WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«БРАГИН АНТОН ГЕННАДЬЕВИЧ СТЕХИОМЕТРИЯ МИНОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ГЕТЕРОПЛАЗМИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА BETA VULGARIS ...»

На правах рукописи

БРАГИН АНТОН ГЕННАДЬЕВИЧ

СТЕХИОМЕТРИЯ МИНОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И

ГЕТЕРОПЛАЗМИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА BETA VULGARIS

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискании учёной степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

Работа выполнена в лаборатории структуры генома Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М .

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Першина Л.А .

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск доктор биологических наук, профессор Гуляева Л.Ф .

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «_30_»_сентября__2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН .

Автореферат разослан «_20_»_августа___2010 г .

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Митохондриальные геномы растений обладают рядом уникальных черт среди которых большие размеры, наличие протяженных некодирующих областей и комплексная организация, заключающаяся в присутствии в составе митохондриальной фракции ДНК конкатемеров, -структур, субгеномных кольцевых и линейных вариантов, стехиометрия которых может варьировать в том числе и для разных особей одного вида (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Dudareva et al., 1988; Ivanov et al., 2004) .

Традиционное представление геномов митохондрий растений в форме «основной хромосомы» кольцевой молекулы, включающей все последовательности, полученные методом секвенирования мтДНК отдельного плазмотипа, – как правилоне отражает их состояние in vivо, так как не учитывает отличия стехиометрии отдельных последовательностей в составе митохондриальной ДНК и возможность присутствия низкокопийных и рекомбиногенных вариантов. В настоящее время известно, что проявление ряда фенотипических признаков растений непосредственно связано с организацией митохондриальной ДНК, одним из примеров подобных признаков является цитоплазматическая мужская стерильность .

Признак цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) связан с присутствием в митохондриях особого типа генома, проявляется при наличии особого ядерного окружения и заключается в неспособности растения производить фертильную пыльцу .

Для ряда видов растений молекулярная детерминанта ЦМС установлена, в то время как для сахарной свёклы (Beta vulgaris) она остаётся неизвестной, несмотря на многолетнюю историю исследования вопроса (Owen, 1945; Бузанов, 1968; Малецкий и др., 1991; Satoh et al., 2004; Matsuhira et al., 2007; Cheng et al., 2009). К настоящему времени полностью секвенированы два варианта «основной хромосомы» митохондриального генома B .



vulgaris обеспечивающий образование фертильной пыльцы (N-тип) и митохондриальный геном Svulg-типа, присутствие которого связано с ЦМС Оуэновского типа (Kubo et al., 2000; Satoh et al., 2004). Однако большое количество уникальных для каждого из геномов областей не позволяют связать ЦМС с утратой или приобретением какой-то отдельной последовательности. Анализ трансляционных спектров N и Svulg митохондрий также не позволил однозначно установить детерминанту ЦМС на белковом уровне (Ducos et al., 2001) .

Для ряда видов растений показана роль увеличения (путём рекомбинации или избирательной амплификации) дозы отдельных химерных последовательностей мтДНК в развитии ЦМС (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Bailey-Serres et al., 1987); для фасоли (Phaseolus vulgaris) показана связь признака с избирательной амплификацией отдельных субгеномных вариантов (Arrieta-Montiel et al., 2001). Вероятно, что проявление признака ЦМС у B. vulgaris обеспечивается не только присутствием генома («основной хромосомы») определенного типа, но и составом и стехиометрией субгеномных вариантов. В этом случае, установление связи между ЦМС и структурой генома митохондрий у этого вида требует количественного анализа гетероплазматического состояния мтДНК в цитоплазмах мужскостерильных и фертильных растений. Важно отметить, что стехиометрия отдельных последовательностей, входящих в состав генома митохондрии, может отличаться более чем в 1000 раз, что приводит к необходимости использования высокочувствительных методов с широким диапазоном детекции и тщательной их оптимизации .

Оценка копийности последовательностей нуклеиновой кислоты (НК) представляет собой сложную задачу, решение которой связано с адаптацией существующих и разработкой новых методов, позволяющих определять стехиометрию целевой последовательности с высокой точностью и чувствительностью (Covill et al, 2001; Giulietti et al., 2001; Williams, 2009). ПЦР в реальном времени в настоящий момент широко используется для количественной детекции низкокопийных последовательностей ДНК, однако для получения достоверных результатов он требует тщательной оптимизации (Freeman et al., 1999; Bustin, 2002; Bustin et al., 2004). Предельная теоретическая чувствительность метода ПЦР составляет одну копию последовательности НК на реакцию (Wabuyele and Soper, 2001; Piggee, 2008), однако реальная чувствительность может варьировать в широких пределах в зависимости от структуры анализируемой последовательности, состава и качества компонентов реакционной смеси, протекания в ней конкурирующих реакций и наличия ингибиторов, а также свойств используемого для амплификации фермента. Данные факторы влияют как на порог детекции, так и на характер зависимости аналитического сигнала от количества анализируемой последовательности, что затрудняет достоверную количественную оценку .





Использование ПЦР в реальном времени для оценки количества анализируемой НК требует учёта перечисленных факторов и уменьшения влияния тех из них, которые оказывают выраженное негативное влияние на чувствительность и воспроизводимость реакции, что достигается разработкой и использованием методов характеризации ключевых компонентов реакционной смеси, таких как ДНК-полимераза и флуоресцентномеченый олигонуклеотидный зонд, оптимизацией состава реакционной смеси и температурных параметров реакции .

Таким образом, установление характера причинно-следственной связи между развитием признака ЦМС и организацией генома митохондрий сахарной свёклы требует достоверной оценки стехиометрии отдельных последовательностей-кандидатов, что, в свою очередь, связано с необходимостью разработки методических подходов, направленных на усовершенствование метода ПЦР в реальном времени .

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение организации митохондриального генома Beta vulgaris и анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК, характерной для фертильных растений сахарной свёклы и растений с оуэновским типом цитоплазматической мужской стерильности .

