаруживается наличие двух максимумов. Особенно чётко это проявляется у белка с заменой G126R (рис. 22). При этом, как и в случае с мутантными формами -SmTm (рис. 14, 15), амплитуда второго пика растёт при увеличении концентрации белка и он не исчезает с увеличением ионной силы (данные не приведены). По аналогии с -SmTm мы предположили, что стабилизация центрального участка молекулы частично препятствует расхождению цепей тропомиозина, позволяя пиреновой метке образовывать эксимеры даже в процессе денатурации C-концевого участка .

Важно отметить, что подобный эффект обнаружен лишь для мутантных форм тропомиозина с заменами остатка G126, но он никогда не наблюдался для белка дикого типа. Таким образом, этот удивительный эффект является следствием стабилизации центральной части молекулы тропомиозина. Попробуем представить себе механизм этого эффекта, учитывая, что в данном случае мы наблюдаем лишь локальные изменения в области остатка Cys190, к которому присоединена пиреновая метка. Сначала происходит локальное плавление молекулы тропомиозина в области метки, при этом возрастает подвижность метки и увеличивается возможность образования эксимера, что сопровождается повышением интенсивности флуоресценции. Этот эффект наблюдается как для белка дикого типа, так и для мутантных белков с заменами остатка G126. Затем при повышении температуры начинается диссоциация цепей тропомиозина, которая сопровождается тушением эксимерной флуоресценции пирена. Самое удивительное состоит в том, что в какой-то момент у мутантных форм тропомиозина вновь начинается прирост флуоресценции, который особенно ярко выражен у белка с заменой G126R (рис .

14, 22). Создается впечатление, что в этом случае цепи тропомиозина на какое-то время вновь сближаются, значительно увеличивая вероятность образования эксимеров. Это продолжается до тех пор, пока две цепи тропомиозина не разойдутся окончательно при более высокой температуре. Объяснить этот феномен пока довольно трудно; можно лишь предположить, что значительная стабилизация центральной части молекулы тропомиозина, вызываемая заменой остатка G126R, резко изменяет характер тепловой денатурации всей С-концевой части молекулы. В значительной степени это подтверждается и данными ДСК (рис. 20) .

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что замена остатка G126 приводит к заметной стабилизации молекул как скелетного -тропомиозина, так и гладкомышечного

-тропомиозина .

Влияние замены G126 в молекуле -тропомиозина на его взаимодействие с актином Взаимодействие скелетного -тропомиозина с F-актином исследовали методом соосаждения, поскольку этот подход позволяет непосредственно оценить сродство тропомиозина к актину. При высокоскоростном ультрацентрифугировании (100000 g) связанный с актином Tm обнаруживается в осадке вместе с филаментами F-актина, а свободный, т. е. не связанный с актином Tm, остаётся в супернатанте (рис. 23). При этом, чем выше сродство, тем меньшая концентрация тропомиозина необходима для насыщения актина .

Зависимости степени насыщения актина от концентрации свободного тропомиозина в пробе были получены при помощи уравнения Хилла (рис. 24). Видно, что как в случае белка дикого типа, так и в случае мутантных белков, свободный тропомиозин практически отсутствует в пробах, в которых не достигается насыщение F-актина, т.е. во всех случаях сродство тропомиозина к актину очень высоко .

Таким образом, замена остатка G126 на стабилизирующие остатки не оказывает заметного влияния на связывание тропомиозина с актиновыми филаментами. Эти результаты хорошо согласуются с данными по изучению сродства к F-актину скелетного

-тропомиозина с мутацией D137L, полученными в группе Ш. Лерера [Sumida et. al., 2007] .

Рис. 23. Электрофореграмма в 14% SDS-ПААГ проб, полученных методом соосаждения -SkTm wt c F-актином, стабилизированным фаллоидином. Первые три дорожки – пробы, используемые для построения калибровочной кривой. Цифрами на рисунке обозначены концентрации тропомиозина в пробах до центрифугирования. Концентрация F-актина в пробах до центрифугирования составляла 10 мкМ .

