WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 


«Щепотина Елена Георгиевна Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A ...»

На правах рукописи

Щепотина Елена Георгиевна

Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А,

прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2008

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском

институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения

Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Вавилин Валентин Андреевич

Научный консультант: доктор биологических наук, академик РАМН Ляхович Вячеслав Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Гимаутдинова Ольга Ивановна доктор медицинских наук, Максимов Владимир Николаевич

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « »______________ 2008 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научноисследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2, тел. 8(383)3335481 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук .



Автореферат разослан «__» ___________ 2008г .

Ученый секретарь диссертационного совета Русских Г.С .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что реакция на воздействие химических факторов, в том числе, на прием лекарственных препаратов, индивидуальна и зависит от образа жизни, возраста, пола, этнической принадлежности, состояния здоровья, питания, взаимодействий применяемых лекарств, особенностей метаболизма. По некоторым оценкам, от 50 до 90% вариабельности ответов на воздействие ксенобиотиков определяется генетическими особенностями индивидов (Ozdemir et al., 2000). Актуальность проблемы безопасности взаимодействия организма с химическими агентами окружающей среды возрастает с расширением числа используемых химических соединений, внедрением в клиническую практику новых лекарственных средств. Химические соединения, поступив в организм, подвергаются метаболизму посредством системы ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Активность этих ферментов определяет протекание процесса обезвреживания токсичных соединений и их метаболитов. Основные процессы обезвреживания протекают в печени, где содержание ферментов метаболизма чужеродных соединений превалирует. Особо стоит выделить роль суперсемейства цитохромов Р450, отвечающих за первый этап биотрансформации. В частности, подсемейство CYP3A, которое составляет в печени 30% от остальных CYP, и метаболизирует порядка 50% лекарственных препаратов (Bertz and Granneman, 1997; Guengerich, 2003). CYP3A участвуют также в различных метаболических реакциях стероидных гормонов (Shou et al., 1997; Stevens et al., 2003), поддерживая гормональный баланс, нарушение которого играет важную роль в развитии ряда заболеваний, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, гипертензия, синдром Кушинга .

У человека подсемейство цитохромов Р450 3А включает четыре фермента:





CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, содержание которых превалирует в печени, кроме CYP3A43, который в большей степени представлен в предстательной железе. Ферменты подсемейства имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, что затрудняет оценку их индивидуального вклада в метаболизм ксенобиотиков (Williams et al., 2002). Для всех членов подсемейства характерно гидроксилирование стероидов по 6-положению. Это свойство позволяет определять активность ферментов CYP3A неинвазивным способом: по эндогенным кортизолу и его 6-гидроксилированному метаболиту, отношение концентраций которых является признанным биомаркером активности CYP3A (Waxman et al., 1994; Furuta et al., 2003) .

Метаболический полиморфизм подсемейства был известен еще в середине 1980-х г.г., но надежда его объяснить появилась с открытием генетического полиморфизма CYP3A в 1998 году. В настоящее время известно более 200 полиморфных вариантов и мутаций в генах CYP3A (www.cypalleles.ki.se;

www.pharmgkb.org). Несмотря на долгий поиск причин вариабельности активности CYP3A, до сих пор нет однозначного ответа на вопрос, что приводит к значительным межиндивидуальным различиям в ферментативной активности, достигающим нескольких десятков раз (Yamamoto et al., 2000). В гене CYP3A4 не обнаружено полиморфного варианта, определяющего подобную вариабельность активности фермента. Для CYP3A5 наблюдается бимодальное распределение активности белка, которое объясняется наличием аллеля *3С. Данный аллель вносит определенный вклад в активность всего подсемейства, но не определяет все межиндивидуальные различия (Hustert et al., 2001; Kuehl et al., 2001; Sim, 2007). Не так давно выявлен вариант CYP3A7*2, белок которого CYP3A7.2 более активен in vitro, чем аллозим «дикого» типа CYP3A7.1 (Rodriguez-Antona et al., 2005). В гене CYP3A43 выявлены три полиморфных варианта белок-кодирующей области, один из которых приводит к редуцированному белку (Cauffiez et al., 2004), но полиморфизму CYP3A43 посвящено мало работ, и его влияние на ферментативную активность не изучено .

В последние годы оценка функциональных проявлений открываемых мутаций проводится in vitro, если проводится вообще. В то же время, работы, посвященные изучению влияния генетических факторов на активность CYP3A у человека и лабораторных животных in vivo, представлены не для всех полиморфных вариантов. Поэтому изучение активности CYP3A по эндогенным субстратам и поиск ассоциаций генетического полиморфизма с активностью может привнести новые знания в понимание роли генетических факторов в формировании активности всего подсемейства. Причина вариабельности активности CYP3A, возможно, кроется не только в изменениях нуклеотидных последовательностей генов подсемейства, но и в регуляции их транскрипционной активации. Поэтому комплексное изучение полиморфизма CYP3A и их генов-регуляторов, основным из которых является прегнановый Х рецептор, может прояснить генетическую основу вариабельности ферментативной активности CYP3A .