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и оптимизация системы количественной детекции маркерных последовательностей в составе мтДНК сахарной свеклы с использованием ПЦР в реальном времени. С учётом специфики объекта и необходимости достоверного определения количества маркёров в широком диапазоне концентраций, решение этой задачи потребовало решения ряда промежуточных задач, таких как:

1.1. Разработка протокола флуоресцентной детекции ДНК-зависимой ДНКполимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз в режиме реального времени и оценка влияния на них различных факторов, как химической, так и физической природы .

1.2. Разработка системы оценки качества флуоресцентных зондов, используемых в ПЦР в реальном времени .

2. Анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК фертильных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris) и растений, характеризующихся проявлением признака цитоплазматической мужской стерильности, методом ПЦР в реальном времени и анализ связи стехиометрии отдельных последовательностей и пыльцевого фенотипа .

Научная новизна. Впервые показано присутствие Svulg-специфичных маркёров в мтДНК Beta vulgaris N-типа и N-специфичных маркёров в мтДНК Beta vulgaris Svulg-типа, что свидетельствует в пользу того, что гетероплазматическое состояние является естественным для мтДНК сахарной свёклы. Показано накопление точечных замен субгеномными вариантами в составе мтДНК. Разработаны подходы к оптимизации ПЦР в реальном времени, позволяющие добиться максимальной чувствительности и достоверности количественной детекции в широком диапазоне концентраций. Впервые разработаны методы, позволяющие одновременно определять ДНК-полимеразную и нуклеазную активности ДНК-полимераз и осуществлять стандартизацию флуоресцентномеченых олигонуклеотидов с использованием спектров поглощения и флуоресценции .

Положения, выносимые на защиту. Последовательности, входящие в состав митохондриального генома N-типа сахарной свёклы, повсеместно обнаруживаются в составе мтДНК Svulg-типа, в то время как последовательности, входящие в состав генома Svulg-типа, повсеместно обнаруживаются в составе мтДНК N-типа .

Гетероплазмия является естественным состоянием митохондриального генома сахарной свёклы, при этом разница копийностей доминирующего и минорного вариантов может достигать шести порядков .

Повышение чувствительности и воспроизводимости ПЦР в реальном времени является необходимой предпосылкой для получения биологически-значимых результатов при анализе митохондриальных геномов растений. Чрезвычайную важность имеет оценка и модуляция активностей входящей в состав реакционной смеси ДНК-полимеразы и контроль качества флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов .

Практическая значимость. Результаты работы расширяют спектр представлений об организации мтДНК сахарной свёклы и могут быть использованы при дальнейшем изучении структуры, репликации и сегрегации митохондриального генома. Данные о естественной гетероплазматичности митохондриальнго генома B. vulgaris и разработанный метод быстрого высокочувствительного типирования мтДНК могут быть использованы в селекционной практике .

Методологические подходы, разработанные и использованные в работе для повышения чувствительности и воспроизводимости ПЦР в реальном времени, могут широко использоваться при оптимизации ПЦР для детекции присутствия низкокопийных последовательностей, характеристике микроорганизменного состава природных сред и клинической диагностике возбудителей инфекционных заболеваний .

Метод одновременного определения полимеразной и нуклеазной активностей ДНКзависимых полимераз может использоваться при изучении кинетических свойств ферментов, для оценки влияния на них химических и физических факторов, определения эффективности ингибирования и оптимизации различных молекулярно-биологических протоколов с участием полимераз .

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры, анализ и обработка данных и написание программного обеспечения выполнены автором самостоятельно .

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на IV конференции молодых ученых, посвященной памяти М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2004), XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, 2005), международной конференции «Современные проблемы генетики» (Минск, 2005), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию акад. Д.Г.Кнорре, (Новосибирск, 2006), Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений»

(Иркутск, 2006), III международной конференции «Фундаментальные науки – медицине»

(Новосибирск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) .

По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых отечественных журналах, одна – в рецензируемом зарубежном журнале и одна – в монографии .

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 145 страницах (в том числе 12 страниц в приложении), содержит 47 рисунков (в том числе 7 рисунков в приложении) и 5 таблиц .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе анализировались образцы корнеплодов, зелёной ткани и цветоносов сахарной свеклы линий СОАН-22, мсСОАН-22, СОАН-31, мсСОАН-31, СОАН-252, мсСОАН-252, мсКНВС2, мсKWS1, сортов Белоцерковская односемянная 40, Ганусовская односемянная 55, Янаш А3. Растения были любезно предоставлены Е.И. Малецкой, С.И .

Малецким и Е.В. Левитесом (лаборатория популяционной генетики растений, ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) .

Все использованные олигонуклеотиды были синтезированы ЗАО «Синтол», Россия .

Выделение митохондрий из образцов растений проводили по методике (Rogers and Bendich, 1985) с незначительными изменениями, выделение ДНК из митохондрий проводили с использованием СТАВ согласно (Rogers and Bendich, 1985) .

ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green I проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Трис-НСl, 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP, 0.2 е.а. Taq-полимеразы, специфические праймеры 0.5 µM, SYBR Green I (разведение коммерческого раствора 1:20000). ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащй 67 mM ТрисНСl (pH 8.9), 1.6 mM (NH4)2SO4, 4.5 mM MgCl2, 0.01% Tween-20), dNTP 200µM, 0.2 е.а .

Taq-полимеразы, специфические праймеры 0.5 µM, зонд 0.25 µM. Для «горячего старта»

применяли моноклональные антитела к Taq-полимеразе («Clontech», США) .

Протокол обеих реакций имел следующий вид: прогрев 94оС (60 с), 50 циклов:

плавление при 94оС (10 с), отжиг праймеров (20 с, температура отжига зависела от используемых праймеров). Количество образовавшегося продукта оценивали посредством измерения интенсивности флуоресценции с использованием амплификатора с оптическим модулем iCycler iQ («Bio-Rad», США), либо Rotor-Gene 3000 («Corbett Research», США) .