–  –  –

Рис. 24. График зависимости насыщения F-актина тропомиозином от концентрации свободного, не связанного с актином тропомиозина (т.е. тропомиозина, остающегося в супернатанте после центрифугирования проб). Концентрацию тропомиозина в осадках и супернатантах рассчитывали по калибровочной кривой. Степень насыщения F-актина тропомиозином рассчитывали как отношение концентрации тропомиозина в осадке данной пробы к максимальной концентрации тропомиозина в осадке .

Влияние замены G126 в молекуле -тропомиозина на кооперативность связывания S1 с тонким филаментом Поскольку замена остатка G126 на аргинин обладает большим по сравнению с мутацией G126A стабилизирующим эффектом на структуру молекулы тропомиозина, именно -SkTm с мутацией G126R мы использовали в экспериментах по изучению регуляции тонкого филамента. График зависимости актин-активируемой ATPазной активности S1 от его концентрации в пробе представлен на рис. 25. Видно, что в присутствии мутантного белка наблюдается заметное увеличение наклона кривой, что может свидетельствовать о повышенной кооперативности связывания S1 в присутствии

-SkTm с мутацией G126R .

–  –  –

Рис. 25. Зависимости актин-активируемой ATPазной активности S1 от его концентрации в пробе .

Пробы содержали 4 мкМ F-актин, 1 мкМ тропомиозин. и 5 мМ ATP. Реакцию начинали добавлением ATP до концентрации 5 мМ и проводили 10 минут при 25оС .

Аналогичные данные были получены нами для гладкомышечного -Tm (рис. 17), а также в группе Ш. Лерера [Sumida et. al., 2007] для скелетного -Tm с заменой D137L .

Таким образом, нам удалось подтвердить гипотезу о том, что замена остатка G126 на остаток Arg, стабилизирующий структуру coiled-coil тропомиозина в этой области, оказывает заметное влияние на кооперативные свойства тонкого филамента, повышая кооперативность связывания c ним головок миозина .

Изучение влияния замены G126R в молекуле скелетного -тропомиозина на Caчувствительность регулируемого тонкого филамента Чтобы проверить, не влияет ли стабилизация центрального участка молекулы тропомиозина на функции регулируемого тонкого филамента, мы исследовали зависимость ATPазной активности миозина (S1) от концентрации Ca в пробе (рис. 26) .

0.12

–  –  –

0.08 0.06 0.04 0.02

–  –  –

Рис. 26. Зависимости актин-активируемой ATPазной активности S1 в реконструированном тонком филаменте от pCa в пробе. Пробы содержали 4 мкМ F-актин, 1 мкМ тропомиозин, 2 мкМ тропонин и 2 мкМ S1.. Необходимую концентрацию Ca2+ в пробе создавали с помощью 1 мМ Са/EGTA буфера. Реакцию начинали добавлением ATP до концентрации 5 мМ и проводили 10 минут при 37оС .

Анализ кривых, полученных с помощью функции Больцмана, показывает, что кальциевая чувствительность тонкого филамента практически идентична для -SkTm wt и

-SkTm G126R (рис. 26). Величина рCa, при которой переход филамента в состояние «open» происходит наполовину, для -SkTm wt составляет ~6,4, а для -SkTm G126R – ~6,5. При этом в условиях насыщения тропонинового комплекса ионами Ca2+ ATPазная активность S1 в пробе, содержащей тропомиозин с мутацией G126R, была вдвое выше, чем в пробе, содержащей белок дикого типа. Весьма похожие результаты были получены ранее при изучении влияния замены D137L в скелетномышечном -Tm на Caчувствительность регулируемого тонкого филамента [Sumida et. al., 2007] .

Известно, что присутствие тропонина значительно увеличивает длину кооперативной единицы скелетного тропомиозина [Geeves, Lehrer, 1994]. Вполне возможно, что этот эффект проявляется значительно ярче в случае более жёсткой молекулы -SkTm с мутацией G126R, что и приводит к значительному увеличению активности S1 в условиях данного эксперимента .