Другим важным фактором изменения ферментативной активности CYP3A является возраст. Отличия метаболизма ксенобиотиков, обусловленные возрастом, наиболее отчетливо проявляются у новорожденных и лиц пожилого возраста. Недостаточно развитая система метаболизма чужеродных соединений у детей младшего возраста делает их особенно чувствительными к ряду токсикантов. В литературе отсутствуют данные об изменении метаболической активности CYP3A у детей раннего детства. Поскольку ферментативная активность способна существенно изменяться в течение коротких отрезков онтогенеза, изучение возрастной динамики активности также может привести к идентификации важных факторов в регуляции CYP3A .

Многими исследователями для обнаружения и выявления мутаций используется метод секвенирования ДНК, который требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов и не всегда доступен большинству лабораторий для рутинного генетического анализа. Для выявления известных мутаций широко используется метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), а также метод конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP), который позволяет обнаружить как новые, так и уже известные мутации. Несмотря на то, что полиморфизм CYP3A изучается многими исследователями, для ряда полиморфных вариантов не предложены способы их детекции методами ПДРФ и SSCP, а для изучения полиморфизма генов PXR и CYP3A43 не найдена информация об их использовании. Поэтому оптимизация методов ПДРФ и SSCP в изучении генов CYP3A и PXR имеет существенное значение .

Цель исследования: изучение влияния полиморфизма генов CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, PXR на вариабельность активности CYP3A .

Задачи исследования:

1. Изучить ферментативную активность CYP3A по содержанию эндогенных кортизола и 6-гидроксикортизола в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в возрастной период от 1 года до 14 лет .

2. Оптимизировать способы выявления полиморфных вариантов генов CYP3A и PXR методами полимеразной цепной реакции, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК .

3. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов и мутаций генов CYP3A4 (*1B, *2, *5, *17, -11129_-11128insTGT), CYP3A5 (*3C, *6), CYP3A7 (*2), CYP3A43 (*1B, *2A) и PXR (-1570CT, -205_-200delGAGAAG, c.106GA, g.4444AG) у здоровых европеоидов .

4. Проанализировать ассоциации генотипов CYP3A и PXR c активностью CYP3A .

Научная новизна. Впервые изучено изменение активности CYP3A, оцененной по 6-гидроксилированию кортизола, в возрастной период с 1 г. до 14 лет у европеоидов. Впервые выявлено, что основной рост активности происходит в первые два с половиной года жизни, а после 5 лет темпы ее роста снижаются .

Предложено выявлять полиморфные варианты и мутации CYP3A4 (*1B, *2, *5, *17), CYP3A5 (*3C, *6), CYP3A7 (*2), CYP3A43 (*1B, *2A), PXR (g.106GA, g.4444AG, -1570CT) методом ПЦР-ПДРФ, вставку CYP3A4 -11129_insTGT методом SSCP и делецию PXR -205_-200delGAGAAG полимеразной цепной реакцией с дальнейшим разделением продуктов в 12% полиакриламидном геле .

Впервые охарактеризована частота встречаемости аллелей генов CYP3A4 (*17, *5, -11129_-11128insTGT), CYP3A5 (*3C, *6), CYP3A7 (*2), CYP3A43 (*1B, *2A), PXR -205_-200delGAGAAG и нуклеотидных замен PXR (g.106GA, g.4444AG, -1570CT) у европеоидов России. Частота встречаемости изученных полиморфных вариантов и мутаций не отличается от частоты встречаемости в других популяциях европеоидов .

Впервые в России проведен анализ сравнения показателя активности CYP3A, оцененного по 6-гидроксилированию кортизола, у носителей разных генотипов CYP3A и PXR. В группе гетерозигот CYP3A5*1A/*3C среднее значение показателя активности CYP3A в 3,15 раза выше относительно группы гомозигот CYP3A5*3C/*3С (p=0,014). В группе комбинации гомозигот CYP3A5*3C/*3С и CYP3A7*1/*1 среднее значение показателя активности CYP3A в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот CYP3A5*1/*3С и CYP3A7*1/*2 (p=0,031). В группе комбинации генотипов CYP3A4*1/*1B, CYP3A5*1/*3C, CYP3A7*1/*2 показатель активности CYP3A в 4,11 раза выше по сравнению с группой комбинации генотипов CYP3A4*1/*1, CYP3A5*3C/*3C, CYP3A7*1/*1 (p=0,042) .

