«Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по России бесплатный) E-mail: hotline Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/08867 Комплект ...»

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, корп.6

Тел./факс +7 (495) 640-17-71

Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15

(звонок по России бесплатный)

E-mail: hotline@dna-technology.ru,

www.dna-technology.ru

Регистрационное удостоверение

№ ФСР 2010/08867

Комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот

ПРОБА–НК/ПРОБА-НК-ПЛЮС

Формы комплектации: ПРОБА–НК, ПРОБА–НК–ПЛЮС

1 НАЗНАЧЕНИЕ

1.1 Комплект реагентов ПРОБА–НК/ПРОБА-НК-ПЛЮС предназначен для получения препарата нуклеиновых кислот (НК) из биологического материала (таблица 1) для последующего анализа методом обратной транскрипции (РНК) и/или полимеразной цепной реакции (ДНК) .

Комплектация ПРОБА–НК–ПЛЮС предназначена для получения большего объёма ДНК (300 мкл) по сравнению с комплектацией ПРОБА–НК (50 мкл) с целью проведения в дальнейшем большего числа ПЦР–исследований .

1.2 Комплект может быть использован в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике .

1.3 Комплект рассчитан на выделение НК из 50/100 анализируемых образцов (включая отрицательные контрольные образцы) (таблица 1) .

Таблица 1 Комплектация ПРОБА-НК ПРОБА-НК-ПЛЮС Плазма крови, слюна, мокрота, молоко, моча, сперма, секрет предстательной Плазма крови, слюна, мокрота, железы, ликвор, соскобы эпителиальных молоко, моча, сперма, секрет клеток с задней стенки глотки, из уретры, предстательной железы, ликвор, Материал для цервикального канала, заднего свода соскобы эпителиальных клеток с исследования влагалища, мазки и смывы из полости носа задней стенки глотки, из уретры, и ротоглотки, фекалии, материал от падших цервикального канала, заднего свода и больных животных (мазки и смывы из влагалища и др .

трахеи, полости носа, глотки, клоаки;

фекалии; внутренние органы) и др .

Количество определений

Внимание! При работе с наборами реагентов:

ОТ-ГЕПАТОГЕН-С;

ОТ-ГЕПАТОГЕН-С ГЕНОТИПИРОВАНИЕ (формат «Real-Time»);

ВИЧ-ГЕН;

ВГБ-ГЕН;

набором реагентов для выявления РНК вируса гриппа А субтипа H5N1(«птичьего гриппа») (Influenza A virus subtype H5N1);

с комплектами реагентов для обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК HAV, HDV, HGV необходимо использовать только комплектацию ПРОБА–НК .

ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКТА

2.1 Состав комплекта Количество Реактив ПРОБА-НК-ПЛЮС ПРОБА-НК Лизирующий раствор 15 мл 1 флакон 30 мл 1 флакон Реагент для преципитации 20 мл 1 флакон 40 мл 1 флакон Промывочный раствор №1 25 мл 1 флакон 50 мл 1 флакон Промывочный раствор №2 15 мл 1 флакон 30 мл 1 флакон Буфер для растворения 15 мл 1 флакон 1,25 мл 4 пробирки Отрицательный контрольный образец - - 1,5 мл 2 пробирки Внутренний контрольный образец (РНК-ВК) - - 1,0 мл 1 пробирка Внутренний контрольный образец (ДНК-ВК) - - 1,0 мл 1 пробирка Внимание! Буфер для растворения различается для комплектаций ПРОБА–НК и ПРОБА–НК–ПЛЮС .

Использовать буфер для растворения из другой комплектации не допускается .

2.2 Время проведения выделения – 1 час .

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Организация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и материалы должны соответствовать Методическим указаниям МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» и санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» .

Исследуемые образцы рассматриваются как потенциально опасные .

Утилизировать неиспользованные реактивы, реагенты с истекшим сроком годности, а также использованные реагенты и биологический материал необходимо в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» .

Примечание. Комплект реагентов не содержит материалов биологического происхождения, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности является безопасным .