Таким образом, нам удалось показать, что повышение стабильности центрального участка молекулы тропомиозина оказывает заметное влияние на кооперативные свойства тонкого филамента. При этом следует отметить, что такой эффект является сходным как для -, так и для -изоформ тропомиозина. Мы предполагаем, что наличие лабильного участка в центральной части молекулы тропомиозина необходимо для осуществления тонкой регуляции мышечного сокращения. Следует заметить, что это скорее всего не единственная функция лабильного участка молекулы, поскольку остаток G126 присутствует и в немышечных изоформах тропомиозинах. Не исключено, что наличие такого лабильного участка является немаловажным для правильного встраивания нитей тропомиозина в F-актин и для обеспечения определенной степени подвижности тропомиозина на поверхности актинового филамента .

Заключение С помощью методов ограниченного трипсинолиза и изучения тепловой денатурации тропомиозина нам удалось показать, что замена остатка G126 на остатки аланина или аргинина вызывает значительную стабилизацию структуры coiled-coil белка. Таким образом, в центральном участке молекулы имеются по меньшей мере два консервативных неканонических остатка – G126 и D137 – наличие которых приводит к локальной дестабилизации структуры тропомиозина в этой области. Это наводит на мысль о том, что лабильный центральный участок молекулы должен играть очень важную роль в функционировании тропомиозина .

Существует теория, что подобные лабильные участки обусловливают должную степень гибкости молекулы тропомиозина, позволяющую ему принимать форму, необходимую для взаимодействия с актиновым филаментом. Наши исследования показали, что замена остатка G126 на остаток, стабилизирующий структуру coiled-coil, не приводит к нарушению связывания тропомиозина с актином. Это говорит о том, что данная теория требует некоторого пересмотра .

Помимо этого, мы продемонстрировали влияние стабилизации центральной части молекулы тропомиозина на кооперативность взаимодействия S1 с тонким филаментом .

Мы предполагаем, что увеличение жёсткости тропомиозина приводит к увеличению длины кооперативной единицы и, таким образом, влияет на динамику переключения тонкого филамента из состояния «closed» в состояние «open».Не исключено, что высокая гибкость молекулы тропомиозина необходима для осуществления тонкой регуляции мышечного сокращения – например, препятствуя слишком сильной активации тонкого филамента в клетке в условиях высоких концентраций миозина. Следует, однако, заметить, что эта гипотеза не объясняет, какую роль играет наличие остатка G126 в немышечных изоформах тропомиозина .

Известно множество точечных мутаций тропомиозина, ассоциированных с тяжёлыми наследственными заболеваниями человека. До сих пор, однако, не было обнаружено заболеваний, сопровождающихся заменой остатка G126. Тем не менее, наше исследование показывает, как одна точечная мутация в молекуле тропомиозина может привести к изменению динамики активации тонкого филамента и нарушению регуляции мышечного сокращения .

Выводы Получены рекомбинантные препараты скелетного -тропомиозина человека, 1) содержащие замены G126A и G126R .

–  –  –

Установлено, что замена неканонического остатка G126 в молекуле 3) тропомиозина на стабилизирующие остатки аланина или аргинина не нарушает способности тропомиозина связываться с актином .

Показано, что замена G126R в молекуле тропомиозина оказывает заметное 4) влияние на кооперативность связывания головок миозина с актиновыми филаментами, содержащими связанный тропомиозин, и на ATPазную активность миозина в реконструированных тонких филаментах при высоких концентрациях ионов кальция. На основании этих данных высказано предположение о возможной функциональной роли лабильного центрального участка молекулы тропомиозина в регуляции мышечного сокращения .

Список литературы

Гусев Н.Б. (2000) Молекулярные механизмы мышечного сокращения. Соросовский образовательный журнал 6(8), 24-32 .

Костюкова А.С. (2008) Формирование кэпирущего комплекса на медленно растущем конце актиновых филаментов. Успехи биологической химии 48, 253–266 .