Практическая значимость. Предложенные способы детекции полиморфных вариантов генов CYP3A и PXR могут быть использованы в исследованиях, посвященных изучению функциональных проявлений полиморфных вариантов, в исследованиях по выявлению маркеров предрасположенности к каким-либо заболеваниям, связанным с метаболическими путями, в которые вовлечены CYP3A и PXR, в популяционно-генетических исследованиях. Данные о частотах распределения изученных аллелей могут служить материалом для сравнения результатов в популяционных исследованиях другими авторами .

Данные об индивидуальной активности ферментов CYP3A могут иметь важную ценность при назначении лекарственных препаратов и при определении их терапевтических доз. Знания об особенностях ферментативной активности CYP3A особенно важны при комплексной лекарственной терапии для предупреждения нежелательных реакций, которые могут возникать при взаимодействии лекарственных препаратов .

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распределение активности цитохромов Р450 3А в возрастной группе от 1 года до 14 лет является полимодальным и позволяет выделить фенотипы со сниженной, средней и повышенной активностью. Активность CYP3A увеличивается с возрастом, максимально выражен прирост активности в период от 1 года до 2,5 лет .

2. В группе гетерозигот CYP3A5*1A/*3C наблюдаются более высокие значения показателя активности CYP3A, относительно группы гомозигот CYP3A5*3C/*3С. В группе комбинации гетерозигот CYP3A5*1/*3С и CYP3A7*1/*2 – более высокие значения показателя активности, относительно группы комбинации гомозигот CYP3A5*3C/*3С и CYP3A7*1/*1 .

3. Распределение полиморфных вариантов генов подсемейства и гена прегнанового Х рецептора между фенотипическими группами (сниженная, средняя, повышенная активность) не имеет закономерности. Это свидетельствует об отсутствии сильного влияния полиморфизма изученных генов на ферментативную активность CYP3A, оцененную по 6-гидроксилированию кортизола .

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации изложены на V Молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины»

(Новосибирск, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004), Московской конференции вычислительной молекулярной биологии (MCCMB'05) (МГУ, 2005), XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), 10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006), 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), Общероссийской IV научной школе молодых ученых по Экологической генетике (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) .

Вклад автора. Автором лично выполнен весь объем биохимического и молекулярно-генетического анализов. Выполнена высокоэффективная жидкостная хроматография с предварительной пробоподготовкой методом жидкостной экстракции и всеми сопутствующими модификациями методов .

Проведен анализ полиморфных вариантов и мутаций генов CYP3A и PXR и их отбор в исследование. Выполнены компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, дизайн праймеров, полимеразная цепная реакция, ферментативный гидролиз, анализ полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК, подготовка проб к секвенированию. Все полученные данные проанализированы автором самостоятельно с помощью статистических методов .

Подготовка образцов к секвенированию проведена совместно с к.б.н .

Катохиным А.В. (ИЦИГ СО РАН). Секвенирование образцов проводили в ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН (г. Новосибирск, http://sequest.niboch.nsc.ru) .

Забор клинического материала осуществляли сотрудники ДГКБ №1 г. Новосибирска под руководством к.м.н. Мананкина Н.А .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 в рецензируемой печати .

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц, 33 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на выборке здоровых европеоидов г. Новосибирска от 1 г. до 14 л. (n=145). Методом градиентной ВЭЖХ анализировали содержание 6гидроксикортизола (6-OHCL) и кортизола (CL) в моче (n=48), по отношению их концентраций оценивали активность CYP3A. Гормоны предварительно экстрагировали методом жидкостной экстракции. Нами внесены модификации в пробоподготовку и собственно хроматографию относительно исходного метода Lykkesfeldt et al. (1994) .

Молекулярно-генетический анализ CYP3A и PXR проводили на образцах ДНК, выделенных стандартным фенол-хлороформным методом из лейкоцитов периферической крови (n=145). ПЦР проводили по собственным методикам для вариантов CYP3A4*1B, *2, -11129_-11128insTGT, CYP3A5*3C, *6, CYP3A7*2, CYP3A43*2A, PXR c.106GA, g.4444GA, -1570CT, -205_-200delGAGAAG, кроме CYP3A4*5, CYP3A4*17 (Hsieh et al., 2001) и CYP3A43*1B (Cauffiez et al., 2004). Фрагменты ПЦР разделяли в 1,5-2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере. Полиморфные варианты выявляли методами ПДРФ и SSCP. Для аллелей CYP3A4*1B и 3A5*3C использовали опубликованные методики ПДРФ (Schaik et al., 2000, 2002, соотв.), для остальных оптимизировали метод самостоятельно .