4 МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

При работе с комплектов реагентов ПРОБА-НК/ПРОБА-НК-ПЛЮС требуются следующие оборудование и материалы:

термостат твердотельный, поддерживающий температуру 65–98 °С;

центрифуга с RCF не ниже 13 000 g;

микроцентрифуга/вортекс;

холодильник бытовой с морозильной камерой;

насос с колбой–ловушкой для удаления надосадочной жидкости;

пробирки одноразовые пластиковые объёмом 1,5 мл;

штатив «рабочее место» для пробирок объёмом 1,5 мл;

дозаторы полуавтоматические одноканальные с переменным объёмом, позволяющие отбирать объёмы жидкости 20–200 мкл, 200–1000 мкл;

одноразовые наконечники с фильтром для полуавтоматических дозаторов, свободные от РНКаз и ДНКаз, объёмом 200 мкл, 1000 мкл;

одноразовые перчатки медицинские, без талька, текстурированные;

ёмкость для сброса использованных наконечников, пробирок и других расходных материалов;

транспортная среда для биопроб (ООО «НПО ДНК-Технология») и/или физиологический раствор (0,9% NaCl) стерильный .

При выделении НК из плазмы:

вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette с ЭДТА или цитратом натрия .

При выделении НК из мокроты (способ 1):

10% раствор трёхзамещенного фосфорнокислого натрия х 12Н2О;

1M раствор HCl;

5% раствор хлорамина;

вода дистиллированная .

При выделении НК из мокроты (способ 2):

муколизин .

5 ВЗЯТИЕ И ПОДГОТОВКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

5.1 Плазма крови Взятие цельной периферической крови проводится в вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette объёмом 2,0 или 4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия. Для перемешивания крови с антикоагулянтом после взятия материала необходимо перевернуть пробирку 2-3 раза .

Внимание! Не допускается использование гепарина в качестве антикоагулянта .

5.1.1 Центрифугируйте пробирки с кровью при 3000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре (от 18 °С до 25 °С) .

5.1.2 После центрифугирования отберите полуавтоматическим дозатором верхнюю фракцию (плазма) и перенести в отдельную пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

Внимание! Время от момента взятия периферической крови до получения плазмы не должно превышать 6 часов. При необходимости плазму допускается хранить при температуре минус 20 °С не более 3 месяцев .

Внимание! Перед выделением НК плазму необходимо перемешать!

5.2 Мокрота 5.2.1 Способ 1 5.2.1.1 Примерно 500 мкл биологического материала перенесите в стерильную посуду .

5.2.1.2 Добавьте к пробе мокроты равный объём 10% трехзамещённого фосфорнокислого натрия х 12Н2О, плотно закройте крышкой и интенсивно встряхните .

5.2.1.3 Смесь инкубируйте при температуре 37 °С в течение 18–24 часов, затем нейтрализуйте 1М НСl до рН 6,8–7,4 .

5.2.1.4 Центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 20 мин .

5.2.1.5 Слейте надосадочную жидкость в ёмкость с 5% раствором хлорамина для обеззараживания .

5.2.1.6 Добавьте к осадку 500 мкл дистиллированной воды, перемешайте пипетированием и перенесите в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

5.2.1.7 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.2.1.8 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок+жидкая фракция) .

5.2.2 Способ 2 5.2.2.1 В контейнер с образцом добавьте муколизин в соотношении 5:1 (5 частей муколизина к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке контейнера .

5.2.2.2 Закройте крышку контейнера, встряхните содержимое и инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре, каждые 2–3 мин встряхивая контейнер .

Обработанную мокроту допускается хранить в контейнере в течение суток при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно при температуре не выше минус 16 °С (в случае необходимости повторного выделения РНК/ДНК) .

5.3 Соскобы эпителиальных клеток 5.3.1 Перенесите соскоб эпителиальных клеток (с задней стенки глотки, из уретры, заднего свода влагалища, цервикального канала и др.) с помощью одноразового стерильного зонда в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл с транспортной средой (или с 500 мкл физиологического раствора стерильного), аккуратно перемешайте .

5.3.2 Извлеките зонд, прижимая его к стенке пробирки и отжимая избыток жидкости. Пробирку плотно закройте .

5.3.3 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.3.4 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок+жидкая фракция) .

Примечание. Перед взятием соскоба из цервикального канала необходимо удалить слизь стерильным ватным тампоном .

5.4 Моча 5.4.1 Порцию утренней мочи (примерно 50 мл) соберите в стерильную посуду и плотно закройте крышкой .