Кремнева Е.В. (2005) Тепловая денатурация различных форм изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН .

Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995) Белки актомиозиновой системы подвижности. В кн.: Белки и пептиды (под ред. Липкина В.М.), Наука, Москва, стр .

249–293 .

Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. (1982) Миозин и биологическая подвижность, Наука, Москва, 160 с .

Alahyan M., Webb M.R., Marston S.B., EL-Mezgueldi M. (2006) Mechanism of smooth muscle caldesmon-tropomyosin inhibition of the elementary steps of the actomyosin. ATPase. J .

Biol. Chem. 281, 19433–19448 .

Borovikov Y.S., Karpicheva O.E., Avrova S.V., Redwood C.S. (2009) Modulation of the effects of tropomyosin on actin and myosin conformational changes by troponin and Ca2+ .

Biochim. Biophys. Acta 1794, 985-994 .

Boussouf S.E., Maytum R., Jaquet K., Geeves M.A. (2007) Role of tropomyosin isoforms in the calcium sensitivity of striated muscle thin filaments. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 49-58 .

Brown J.H., Zhou Z., Reshetnikova L., Robinson H., Yammani R.D., Tobacman L.S., Cohen C .

(2005) Structure of the mid-region of tropomyosin: bending and binding sites for actin .

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 18878-18883 .

Filatov V.L., Katruha A.G., Bulargina T.V., Gusev N.B. (1999) Troponin: structure, properties and mechanism of functioning. Biochemistry (Moscow) 64, 969-985 .

Freire E., Biltonen R.L. (1978) Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. Theory and application to homogeneous system. Biopolymers 17, 463Geeves M.A., Lehrer S.S. (1994) Dynamics of the muscle thin filament regulatory switch: the size of the cooperative unit. Biophys. J. 67, 273-282 .

Gunning P., O’Neill G., Hardeman E. (2008) Tropomyosin-based regulation of the actin cytoskeleton in time and space. Physiol Rev. 88, 1-35 .

Hitchcock-DeGregori S.E., Song Y., Greenfield N.J. (2002) Functions of tropomyosin’s periodic repeats. Biochemistry 41, 15036-15044 .

Hitchcock-DeGregori S.E. (2008) Tropomyosin: function follows structure. In: Tropomyosin (Ed. by Gunning P.), Springer, p. 60-72 .

Holmes K.C., Lehman W. (2008) Gestalt-binding of tropomyosin to actin filaments. J. Muscle Res. Cell Motil.,.29, p. 213-219 .

Holmes K.C., Popp D., Gebhard W., Kabsh W. (1990) Atomic model of the actin filament .

Nature 347, 44-49 .

Holthauzen L.M.F., Correa F., Farah C.S. (2004) Ca-induced rolling of tropomyosin in muscle thin filaments. J. Biol. Chem. 279, 15204-15213 .

Ishii Y., Lehrer S. (1990) Excimer fluorescence of pyreniliodacetamide-labeled tropomyosin: A probe of the state of tropomyosin in the reconstituted muscle thin filaments. Biochemistry 29, 1160-1166 .

Kremneva E., Nikolaeva O., Maytum R., Arutyunyan A.M., Kleimenov S.Yu., Geeves M.A., Levitsky D.I. (2006) Thermal unfolding of smooth muscle and non-muscle tropomyosin homodimers with alternatively spliced exons. FEBS J. 273, 588–600 .

Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 .

Lehrer S.S., Morris, E.P. (1982) Dual effects of tropomyosin and troponin-tropomyosin on actomyosin subfragment 1 ATPase. J. Biol. Chem. 257, 8073-8080 .

Lehrer S.S., Golitsina N.L., Geeves M. (1997) Actin-tropomyosin activation of myosin subfragment 1 ATPase and thin filament cooperativity. The role of tropomyosin flexibility and end-to-end interactions. Biochemistry 36, 13449-13454 .