Фрагменты ферментативного гидролиза разделяли в 8% ПААГ в трисборатном буфере. Вариант PXR -205_200delGAGAAG выявляли ПЦР с дальнейшим разделением продуктов в 12% ПААГ в трис-боратном буфере. Все фрагменты окрашивали бромистым этидием и сканировали в УФ-свете. Длину идентифицировали с помощью маркеров точных длин ДНК .

Вариант CYP3A4 -11129_-11128insTGT выявляли методом нерадиоактивного SSCP: к 10 мкл раствора, содержащего 95% формамид, 10 mM NaOH, 0,05% ксилен цианол, 0,05% бромфеноловый синий, добавляли 10 мкл продукта ПЦР, инкубировали в течение 5 мин при 95°С и быстро охлаждали на льду, денатурированные продукты разделяли в 12% ПААГ, содержащем 10% глицерин, в трис-боратном буфере при 10°С. Фрагменты окрашивали нитратом серебра (Bassam et al., 1994) .

Анализ последовательностей исследуемых генов, включая поиск сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции исследуемых областей генов, проводили с помощью программы Vector NTI Suite 8. Сравнение последовательностей генов CYP3A (NG_000004) проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw). Дизайн праймеров осуществляли с помощью программы FastPCR (http://www.biocenter. helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm) .

Статистическую обработку результатов проводили с помощью ППП STATISTICA v.6.0 (StatSoft Inc., США). Распределение генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга. При проведении попарного сравнения частот аллелей исследованных вариантов генов между собственными и литературными данными использовали критерий 2. Анализ различий независимых групп осуществляли с помощью критериев Манна-Уитни для двух групп и Краскела-Уоллиса для трех и более групп. Анализ связи признаков проводили с помощью метода Спирмена. Статистически значимым принимали уровень p0,05 .

Характеристика исследуемых вариантов генов CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 и PXR представлена в таблице 1 .

Таблица 1 Характеристика изученных вариантов CYP3A4, A5, A7, A43 и PXR Вариант Функциональное проявление CYP3A4*1B (-392AG) Замена в нифедипин-чувствительном элементе .

Ser222Pro. Снижает скорость метаболизма CYP3A4*2 (с.664TC) нифедипина в 6-9 раз и тестостерона по 6положению in vitro .

CYP3A4*5 (с.653CG) Pro218Arg в сайте связывания эритромицина .

CYP3A4*17 (c.566TC) Phe189Ser. Ser189 снижение активности in vitro .

Нарушение фактора стимуляции USF1 и CYP3A4

-11129_-11128insTGT снижение активности энхансера на 36% .

CYP3A5*3C Дефект сплайсинга, преждевременный стопg.6986AG) кодон .

–  –  –

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В мировой популяции человека наблюдаются более чем 50-кратные различия в количествах белка CYP3A4 между индивидами, которые приводят к более чем 20-кратным различиям в клиренсе лекарств (Eichelbaum and Burk, 2001), но до сих пор в литературе обсуждаются причины такой вариабельности .

В формировании активности предположительно участвует не только полиморфизм самих генов CYP3A, но и их генов-регуляторов, таких как PXR, в меньшей степени CAR, VDR, а также HNF, который одновременно является и транскрипционным регулятором PXR, CAR и др. (Watt and Duncan, 2003) .

Функционирование транскрипционных факторов определяет как конститутивную, так и индуцибельную экспрессию CYP3A. В нашей работе мы проанализировали связь активности CYP3A и полиморфизма генов CYP3A и PXR в группе здоровых европеоидов г.Новосибирска .

Активность CYP3A Модификация методов экстракции и ВЭЖХ. В исходном методе (Lykkesfeldt et al, 1994) описана твердофазная экстракция на колонках. При использовании колонок Sep Pack C18 мы наблюдали потерю 6-ОНCL при промывке колонок водой и слишком прочную фиксацию кортизола и внутреннего стандарта сорбентом, для количественного смыва которых требовался большой объем элюента, следствием чего была значительная потеря времени на высушивание образцов. Замена твердофазной экстракции жидкостной повысила эффективность экстракции всех трех определяемых соединений .

Изменения в проведении ВЭЖХ заключались в изменении профиля градиента, который позволил лучше разделять пики кортизола и внутреннего стандарта, в качестве которого мы использовали метилпреднизолон. Типичные хроматограммы разделения гормонов с известными концентрациями и проб мочи представлены на рисунке 1 .

Рисунок 1. Типичная хроматограмма гормонов с известными концентрациями (А) и экстракта мочи (Б) Времена выхода: (1) 6b-гидроксикортизол – 9,60 мин .