Одновременное определение полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-НСl (pH 8.9), 1.6 мМ (NH4)2SO4, 4.5 мМ MgCl2, 0.01% Tween-20, 200 мкМ dNTP, 0.25 мкМ меченного флуорофором олигонуклеотидного зонда, SYBR Green I (разведение 1:10000 от коммерческого стокового раствора), ДНК-матрицу в концентрации 5-20 нг/мкл и различные количества ДНК-полимеразы. Детекцию вели в реальном времени на амплификаторах с оптическим блоком iCycler iQ или Rotor-Gene 3000 при 65oС .

Для снятия спектров поглощения и флуоресценции флуоресцентно-меченный олигонуклеотид разводился в ТЕ-буфере до концентрации 2 мкМ и 200 нМ, соответственно. Програма для анализа спектров поглощения и флуоресценции была написана на языке Matlab версии 7.4.0.287 R2007a и скомпилирована с использованием компилятора Matlab Compiler версии 4.6 .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием флуорохрома SYBR Green I С использованием моноплексного ПЦР в реальном времени в варианте с флуоресцентным красителем SYBR Green I и нормировкой количества последовательности на массу мтДНК был проведён анализ ограниченного числа линий сахарной свёклы, в ходе которого определялась стехиометрия нескольких маркёров, среди которых было два, специфичных для митохондриального генома N-типа, четыре, специфичных для генома Svulg-типа, и один, присутствующий в мтДНК обоих цитотипов, по данным полного секвенирования геномов N- и Svulg-типов (Kubo et al., 2000; Satoh et al., 2004). C целью исключения влияния ядерного окружения использовались растения изогенных линий .

Результаты оценки стехиометрии маркерных последовательностей в мтДНК N- и Svulg-типов приведены на рис. 1. Экспериментальные данные сравнивались с рассчитанными теоретически, исходя из размеров N- и Svulg-вариантов генома (368801 и 501020 п. н., соответственно) и копийности маркеров, полученными при анализе полных последовательностей "основных хромосом". Число копий уникальной последовательности в реакционной смеси вычислялось делением массы мтДНК, используемой в реакции в качестве матрицы (1 нг) на массу одной копии "основной хромосомы", равную произведению её длины на массу 1 п.н. (определялось абсолютное количество последовательности, нормированное на массу мтДНК). Для повторенных маркеров полученная величина умножалась на число полных копий в опубликованной последовательности генома .

–  –  –

Z(S) S-RAPD Маркёр Маркёр Рис. 1. Cравнение экспериментально определённых (тёмные столбцы) и рассчитанных теоретически (исходя из предположения о существовании геномов в форме "основной хромосомы", светлые столбцы) количеств маркерных последовательностей в 1 нг ДНК митохондрий B. vulgaris линий СОАН-252 (N-плазмотип) (А) и цмсСОАН-252 (Svulg-плазмотип) (Б). Цифрами обозначены экспериментально определённые копийности минорных последовательностей, среднеквадратичное отклонение не превышало 20% от среднего значения для всех проанализированных маркёров .

Для мтДНК N-типа (линия СОАН-252), при использовании N-специфичных маркеров, анализ показывает хорошее соответствие рассчитанных теоретически и определённых экспериментально последовательностей (рис. 1А). В то же время, результаты показывают присутствие небольших количеств Svulg-специфичного маркера orf167 (Z(S)) и значительных количеств маркера orf324, который расматривается рядом авторов в качестве возможной детерминанты ЦМС у B. vulgaris (Ducos et al., 2001; Satoh et al., 2004) .

Наши данные о высокой копийности этой последовательности в мтДНК линии с фертильной цитоплазмой (СОАН-252), изогенной по отношению к стерильной линии (цмсСОАН-252), свидетельствуют о том, что сам факт присутствия orf324 не приводит к проявлению ЦМС фенотипа. В целом, можно отметить, за указанным исключением, сходство экспериментально определенной стехиометрии последовательностей с теоретической, что позволяет предположить существование значительной части молекул в форме стехиометрически близкой "основной хромосоме", при одновременном присутствии субгеномных вариантов, в том числе и содержащих Svulg-специфические последовательности. Однако отсутствие других проанализированных Svulg-специфичных последовательностей, таких как atp6(S) и S-RAPD, свидетельствует в пользу того, что они присутствуют в мтДНК N-типа в количествах, лежащих за пределами чувствительности метода, или образуются de novo в процессе конверсии к ЦМС фенотипу .

Экспериментальные данные о стехиометрии исследованных маркеров в мтДНК ЦМС растений (линия цмсСОАН-252) обнаруживают значительное несоответствие с теоретически рассчитанными, исходя из представления о существовании мтДНК в форме мастер-хромосомы (рис. 1Б). Все исследованные последовательности за исключением orf324 присутствуют в количествах, существенно меньше расчетных. Кроме того, стоит отметить присутствие всех исследованных N-специфичных последовательностей в мтДНК ЦМС-растений. Тот факт, что количества копий маркеров значительно отличаются друг от друга, свидетельствует о том, что Svulg-вариант генома характеризуется сложной комплексной организацией и скорее может быть представлен в виде совокупности субгеномных молекул, присутствующих в разной стехиометрии, чем в виде «основной хромосомы». В пользу этого говорят также данные, полученные методом рестрикционного картирования (Brears and Lonsdale, 1988). Стоит отметить присутствие обоих исследованных N-специфичных маркеров в образцах мтДНК ЦМС-линий в количествах, сопоставимых с таковыми для некоторых Svulg-специфичных (S-RAPD, atp6(S)) .