Lindberg U., Schutt C.E., Goldman R.D., Nyakern-Meazza M., Hillberg L., Rathje L.Z., Grenklo

S. (2008) Tropomyosins regulate the impact of actin binding proteins on actin filaments. In:

Tropomyosin (Ed. by Gunning, P.), Springer, p. 223-231 .

McKillop D.F., Geeves M.A. (1993) Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1: evidence for three states of the thin filament. Biophys. J. 65, 693-701 .

Maytum R., Geeves M.A., Lehrer S.S. (2002) A modulatory role for the troponin T tail domain in thin filament regulation. J. Biol. Chem. 277, 29774-29780 .

Maytum R., Lehrer S.S., Geeves M. (1999) Cooperativity and switching within the three-state model of muscle regulation. Biochemistry 38, 1102-1110 .

Minakata S., Maeda K., Oda N., Wakabayashi K., Nitanai Y., Maeda N. (2008) Two-crystal structures of tropomyosin C-terminal fragment 176-273: exposure of the hydrophobic core to thesolvent destabilizes the tropomyosin molecule. Biophys. J. 95, 710-719 .

Nevzorov I., Redwood C., Levitsky D. (2008) Stability of two -tropomyosin isoforms: effects of mutation Arg91Gly. J. Muscle Res. Cell Motil. 29, 173-176 .

Nitanai Y., Minakata S., Maeda K., Oda N., Maeda Y. (2007) Crystal structures of tropomyosin:

flexible coiled-coil. Adv. Exp. Med. Biol. 592, 137-151 .

Ochala J. (2008) Thin filament protein mutations associated with skeletal myopathies: Defective regulation of muscle contraction. J. Mol. Med. 86, 1197-1204 .

Ohtsuki I. (2007). Troponin: structure, function and disfunction. Regulatory mechanisms of striated muscle contraction (Ed. by Ebashi S. and Ohtsuki I.), Springer, p. 21-36 .

Panusz H.T., Graczyk G., Wilmanska D., Skarzynski J. (1970) Analysis of orthophosphatepyrophosphate mixtures resulting from weak pyrophosphatase activities. Anal. Biochem .

35, 494-504 .

Pato M.D., Mak A.S., Smillie L.B. (1981) Fragments of rabbit striated muscle -tropomyosin. J .

Biol. Chem. 256, 593-601 .

Perry S. V. (2001) Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function. J. Muscle Res .

Cell Motil. 22, 5-49 .

Prentki M., Chaponnier C., Jeanrenaud B., Gabbiani G. (1979) Actin microfilaments, cell shape, and secretory processes in isolated rat hepatocytes. Effect of phalloidin and cytochalasin D .

J. Cell Biol. 81, 952-607 .

Singh A., Hitchcock-DeGregori S.E. (2007) Tropomyosin’s periods are quasi-equivalent for actin binding but have specific regulatory functions. Biochemistry 46, 14917-14927 .

Squire J.M., Morris E.P. (1998) A new look at thin filament regulation in vertebrate skeletal muscle. FASEB J. 12, 761-771 .

Spudich J.A., Watt S. (1971) The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J. Biol. Chem. 246, 4866-4871 .

Sumida J.P., Wu E., Lehrer S.S. (2007) Conserved Asp-137 imparts flexibility to tropomyosin and affects function. J. Biol. Chem. 283, 6728-6734 .

Vinogradova M.V., Stone D.B., Malanina G.G., Mendelson R.A., Fletterick R.J. (2007). Ca ion and the troponin switch. In: Regulatory mechanisms of striated muscle contraction (Ed. by Ebashi S. and Ohtsuki I.), Springer, p. 47-57 .

Weeds A.G., Taylor R.S. (1975) Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. Nature 257, 54-56 .

Wegner A. (1979) Equilibrium of the actin-tropomyosin interaction. J. Mol. Biol. 131, 839-853 .