, (2) кортизол – 31,90 мин., (3) метилпреднизолон – 35,60 мин .

Распределение показателя активности CYP3A в выборке детей от 1 года до 14 лет и его динамика с возрастом. Значения показателя активности CYP3A распределялись в выборке неравномерно от 0,303 до 49,0. Тест Шапиро-Уилка на нормальность распределения показал, что распределение показателя активности отлично от нормального (p0,0001) (рис. 2А). Поэтому в качестве меры центральной тенденции и меры изменчивости мы использовали медиану и процентили, соответственно (Ме [25я; 75я процентили]) .

На гистограмме выделяются три основные моды, между ними располагаются антимоды, которые разделяют выборку на группы со сниженной, средней и повышенной активностью (I, II, III, соответственно). При сравнении этих групп с использованием критерия Краскела-Уоллиса выявлено, что они сильно различаются между собой (p=0,0004) (рис. 2Б) .

–  –  –

Рисунок 5. Сравнительный анализ фрагментов последовательностей генов CYP3A4, 3A5 и 3A7 (А, Б) и электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза PstI при выявлении аллеля CYP3A4*1B (В) А - выделены праймеры, предложенных Schaik et al .

(2000) и Раменской и соавт .

(2002). Б – праймеры, предложенные нами для амплификации фрагмента длиной 1544 п.н. Знаком «*» отмечены совпадающие нуклеотиды во всех трех генах. В – электрофореграмма 1 - продукты первой ПЦР; 2 – продукты второй ПЦР; 3 – гидролиз, дорожки 1-7 и 9-11 – гомозиготы по аллелю CYP3A4*1, дорожки 8 и 12 – гетерозиготы CYP3A4*1/*1B. М – маркер молекулярного веса ДНК .

Выявление CYP3A4 -11129_-11128insTGT. В 2004 г. Matsumura и соавт .

обнаружен и охарактеризован полиморфный вариант в конститутивном печеночном энхансерном модуле CYP3A4 – вставка TGT в положении -11129_Авторами работы данный вариант предложено выявлять аллельспецифичной ПЦР, используя для синтеза мутантного фрагмента праймер с последним модифицированным нуклеотидом на 3’-конце. При использовании аллель-специфичной ПЦР могут возникать спорные вопросы в идентификации генотипа: велика вероятность синтеза фрагмента с использованием праймера даже с модифицированными последним и третьим с конца нуклеотидами .

Поэтому мы предлагаем выявлять CYP3A4 insTGT методом SSCP. На рис. 6 представлены типичные электрофореграммы разделения денатурированных продуктов ПЦР. Фрагменты, имеющие отличающуюся электрофоретическую подвижность, секвенированы, было подтверждено, что они действительно представляют вставку TGT (рис. 6). В исследовании были обнаружены только гетерозиготы по варианту -11129_-11128insTGT CYP3A4, это видно из результата секвенирования (рис.6), и отражено в наложении сиквенса двух последовательностей, один из которых имеет вставку, а другой является фрагментом «дикого» типа .

Рисунок 6. Электрофореграммы разделения денатурированных продуктов (SSCPанализ) и результат секвенирования фрагмента, содержащего вставку CYP3A4 insTGT Дорожки 1 и 7 – гетерозиготы, дорожки 2-6, 8 гомозиготы «дикого» типа .

М – маркер молекулярного веса ДНК. Фрагменты окрашены нитратом серебра .

Результат секвенирования гетерозиготного варианта представлен с праймера R .

Выявление аллеля CYP3A5*3С. Для выявления аллеля CYP3A5*3C мы использовали эндонуклеазу рестрикции SspI, которую ранее применяли для детекции данного полиморфного варианта в работах van Schaik и соавт. (2002) и Hesselink и соавт. (2003). В результате амплификации с оригинальными праймерыми получали фрагмент длиной 221 п.н., который подвергали ферментативному гидролизу эндонуклеазой рестрикции SspI .

На рис. 7 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза SspI. Фрагменты длиной 20 и 53 п.н. не видны из-за низкого молекулярного веса .

–  –  –

Выявление CYP3A43*1B. Для амплификации интересующего фрагмента последовательности гена CYP3A43 использовали праймеры, предложенные Cauffiez и соавт. (2004) для обнаружения мутаций методом SSCP. Для выявления аллеля использовали метод ПДРФ-анализа. Фрагменты, синтезирующиеся в ходе ПЦР подвергали ферментативному гидролизу эндонуклеазой рестрикции Bst2UI. На рис. 9 представлены типичные электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза при выявлении аллеля CYP3A43*1B .