Важно отметить, что принципиально сложным моментом является очень широкий диапазон копийностей различных последовательностей в составе митохондриального генома растений. С использованием ПЦР в реальном времени в варианте детекции количества ампликона посредством флуоресцентного красителя SYBR Green I нами показаны отличия до 4-х порядков, при этом некоторые Svulg-специфические маркеры в составе мтДНК N-типа не обнаружены. Опираясь на результаты ограниченной по масштабам проверки определить, было ли это связано с фактическим отсутствием ряда Svulg-специфческих последовательностей в цитоплазме N-типа, или с ограничениями используемой методики было невозможно. В связи с этим было решено произвести усовершенствование используемого метода ПЦР в реальном времени, которое включало изменение состава реакционной смеси, оценку полимеразной и нуклеазной активностей, организацию «горячего старта» ДНК-полимеразы, а также внедрение оценки и стандартизации качества флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов. Два последних направления потребовали разработки самостоятельных методик, так как, несмотря на наличие значительного количества информации, указывающей на важность учёта качества препаратов полимераз и олигонуклеотидных зондов, в доступной литературе отсутствуют описания методов, которые были бы пригодны для оптимизации ПЦР. В дальнейших исследованиях мы также отказались от нормировки на абсолютное количество ДНК и перешли на нормировку с использованием универсальных мтДНКмаркеров, которые представлены одновременно в мтДНК N-типа и Svulg-типа. Оценка копийности подобных последовательностей, нормированной на массу мтДНК, показала, что их количество остаётся практически неизменным, варьируя незначительно как между различными растениями одной линии, так и между растениями разных сортов .

Анализ копийности последовательностей мтДНК расширенной выборки линий и сортов Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием гидролизуемых зондов Помимо проанализированных при помощи ПЦР с SYBR Green I маркёров orfB, SRAPD и orf324 в анализ были добавлены универсальные маркеры coxII и rps4, которые были выбраны в качестве альтернативных вариантов нормировочной последовательности, и orf246 – единственная транскрибируемая открытая рамка с неидентифицированной функцией, специфичная для мастер-хромосомы N-типа. Маркерные участки мтДНК сахарной свеклы, относительное количество которых измерялось в работе, равномерно распределены по геному, соответствуя последовательностям с разной копийностью и «блокам», потенциально образующим различные комбинации при обменах между основными повторами .

Сравнение копийности универсальных маркеров coxII и rps4 с использованием двух выборок растений линий СОАН-22 и мсСОАН-22, каждая из которых состояла из пяти особей, показало, что соотношение копийностей варьирует незначительно как в пределах линии, так и между линиями. Анализ с использованием U-критерия показал, что соотношение между маркерами rps4 и coxII одинаково для линий СОАН-22 и мсСОАН-22 с вероятностью более 99%, составляя 1.030.25 (рис. 2А) .

Соотношения маркеров rps4/coxII оказались близкими и при сравнении растений различных линий, что позволило использовать любой из них в качестве нормировочного гена .

Совпадение эффективностей амплификации является необходимым условием относительной нормировки определяемого маркёра относительно маркёра стандарта:

определённая экспериментально эффективность амплификации стандартных образцов после оптимизации условий ПЦР превышала 95%, что соответствует таковой специфических маркеров. В дальнейшем копийность маркёров мтДНК определялось с использованием мультиплексного количественного ПЦР в реальном времени, в реакционную смесь добавлялись праймеры и зонды, соответствующие нормировочному маркёру rps4 (зонд был мечен флуорофором Cy5), и праймеры и зонды детектируемых последовательностей orfB, orf324, orf246, или S-RAPD (зонды были мечены FAM или R6G) .



1,8 1,8 1,6 1,6 1,4 1,4 1,2 1,2 1 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0,0 Рис. 2. (A). Оценка соотношения rps4/coxII для 10 растений сахарной свёклы линий СОАН-22 и мсСОАН-22. Стандартное отклонение здесь и далее вычислялось с использованием данных об амплификации 3-х повторов одного и того же образца в рамках одного эксперимента. (Б) Копийность универсального маркера orfB, нормированная на копийность маркера rps4 .

Анализ копийности универсального маркера orfB показал его равное присутствие как в цитоплазмах фертильных растений (соотношение от 0.52 для линии KWS1 до 1.20 для линии СОАН-22), так и в цитоплазмах растений ЦМС-линий (соотношение от 0.52 для мсСОАН-31 до 1.01 для мсСОАН-22, рис. 2Б). Это вкупе с данными о присутствии универсального маркера coxII свидетельствует в пользу того, что стехиометрия последовательностей в составе доминирующего генома изменяется в ограниченных пределах (не более одного порядка), другими словами: структура превалирующей формы генома стабильна даже в дифференцированных вегетативных тканях растения .

В случае маркёров, специфичных по данным геномного секвенирования, мтДНК Nили Svulg-типа, ситуация коренным образом отличается. Показано, что N-специфичный маркёр orf246 количественно преобладает в линиях фертильных растений, обнаруживая незначительную межлинейную вариацию. Если принять количество нормированного на rps4 маркера orf246 в растениях сорта Ганусовская за 100%, то количества этого маркера в мтДНК других фертильных растений составят 50, 69 и 88% для сортов Янаш А3, СОАНи KWS1, соответственно, т.е. отличия не превышают двух раз. Иная ситуация имеет место в случае линии СОАН-22, для которой количество orf246 было меньше, чем количество rps4, в 1600 раз. Это означает, что субгеномный вариант, в составе которого находится данная последовательность, составляет не более 0.06% от числа копий гипотетической мастер-хромосомы (рис. 3А). Сходная картина наблюдалась и для мтДНК стерильных линий сахарной свёклы в которых соотношение rps4/orf246 составляло от 6000 (мсСОАН-252) до 265000 (мсСОАН-22). В одном из исследованных образцов (мсKHBC2, мс1) указанная последовательность не была обнаружена, что, по всей вероятности, свидетельствует о том, что она была утрачена в мтДНК корня в ходе онтогенетического развития растения. Стоит отметить, что использование усовершенствованного метода ПЦР в реальном времени позволило выявить Nспецифичную последовательность во всех исследованных образцах с Svulg-цитоплазмой кроме одного, что указывает на то, что мтДНК у B. vulgaris является гетероплазматичной .