Похожие работы:

«Бюллетень Союза по сохранению сайгака Saiga News лето 2007: Выпуск 5 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Союз по сохранению сайгака Содержание Союз по сохранению сайгака (SCA) развивается очень быстро. Мы назначили Президиум, Основная статья – стр. 1 приняли Устав, имеем вебсайт и банковский счет. По...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ВОДНЫХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИВЭП СО РАН) УТВЕРЖДАЮ: ВрИО директора ИВЭП СО РАН _ д.б.н. А.В. Пузанов "29" апреля 2016 г. ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНОГО ЭКЗАМЕНА в аспир...»

«• " " •Экспериментальные и теоретические статьи• •Experimental and theoretical articles• Биолог. журн. Армении, 1 (63), 2011 ИСКОПАЕМЫЕ РЫБЫ АРМЕНИИ С. Х. ПИПОЯН*, Д.З. ВАСИЛЯН**, И.Г. ГАБРИЕЛЯН*** *Армянский государственный педагогичесий университет им. Х. Абовяна, s.pipoyan@gmail.com **Научный центр...»

«СЕКЦИЯ 9. ЗЕМЛЕУСТРОЙСТВО: НАУКА И ПРАКТИКА ПРОБЛЕМЫ МОНОГОРОДОВ В ЗЕМЛЕУСТРОЙСТВЕ НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА ПРОКОПЬЕВСКА А.Е. Киселева Научный руководитель доцент Н.В. Кончакова Национальный исследовательский Томский политехнический университет, г. Томск, Россия Моногород являе...»

«Многопоточные архитектуры 03.12.2014 Программная многопоточность Тема 1/3 Поток исполнения (так же нить, thread) Пример программы: Ход исполнения программы: void func() {. t return; Вызов функции } Возврат из функции int main() •...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ ПРИКАЗ от 5 сентября 2013 г. N П-13-71 О МЕРАХ ПО РЕАЛИЗАЦИИ ПОСТАНОВЛЕНИЯ ПРАВИТЕЛЬСТВА ОМСКОЙ ОБЛАСТИ ОТ 28 АВГУСТА 2013 ГОДА N 209-П ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПО...»

«ЛОГВИНОВ АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, XVI, 1, 1982 УДК 576.893.19 : 591.4 УЛЬТРАТОНКОЕ СТРОЕНИЕ ТАК НАЗЫВАЕМЫХ ЦИСТ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ МИКСОСПОРИДИЙ А. В. Успенская Институт цитологии А Н СССР, Ленинград Изучено ультратонкое строение вегетативных стадий миксоспоридий, обозначаемых как "циста". Установлено, что это крупные плазмодии, а не цисты,...»

«ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН Том 8, № 1, 2012, стр. 47–53 БИОЛОГИЯ УДК 569.61(1-924.8) ДЕЙНОТЕРИИ (MAMMALIA, PROBOSCIDEA) В ПОЗДНЕТРЕТИЧНЫХ БИОМАХ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ Академик Г.Г. Матишов1, 2, Н.П....»

«ИНСТРУКЦИЯ ПО ИНВЕНТАРИЗАЦИИ ВЫБРОСОВ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В АТМОСФЕРУ Ленинград 1991 г. качество сварных соединений ОБЩЕСТВО "ЗНАНИЕ" РСФСР Ленинградская организация ЛЕНИНГРАДСКИЙ ДОМ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ПРОПАГАНДЫ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ОХРАНЕ ПРИРОДЫ ИНСТРУКЦИЯ ПО ИНВЕНТАРИЗАЦИИ ВЫБРОСОВ ЗА...»

«Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение "Детский сад № 7" ПРОЕКТ "Мы – друзья природы!"Авторы проекта: старший воспитатель 1 кв. категории Егорова Т.В,. воспитатель1 кв. категории Борискина С.М. Кашира-2017г. Актуальность В наше время проблемы экологического воспитания вышли на первый план, и им уделяют все больше внимания....»

«.-лз^шгазэ*. ТЗМы-Т,-ln. Расчет тарифов с 03.09.2018 J Статьи Подготовка будущих Подготовка будущих Кружок Занятия спортивной Занятия первоклассников к первоклассников к Умники и гимнастикой хореографией школе школе Умницы (индивидуальны...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.