–  –  –

Выявление c.106GA PXR. Для выявления нуклеотидной замены с.106GA, использовали метод ПДРФ-анализа. В ходе ПЦР с использованием оригинальных праймеров синтезировался фрагмент длиной 436 п.н., который подвергали ферментативному гидролизу BstDEI. На рис. 12 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза при выявлении c.106GA PXR .

–  –  –

Характеристика изученных полиморфных вариантов генов CYP3A и PXR у здоровых европеоидов г. Новосибирска В исследуемой группе здоровых европеоидов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при соблюдении равновесия ХардиВайнберга: CYP3A4*1B Р=0,934, insTGT Р=0,932, CYP3A5*3C P=0,464, CYP3A7*2 P=0,569, CYP3A43*1B P=0,976, *2A P=0,947, PXR -1570CT P=0,073,

-205_-200delGAGAAG P=0,276, c.106GA P=0,930 .

При сравнении частот встречаемости аллелей среди европеоидов Западной Сибири и европеоидов других популяций в большинстве вариантов не было выявлено различий (табл. 5) .

–  –  –

Интересно отметить, что в работе Matsumura et al. (2004) частота встречаемости CYP3A4 -11129_-11128insTGT в два раза выше в популяции европеоидов Франции (3,10%) относительно наших данных (1,51%) (табл. 5), впрочем, различия не достигают статистически значимого уровня (р=0,264) .

Учитывая, что количество обследованных в выборках европеоидов Зап. Сибири и Франции отличаются практически в два раза (n=264 и 500, соответственно), можно предположить, что различия могут быть значимыми при исследовании более обширной выборки методом SSCP, при сравнении с данными Matsumura et. al. (2004). Так, предполагая, что среди 1000 аллелей при выявлении методом SSCP будут наблюдаться 15 аллелей мутантного типа, а при выявлении методом аллель-специфичной ПЦР – 32 аллеля мутантного типа, можем получить статистически значимые различия между этими выборками (р=0,014) .

–  –  –

Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в распределении генотипов по группам с разной скоростью метаболизма кортизола, следует отметить особенности их распределения. При анализе распределения полиморфных вариантов регуляторной области CYP3A4, наблюдается увеличение гетерозигот по аллелю CYP3A4*1B в группах со средней и повышенной активностью, по сравнению с группой со сниженной активностью, и наоборот, гетерозиготы по аллельному варианту CYP3A4 insTGT находятся только в группах со сниженной и средней активностью (рис. 13А). При анализе распределения полиморфных вариантов, белок-кодирующей области CYP3А7, CYP3A43 и интрона CYP3A5, наблюдается увеличение гетерозигот по аллелю CYP3A7*2 и уменьшение гомозигот по аллелю CYP3A7*1, а также увеличивается количество гетерозигот относительно гомозигот по аллелю CYP3A5*3C в направлении от группы со сниженной активностью к группе с повышенной активностью. Распределение генотипов по аллелям CYP3A43*1B и CYP3A43*2А в группах с различной активностью не имеет закономерности (рис. 13Б) .

При анализе распределения полиморфных вариантов регуляторной и белок-кодирующей областей PXR было отмечено снижение количества гомозигот по дикому аллелю PXR и увеличение количества гетерозигот по аллельным вариантам PXR-1570CT и -205_-200delGAGAAG в направлении от группы со сниженной активностью к группе с повышенной активностью (рис .

13В) .

Выявлены статистически значимые отличия в распределении полиморфных вариантов CYP3A5*3C, CYP3A7*2, CYP3A4*1B в группах с разной активностью CYP3A (таблица 7). Установлено статистически значимое увеличение в 3,15 раза среднего значения показателя активности CYP3A в группе гетерозигот CYP3A5*1A/*3C относительно группы гомозигот CYP3A5*3C/*3С (p=0,014) (таблица 7) .

Рисунок 13. Распределение генотипов аллельных вариантов регуляторной области CYP3A4 (А), белок-кодирующей области CYP3А7, CYP3A43 и интрона CYP3A5 (Б), регуляторной и белок-кодирующей областей прегнанового Х рецептора (В) в группах с различной активностью CYP3A

–  –  –

В целом можно заключить, что несмотря на выявленные ассоциации между генотипами и их комбинациями аллельных вариантов CYP3A5*3C, CYP3A7*2, CYP3A4*1B с показателем активности CYP3A, характер распределения полиморфных вариантов в разных фенотипических группах (когда гетерозиготный генотип встречается во всех фенотипических группах), все же свидетельствует об отсутствии сильного влияния генетического полиморфизма на вариабельность активности CYP3A .

Изучение полиморфизма цитохромов Р450 подсемейства 3А и их регуляторных генов, несомненно, является важной задачей в поиске причин вариабельности ферментативной активности подсемейства. Знания об активности CYP3A особенно важны при назначении лекарственных препаратов и при выборе их дозировки, особенно при комплексной лекарственной терапии для предотвращения нежелательных лекарственных реакций, возникающих при взаимодействии соединений .