Крайне малые копийности минорных N-специфических последовательностей в Svulgцитоплазме можно объяснить тем, что для выделения ДНК использовались клетки дифференцированных тканей растения. По-видимому, после прохождения стадий дифференцировки клетки могут терять минорный вариант мтДНК, в то время как клетки меристематических тканей сохраняют и передают «трансмиссивную форму» (ArrietaMontiel et al., 2001) .

Оценка копийности Svulg-специфичных маркёров подтвердила полученные нами ранее данные о присутствии последовательностей, специфичных для плазмотипов стерильных линий в составе мтДНК растений фертильных линий (рис. 3Б). Анализ копийности маркёра orf324 в расширенном спектре линий показал, что соотношение количества этой Svulg-специфичной последовательности к количеству универсального маркера rps4 варьирует от 1:1 (линия мсСОАН-22) до 1:123 (образец линии мсKHBC2 с пыльцевым фенотипом мс1). Сходные данные получены и для другого ЦМСспецифичного маркёра – S-RAPD с той оговоркой, что его количество оказалось ниже такового orf324 для всех исследованных растений ЦМС-линий и составляло, в соотношении с rps4 от 1:48 (линия мсСОАН-22) до 1:564 (образец линии мсKHBC2 с пыльцевым фенотипом мс1). При этом между количествами обоих маркеров наблюдалось хорошее соответствие .

–  –  –

0,1 0,1 0,01 0,01 0,001 0,001 0,0001 0,0001 0,00001 0,00001 0,000001 0,000001 0,0000001 0,0000001 Рис. 3. (А) Копийность N-специфичного маркера orf246, нормированная на копийность универсального маркера rps4. (Б) Копийность Svulg-специфичных маркеров orf324 (серые графики) и S-RAPD (чёрные графики), нормированных на копийность универсального маркера rps4 .

Анализ количества Svulg-специфичных маркёров в образцах растений с Nцитоплазмой показал повсеместное присутствие обеих последовательностей во всех исследованных образцах. Этот результат согласуется с высказанным ранее предположением о присутствии Svulg-специфичных последовательностей в цитоплазме фертильных растений в субстехиометрических количествах. Стоит отметить, что исследованные образцы можно разделить на две группы, опираясь на копийности Svulgспецифичных маркеров: в первую входят растения, в которых соотношение как orf324/rps4, так и S-RAPD/rps4 будет больше 1:1000 – все растения этой группы принадлежат к ЦМС-линиям; во второй группе окажутся растения, для которых указанные соотношения будут меньше, чем 1:1000 (то есть оба указанных маркера будут представлены в субстехиометрическом состоянии) – все растения этой линии фертильны .

Единственным исключением является изогенная пара СОАН-22/мсСОАН-22, для которой характерно присутствие большого количества Svulg-специфичных маркёров как в растениях стерильной, так и в растениях фертильной линий, причём количество маркёров практически совпадает (сравн. с растениями изогенной пары СОАН-31/мсСОАН-31: в растениях фертильной линии количество Svulg-специфичных маркёров меньше на два порядка, чем в растениях ЦМС-линии) .

Переход к использованию усовершенствованного варианта ПЦР в реальном времени в совокупности с анализом расширенной выборки растений позволили получить более полную картину организации мтДНК у Beta vulgaris .

Показано, что как N-, так и Svulgспецифичные маркёры повсеместно присутствуют в цитоплазмах растений как с Оуэновским плазмотипом, так и с плазмотипом, обеспечивающим образование фертильной пыльцы, что свидетельствуют в пользу независимого сосуществования митохондриальных геномов N- и Svulg-типов в пределах митохондрий растений одной линии. Это также подтверждается накоплением точечных мутаций разными вариантами последовательности (Satoh, 2004). Чтобы проверить эту гипотезу, нами было осуществлено клонирование и секвенирование продуктов ПЦР, образующихся при амплификации маркёрных участков ДНК изогенных линий СОАН-252/мсСОАН-252 .

Секвенирование пяти независимо клонированных продуктов ПЦР с N-специфичных праймеров atpA(N), полученных с использованием в качестве матрицы мтДНК растений ЦМС-линии, выявило наличие замен в ряде позиций, причем для четырех клонов замены относительно опубликованой последовательности совпадают (рис. 4). В то же время секвенирование трех клонированных продуктов ПЦР с этих же праймеров на мтДНК фертильного растения с N-плазмотипом не выявило замен в этом участке. Наличие нуклеотидных замен в N-специфичных фрагментах мтДНК, амплифицированных с Оуэновской цитоплазмы Svulg-типа, по сравнению с амплифицированными с Nцитоплазмы, показано нами и для других фрагментов мтДНК (N-RAPD и coxII(N) маркеры, положение в митохондриальном геноме N-типа (BA000009) 255528-255728 и 234817-235003, соответственно). Эта информация дополняет данные о независимом накоплении последовательностями N- и Svulg-геномов точечных мутаций, распространяя их и на последовательности, находящиеся в субстехиометрическом состоянии в составе минорных вариантов мтДНК, накопление замен в которых невозможно обнаружить секвенированием полных геномов в силу крайне малой вероятности попадания таких последовательностей в геномные библиотеки .

Рис. 4. Выравнивание последовательностей клонов (atpA(N)1-5), несущих вставки продукта ПЦР с мтДНК B. vulgaris линии цмсСОАН-252, с использованием праймеров atpA(N) .

Последовательность atpA(N)consensus соответствует опубликованной (Kubo et al., 2000) .

Consensus представляет результат выравнивания с использованием алгоритма MultAlin .

Совпадающие позиции обозначены серым, черным обозначены вариабельные нуклеотиды .