Мы выявили статистически значимые ассоциации между некоторыми полиморфными вариантами и их комбинациями с ферментативной активностью CYP3A. Тем не менее, совокупность литературных данных и наблюдаемое распределение показателя активности CYP3A в собственном исследовании позволяют прийти к заключению, что в отличие от классических примеров фенотипического полиморфизма, когда можно определенно говорить о «быстром» и «медленном» типе метаболизма, для CYP3A ситуация является иной. Возможно в будущем, с учетом большего числа полиморфных вариантов генов информативность генотипирования возрастет. Однако распределение полиморфных вариантов генов подсемейства 3А и прегнанового Х рецептора между фенотипическими группами (сниженная, средняя, повышенная активность) свидетельствует об отсутствии сильного влияния полиморфизма изученных генов на ферментативную активность CYP3A, оцененную по 6-гидроксилированию кортизола .

ВЫВОДЫ

1. Активность цитохромов Р450 подсемейства 3A в выборке здоровых европеоидов от 1 до 14 лет имеет полимодальное распределение, разделяющее выборку на группы со сниженной, средней и повышенной активностью. Между мальчиками и девочками различия показателей активности в этом возрастном интервале отсутствуют (р=0,754) .

2. Активность цитохромов Р450 3A у детей увеличивается с возрастом .

Наибольшая сила связи между показателем активности CYP3A и возрастом наблюдается в группе от 1 года до 2,5 лет (r=0,628, р=0,016) .

3. Разработаны способы выявления полиморфных вариантов генов CYP3A4 (*2, *17), CYP3A5 (*6), CYP3A7 (*2), CYP3A43 (*1B, *2A), PXR (-1570CT, c.106GA, g.4444AG) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, PXR -205_-200delGAGAAG полимеразной цепной реакцией и CYP3A4 -11129_-11128insTGT методом конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов .

4. Отсутствуют значимые различия в показателях активности CYP3A между группами генотипов каждого из вариантов: CYP3A4 -11129_-11129insTGT, CYP3A43*1B, CYP3A43*2A, PXR c.106GA, PXR -1570CT, PXR -205_delGAGAAG в выборке здоровых европеоидов .

5. В группе гетерозигот CYP3A5*1A/*3C среднее значение показателя активности CYP3A выше в 3,15 раза относительно группы гомозигот CYP3A5*3C/*3С (p=0,014) .

6. В группе комбинации гомозигот CYP3A5*3C/*3С и CYP3A7*1/*1 среднее значение показателя активности CYP3A в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот CYP3A5*1/*3С и CYP3A7*1/*2 (p=0,031). В группе комбинации генотипов CYP3A4*1/*B, CYP3A5*1/*3C, CYP3A7*1/*2 среднее значение показателя активности CYP3A в 4,11 раз выше, чем в группе комбинации гомозигот CYP3A4*1/*1, CYP3A5*3C/*3C, CYP3A7*1/*1 (p=0,042) .

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Вавилин В.А., Щепотина Е.Г., Мананкин Н.А., Казначеева Л.Ф., Ляхович В.В. Активность CYP3A у детей. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2004. – Т. 138 .

– № 9. – С. 272-274 .

2. Щепотина Е.Г., Никишина М.В., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов гена цитохрома Р450 3А43 и определение частоты встречаемости аллеля CYP3A43*1B у европеоидов Западной Сибири. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2005. – Т. 140. – № 12. – С. 681-684 .

3. Щепотина Е.Г., Вавилин В.А., Горева О.Б., Ляхович В.В. Некоторые мутации экзона 7 гена CYP3A4 и их влияние на 6-гидроксилирование кортизола. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2006. – Т. 141. - №6. – С. 649-651 .

4. Щепотина Е.Г. Активность цитохрома Р450 3А у детей разного возраста. // Материалы V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», Новосибирск, 2004, с. 144-146 .

5. Щепотина Е.Г. Фенотипирование цитохрома Р450 3А4 (CYP3A4) у детей. // Материалы 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2004, с. 72-73 .

6. Щепотина Е.Г. Влияние на активность CYP3A некоторых аллелей и их частоты встречаемости у здоровых европеоидов Западной Сибири. // Материалы 9 Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», СПб, 2006, с. 408-409 .

7. Щепотина Е.Г. Частоты встречаемости аллелей *1B и *2 цитохрома Р450 3A4 (CYP3A4) и их влияние на активность фермента. // Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Москва, 2006, с.256-257 .