Чрезвычайно важным является то, что стехиометрия N- и Svulg-специфичных маркёров находится в прямой зависимости от типа цитоплазмы для таких маркёров как Nспецифичный orf246 и Svulg-специфичные orf324 и S-RAPD, в то время как представленность универсальных маркёров orfB, rps4 и coxII от типа цитоплазмы не зависит. Это подтверждает данные о преимущественном присутствии последовательностей, вошедших в состав мастер-хромосомы N-типа (Kubo et al., 2000), в цитоплазме фертильных растений, и преимущественном присутствии последовательностей, вошедших в состав мастер-хромосомы Svulg-типа (Satoh et al., 2004), в цитоплазме растений с Оуэновским типом ЦМС .

Единственным исключением оказалась пара линий СОАН-22/мсСОАН-22, которая расценивалась нами как изогенная. Однако все полученные данные свидетельствуют в пользу того, что растения обеих линий имеют цитоплазму Оуэновского типа, в то время как фертильность растений линии СОАН-22 обеспечивается ядерными генамивосстановителями фертильности. Об этом говорят высокая копийность Svulgспецифичных последовательностей в препаратах мтДНК растений линии СОАН-22, идентичная таковой у растений линии мсСОАН-22 и существенно превосходящая копийность этих последовательностей во всех исследованных препаратах мтДНК растений фертильных линий, и субстехиометрические количества N-специфичного маркёра orf246, идентичные в растениях линий СОАН-22 и мсСОАН-22, в то время как все прочие растения фертильных линий характеризуются существенно большими количествами этого маркёра (разница составляет в среднем 1000 раз). Данные о высокой частоте конверсии линии СОАН-22 к стерильности можно объяснить тем, что для данной линии растений имеет место не истинная конверсия, а расщепление потомства по ядерным генам-восстановителям фертильности, что приводит к развитию ЦМС-фенотипа .

Мультиплексная ПЦР в реальном времени и типирование мтДНК Данные о копийности маркёров мтДНК и оптимизация ПЦР в реальном времени позволили разработать метод быстрого типирования плазмотипа сахарной свёклы, на востребованность которого в селекционной практике указывают литературные источники (Cheng, 2009). Одновременный анализ более чем одного маркера при помощи мультиплексной ПЦР, возможный при использовании гидролизуемых зондов, имеет ряд преимуществ, среди которых сокращение времени анализа и количества нуклеотидного материала, а также повышение достоверности типирования за счёт одновременного анализа более чем одного маркёра. Оптимизация мультиплексной ПЦР в реальном времени позволила проводить одновременную количественную детекцию orf324 и orf246 с нормировкой на rps4, S-RAPD и orf246 с нормировкой на rps4 и orf324, и orf246 с нормировкой на coxII; амплификация нормировочного маркера проводилась в канале Cy5, амплификация целевых маркёров – в каналах FAM и R6G. Оптимизация позволила добиться минимального снижения чувствительности мультиплексного варианта по сравнению с моноплексным, при этом диапазон линейной детекции составил от 100 до 107 копий последовательности на реакцию и не зависел от присутствия количеств мтДНК другого типа вплоть до соотношения 1/105 .

Разработанный вариант типирования цитоплазмы сахарной свёклы с использованием мультиплексной ПЦР в реальном времени, в отличие от использующихся в настоящее время методов, позволяет не только типировать доминирующий плазмотип, но и количественно оценивать гетероплазматическое состояние, что может найти широкое применение в селекционной практике .

Оптимизация ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей митохондриального генома Достоверность количественной ПЦР напрямую зависит от таких параметров реакции как чувствительность, эффективность и воспроизводимость. В ходе оптимизации состава реакционной смеси оценивали зависимость перечисленных параметров от концентрации катионов магния (менялась от 2 до 8 мМ), концентрации олигонуклеотидных праймеров (менялась от 0.25 до 1 мкМ) и флуоресцентно-меченного зонда (менялась от 0.15 мкМ до

0.5 мкМ). Также оценивалась зависимость от температуры этапа гибридизации праймеров в протоколе ПЦР (варьировала от 54 до 72 oC). В результате оптимизации были выбраны следующие условия: концентрация Mg2+ – 4.5 мМ, концентрация праймеров – 0.5 мкМ, концентрация зонда – 0.25 мкМ .

Оптимальная активность Taq-полимеразы составила 0.2 U в реакции, активность всех партий фермента, использовавшихся в дальнейшей работе, контролировалась с использованием разработанного метода определения активности полимеразы. Данный метод также использовался непосредственно при оптимизации состава ПЦР-смеси .

С использованием протокола оценки эффективности полимеразного синтеза и нуклеазной деградации зонда был также оптимизирован горячий старт Taq-полимеразы с использованием моноклональных антител к её активному центру, Блокировка активности полимеразы при низких температурах на стадиях, предшествующих ПЦР, позволила добиться независимости амплитуды аналитического сигнала (величина прироста флуоресценции, связанной с нуклеазной деградацией флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда) от концентрации анализируемой последовательности (рис. 5), что позволило проводить достоверную количественную оценку во всём диапазоне концентраций, находящихся в границах чувствительности метода .

5. Оптимизация ПЦР посредством введения горячего старта для полимеразы .

Рис .

Клонированные маркёрные последовательности мтДНК Beta vulgaris в количестве 1000 (1) и 100 (2) копий в реакционной смеси анализировались с использованием ПЦР в реальном времени с горячим стартом (чёрные кривые) и без горячего старта (серые кривые). При отсутствии горячего старта с уменьшением концентрации матрицы происходит падение уровня аналитического сигнала, приводящее к снижению чувствительности и ошибке количественного определения .

Оптимизация активности ДНК-полимеразы в реакционной смеси: разработка метода определения полимеразной и эндонуклеазной активности Использование предложенных в работе синтетических олигонуклеотидов, содержащих шпилечную структуру на 3'-конце и сайт посадки гидролизуемого зонда, позволяет одновременно определять полимеразную и нуклеазную активность ДНКполимераз (Рис. 6). Это широко применялось для оптимизации ПЦР в данной работе (нормировка активностей новых партий полимеразы, определение температурного и солевого оптимума работы фермента и оптимизация «горячего старта»). Метод также может быть использован при исследовании кинетических свойств полимераз и для оценки наличия в растворе ингибиторов. Сравнение скоростей прироста флуоресценции позволяет нормировать различные партии полимеразы, что повышает воспроизводимость результатов ПЦР и позволяет сравнивать удельную активность препаратов полимеразы (активность на единицу массы белка), полученных, или очищенных различным образом .