8. Щепотина Е.Г. Влияние на активность фермента мутаций гена цитохрома Р450 3А4 *2, *5, *17 и их частоты встречаемости. // Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2006. с. 104 .

9. Щепотина Е.Г., Вавилин В.А. Влияние полиморфизма генов цитохромов Р450 3А и прегнанового Х рецептора и возраста на активность CYP3A. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с. 221 .

Список используемых сокращений 5’UTR – 5’ нетранслируемая область 6-OHCL – 6-гидроксикортизол AF-1 – лиганд-независимый домен PXR с. – положение нуклеотида в кДНК последовательности (напр., с.653Т) g. – положение нуклеотида в геномной последовательности (напр. g.6986A) CAR – конститутивный андростановый рецептор HNF – ядерный фактор печени VDR – рецептор витамина D CLEM – конститутивный печеночный энхансерный модуль CYP – цитохром Р450 PXR – прегнановый Х рецептор SSCP – конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов Автор благодарит коллег за помощь, оказанную в процессе работы, в частности, к.б.н. Никишину М.В. за консультации по методам ПЦР и ПДРФ, д.м.н. Вавилина В.А. за помощь в освоении метода ВЭЖХ и за руководство работой, коллектив ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН (г. Новосибирск, http://sequest.niboch.nsc.ru) и лично к.б.н. Катохина А.В. (ИЦИГ СО РАН) за помощь в секвенировании образцов ДНК, а также коллектив ДГКБ №1 г. Новосибирска за предоставление клинического материала .

–  –  –






Похожие работы:

«Бюллетень Союза по сохранению сайгака Saiga News зима 2006/07: Выпуск 4 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Алматинская встреча – важный шаг в области сохранения сайгака Содержание Первое совещание стран, под...»

«Оценочный лист пояснительной записки творческого проекта lllрифТ _ Класс ~~ш ~ lZВ#fft? Тема проекта 9Шптza~.~4шJ ~ 11 k Кол-во По факту Критерии оценки проекта баллов I Общее оформление Качество исследования (актуальность; обоснование.3 проблемы; формулировка темы, целей...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ ПРИКАЗ от 5 сентября 2013 г. N П-13-71 О МЕРАХ ПО РЕАЛИЗАЦИИ ПОСТАНОВЛЕНИЯ ПРАВИТЕЛЬСТВА ОМСКОЙ ОБЛАСТИ ОТ 28 АВГУСТА 2013 ГОДА N 209-П ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПОРЯДКА ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ИЗ ОБЛАСТНОГО БЮДЖЕТА СУБСИДИЙ НА ПОДДЕРЖКУ ПЕРЕРАБОТКИ И СБЫТА...»

«ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНОГО ИСПЫТАНИЯ ПО БИОЛОГИИ 1. Биология как наука. Методы научного познания. Биология как наука, ее достижения, методы исследования, связи с другими науками. Роль биологии в жизни и практической деятельности человека. Основные уровни организации живой природы:...»

«Problemy istorii, lologii, kul’tury Проблемы истории, филологии, культуры 2 (2016), 356–363 2 (2016), 356–363 © The Author(s) 2016 ©Автор(ы) 2016 ВАРИАТИВНОСТЬ СВЯЗИ "КУКЛА РОК" В ХУДОЖЕСТВЕННЫХ...»

«1 www.esa-conference.ru\ Проблема "сохранения населения и сбережения народа": социальные аспекты Реутов Валентин Палладиевич, доктор биологических наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, РФ В статье анализируются некоторые социальные аспекты проблемы "сохранения населения и сбережения народа". Более 250 лет тому н...»

«МИОЛОГИЯ – УЧЕНИЕ О МЫШЦАХ При изучении миологии необходимо постоянно обращаться к предыдущим разделам анатомии – остеологии и артросиндесмологии . При этом рекомендуется повторять костные образования, связанные с мес...»

«Scientific Cooperation Center Interactive plus Бадрызлова Нина Сергеевна старший научный сотрудник ТОО "Казахский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства" г. Алматы, Республика Казахстан ЭКСПЕРИМЕНТ ПО ПОДРАЩИВАНИЮ МОЛОДИ СУДАКА В САДКАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИСКУССТВЕННЫХ СТАРТОВЫХ КОРМОВ Аннотация: в статье приведены результаты...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 2. – С. 92-97. УДК 574.5 ДИНАМИКА СТАЦИОНАРНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СЛЕДОВ ЛЕСНОЙ КУНИЦЫ (MARTES MARTES L.) ПОД ВЛИЯНИЕМ АНТРОПОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ САМАРСКИХ ОКРЕСТНОСТЕЙ © 2010 Э.Д. Владимирова, Д.П. Мозговой* Самарский государственный университет, г. Самара (Россия...»







 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.