Разработка метода оценки полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз позволила определить оптимальное соотношение Taq-полимераза/моноклональные антитела в реакционной смеси и точно определять и нормировать активность препарата при переходе от одной партии полимераз к другой. Введение горячего старта добавлением в реакционную смесь антител к Taq-полимеразе позволило предотвратить неспецифическое удлинение праймеров на стадиях, предшествующих ПЦР, что существенно повысило чувствительность метода .

Рис. 6. (А) Принцип одновременной детекции полимеразной и 5’3’-экзонуклеазной активностей полимераз с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и флуоресцентного гидролизуемого зонда с разобщёнными спектрами флуоресценции. (Б) Определение экзонуклеазной активности препарата Taq-полимеразы в широком диапазоне концентраций. Активность препаратов сверху вниз составляет 2500, 1250, 625, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.2, 0 mU/мкл (образцы 1-12, соответственно) .

Анализ качества флуоресцентно-меченных олигнулеотидов Качество олигонуклеотидного зонда является одним из факторов, определяющих чувствительность ПЦР в реальном времени и достоверность количественной детекции с использованием этого метода. Эффективность флуоресцентного мечения и очистки конечного продукта от невключившихся молекул красителя оказывают существенное влияние на ключевые параметры ПЦР в реальном времени (Yeung et al., 2004; Espy et al., 2006). Нами была разработана методика характеризация олигонулеотидного зонда посредством анализа спектров поглощения и флуоресценции, показана зависимость параметров ПЦР от качества препарата зонда и написано программное обеспечение, позволяющее осуществлять анализ в автоматическом режиме. Метод оценки качества флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов применялся при аттестации новых партий всех зондов, использованных для оценки стехиометрии маркёров, входящих в состав мтДНК Beta vulgaris .

Проведённые усовершенствования позволили получить более подробную характеристику состояния мтДНК для существенно большей выборки образцов .

Чувствительность ПЦР в реальном времени после описанной выше оптимизации, включающей переход к использованию комплексов полимераза-антитела с известными параметрами температурной стабильности, и охарактеризованных препаратов полимеразы и флуоресцентных зондов, позволила идентифицировать малые количества минорных последовательностей мтДНК в присутствии преобладающего альтернативного варианта, вплоть до единичных копий. Применяя метод для анализа расширенной выборки линий и сортов сахарной свёклы нам впервые удалось показать, что N- и Svulg-варианты митохондриальной ДНК сосуществуют в вегетативных тканях растений этого вида, но их количества драматически отличаются. Это объясняет факт того, что последовательности, входящие в состав минорных вариантов, не попали в опубликованные секвенограммы мастер-хромосом сахарной свёклы с N-плазмотипом (Kubo, 1999) и Svulg-плазмотипом (Satoh, 2004). Кроме того, это объясняет известные случаи спонтанной конверсии растений к фертильности, сопровождающиеся сменой плазмотипа, и результаты филогетенического анализа, указывающие на независимое существование гомологичных последовательностей, входящих в состав мтДНК N- и Svulg-типов, в то время как полученные ранее с использованием методов, не обеспечивающих достаточной чувствительности, данные о том, что часть маркёрных последовательностей не обнаруживается в митохондриях с тем или иным плазмотипом (Cheng, 2009), входили с ними в прямое противоречие. Таким образом, полученные нами данные дополняют и систематизируют информацию об организации митохондриального генома сахарной свёклы и очерчивают направления и пути оптимизации экспериментальных подходов, использование которых позволяет получать качественно новую информацию об исследуемом объекте и разрабатывать практически-значимые приложения .

ВЫВОДЫ

1. Показано присутствие Svulg- специфичных маркёров orf324 и Z(S) в мтДНК Beta vulgaris N-типа и N-специфичных маркёров atp6(N) и atpA(N) в мтДНК Beta vulgaris Svulg-типа с использованием ПЦР в реальном времени в варианте с флуоресцентным красителем. Разница между копийностями последовательностей, входящих в состав доминирующего варианта мтДНК, и последовательностями, входящими в состав минорного варианта, доходила до трёх порядков. Для последовательности orf324, которая по результатам геномного секвенирования расценивалась как специфичная для оуэновской цитоплазмы, показана высокая копийность в мтДНК фертильных растений .

2. Впервые разработан метод, позволяющий одновременно определять ДНКполимеразную и нуклеазную активности ДНК-полимераз. Показана его применимость для оценки количества и нормировки активностей широкого спектра ДНК-полимераз, оптимизации состава реакционных смесей, содержащих полимеразы, в том числе смесей для ПЦР в реальном времени, оценки эффективности образования комплекса «полимераза-антитела» и оптимизации «горячего старта». Метод основан на измерении флуоресценции и может использоваться в стандартной лабораторной практике .

3. Разработан метод стандартизации флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов, основанный на анализе спектров поглощения и флуоресценции. Метод позволяет проводить оценку степени мечения олигонуклеотидов флуорофорами и гасителями флуоресценции, что облегчает оптимизацию и контроль качества реакций, в которых используются подобные олигонуклеотиды, например, ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемыми зондами .

Путём оценки копийности N- и Svulg-специфичных маркёров в мтДНК N- и Svulgтипов на расширенной выборке растений разных линий и сортов с использованием оптимизированной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом показано, что гетероплазмия является нормальным состоянием мтДНК Beta vulgaris, и что количество доминирующего и минорного варианта может отличаться более чем на шесть порядков .

Предложен способ быстрого типирования цитоплазмы сахарной свёклы, основанный 5 .

на использовании мультиплексной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом .

Работа поддержана грантом Министерства образования и науки РФ (№ 02.740.11.0705)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брагин А.Г., Иванов М.К., Дымшиц Г.М.. Оценка стехиометрии маркерных последовательностей митохондриального генома сахарной свеклы (Beta vulgaris) методом ПЦР в реальном времени// Доклады Академии Наук, 2006, т.406, №2, с. 260Брагин А.Г., Глушков С.А., Иванов М.К., Краснов А.А., Дымшиц Г.М. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режиме реального времени // Биохимия, 2008, т.73, в.9, с.1252-1264 .

3. Glushkov S.A., Bragin A.G., Dymshits G.M. Decontamination of polymerase chain reaction reagents using DEAE-cellulose // Analytical Biochemistry, 2009 v.393, n.1, pp 135 - 137 .

Молекулярно-генетические

4. Дымшиц Г.М., Иванов М.К .

Брагин А.Г., аспекты цитоплазматической мужской стерильности //Энциклопедия рода Beta .

Биология, генетика и селекция свеклы. Сборник научных трудов. Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия; Институт сахарной свеклы, Украина. Новосибирск .

«Издательство Сова», 2010, 686 стр., с. 228-247 .

5. Иванов М.К., Ревенко А.С., Брагин А.Г., Малецкий С.И., Дымшиц Г.М. Вариации структуры и транскрипции митохондриальной ДНК у растений сахарной свеклы с различным фенотипическим проявлением признака ЦМС // Материалы IV конференции молодых ученых, посвященной памяти М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 2004, Часть 2, с.86-91 .

6. Брагин А.Г. Исследование комплексной организации митохондриального генома и гетероплазмии сахарной свеклы (Beta vulgaris) методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) // Труды XLIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". НГУ, 2005, с. 143-149 .

7. Брагин А.Г., Иванов М.К. Комплексная организация митохондриального генома сахарной свеклы (Beta vulgaris): отличия в структуре и копийности отдельных последовательностей в связи с признаком ЦМС // "Молекулярная и прикладная генетика". Материалы международной научной конференции “Современные проблемы генетики”. Минск, 2005, Т.1, с.71 .

8. Дымшиц Г.М., Иванов М.К, Брагин А.Г. Анализ комплексной организации и гетероплазмии митохондриальной ДНК сахарной свеклы // Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию акад. Д.Г.Кнорре, Новосибирск, 30 июля-3 августа 2006 г., с.108-109 .

9. Брагин А.Г., Петров В.В., Краснов А.А., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Анализ структуры митохондриального генома сахарной свеклы методом ПЦР в реальном времени // Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 3-7 сентября 2006 г., с.17-22 .

10. Дымшиц Г.М., Хворостов И.Б., Иванов М.К., Брагин А.Г. Гетероплазмия потенциальный источник изменчивости структуры и экспрессии митохондриального генома сахарной свеклы // Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 3-7 сентября 2006 г., с.42-47 .

11. Bragin A.G., Glushkov S.A., Krasnov A.A., Vedernikov V.E., Ivanov M.K. New method of fluorescence detection of polymerase and nuclease activity of DNA polymerases which are used in molecular diagnostics // 3rd International Conference «Basic Science for Medicine», September 2-8, 2007, Novosibirsk, Russia, p.103 .

12. Брагин А.Г., Краснов А.А., Иванов М.К. Регистрация активности ферментовполимераз при помощи флуоресцентной детекции в режиме реального времени // «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции 9-12 мая 2007 г., Томск, с.30-31 .

13. Глушков С.А., Брагин А.Г., Дымшиц Г.М. Очистка ПЦР-реагентов от контаминирующей нуклеиновой кислоты с помощью ДЭАЭ-целлюлозы // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 года, Новосибирск, «Арта», с.369 .






Похожие работы:

«ГРЦ # 4 2015 Аннотации Бернард Лайтман. "Тезис о конфликте" и научный натурализм Зоолог Томас Гексли, физик Джон Тиндаль и философ-эволюционист Герберт Спенсер были центральными фигурами в истории отношений науки и религии в Британии XIX в. До 1970-х гг., когда "тезис о конфликте" (между наукой и религией) был в...»

«Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150) 458 2017. Volume 7. Issue 1 ID: 2017-01-28-A-11615 Краткое сообщение Кудашова А.С . Геометрия в анатомической терминологии ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, кафедра русской и классической филологии Научный руководител...»

«ДЯЧУК Вячеслав Алексеевич МИОГЕННАЯ И НЕЙРОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК ЛИЧИНОК МИДИИ MYTILUS TROSSULUS IN VIVO И IN VITRO 03.00.30 – биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2008 Работа выполнена в Институте биологии моря...»

«Вестник НПУА. “Химические и природоохранные технологии”. 2016. №1 УДК 631.4 ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РЕЗИНОСОДЕРЖАЩИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ А.А. Исаков Национальный политехнический университет Армении Рассмотрены вопросы переработки органически...»

«Российская академия наук Отделение биологических наук Институт экологии Волжского бассейна ДЕМЭКОЛОГИЯ: динамика, структура, взаимодействие популяций Часть I Г.С . Розенберг ДЕМЭКОЛОГИЯ. ОПРЕДЕЛЕННИЯ Разделение экологии на аут-, деми синэкологи...»

«ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ ЗА 1998—2002 гг. Губанов И.А., Калиниченко И.М., Щербаков А.В.1. Абрамов Н.В. Метод конкретных флор А.И.Толмачева в изучении флоры Республики Марий Эл // Изучение биологического разнообразия методами сравнительной флористики: Материалы IV рабочего совещ. по сравнит. флористике, Березин...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2015. № 1 (29). С. 113–154 УДК 597.828 doi: 10.17223/19988591/29/9 С.М . Ляпков1, Р.В. Волонцевич2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, россия Национальн...»

«Публикуется Альянсом по сохранению сайгака лето 2009 SAIGA NEWS выпуск 9 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака СОДЕРЖАНИЕ Россия присоедин...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.