5.4.2 Перенесите 1,0 мл материала в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

5.4.3 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.4.4 Наиболее полно удалите надосадочную жидкость .

5.4.5 Добавьте к осадку 1,0 мл физиологического раствора стерильного .

5.4.6 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.4.7 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок+жидкая фракция) .

5.5 Слюна, ликвор, синовиальная жидкость 5.5.1 Слюну, ликвор, синовиальную жидкость (примерно 500 мкл) соберите в стерильную посуду и плотно закройте крышкой .

5.5.2 Перенесите 500 мкл материала в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

5.5.3 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.5.4 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 50 мкл (осадок+жидкая фракция) .

5.5.5 Добавьте к осадку 500 мкл физиологического раствора стерильного .

5.5.6 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.5.7 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок+жидкая фракция) .

5.6 Сперма, секрет предстательной железы 5.6.1 Перенесите 20–30 мкл жидкого материала пипеткой в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл с транспортной средой (или с 500 мкл физиологического раствора стерильного), встряхните пробирку на вортексе в течение 5–10 сек .

5.6.2 Центрифугируйте пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.6.3 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок+жидкая фракция) .

5.7 Молоко 5.7.1 Соберите материал в стерильную посуду и плотно закройте крышкой .

5.7.2 Аккуратно перемешайте и перенесите 1,0 мл материала в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

Срок сбора молока не более 24 часов. Хранение в течение всего срока сбора при температуре от 2 °С до 8 °С .

5.8 Мазки и смывы 5.8.1 Центрифугируйте пробирку, содержащую анализируемый материал, при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.8.2 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция) .

5.9 Фекалии 5.9.1 Перенесите ~250 мг (мкл) фекалий в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл с 1,0 мл физиологического раствора стерильного .

5.9.2 Встряхните пробирку на вортексе в течение 5–10 сек .

5.9.3 Центрифугируйте пробирку при 1000 об/мин в течение 2–3 мин .

5.9.4 Перенесите 800–1000 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку объёмом 1,5 мл, центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение 10 мин .

5.9.5 Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция) .

5.10 Внутренние органы животных 5.10.1 Поместите ~250 мг исследуемого материала в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

5.10.2 Добавьте 1,0 мл физиологического раствора стерильного .

5.10.3 Встряхните пробирку на вортексе в течение 3–5 сек, центрифугируйте пробирку на микроцентрифуге/вортексе при 1000 об/мин в течение 3–5 сек .

5.10.4 Удалите надосадочную жидкость .

Полученный материал готов для выделения НК .

5.11 Транспортирование и хранение исследуемого материала Транспортировать и хранить образцы биологического материала до начала исследования следует при температуре от 2 °С до 8 °С не более 24 часов .

Допускается хранить полученный материал при температуре минус 20 °С в течение 3 месяцев .

6 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Примечание. В лизирующем растворе допускается выпадение осадка. Перед началом работы его необходимо растворить нагреванием флакона при 65 °С в течение 10 мин .

6.1 Промаркируйте для каждого исследуемого образца и отрицательного контрольного образца «К-» по одной пробирке объёмом 1,5 мл .

Примечание. Для образцов, прошедших предобработку с получением осадка и надосадочной жидкости (см. 5: мокрота – способ 1, слюна, моча, ликвор, сперма, секрет предстательной железы, мазки и смывы;

фекалии), маркируются пробирки с подготовленным для исследования материалом в объёме 100 мкл .

6.2 Внесите по 10 мкл предварительно перемешанного внутреннего контрольного образца во все промаркированные пробирки (таблица 2) .

Внимание! Для комплектов реагентов для амплификации, не указанных в таблице 2, использование ВК на стадии пробоподготовки не предусмотрено .

Примечание. При одновременном исследовании образца на наличие инфекций, вызванных РНК– содержащими вирусами (HAV, HCV, HDV, HGV и HIV) и ДНК-содержащими вирусам (HBV), необходимо на стадии пробоподготовки внести два внутренних контроля (РНК-ВК + ДНК-ВК) .

Таблица 2 РНК-ВК ДНК-ВК

Наборы реагентов:

ОТ-ГЕПАТОГЕН-С, ОТ-ГЕПАТОГЕН-С ГЕНОТИПИРОВАНИЕ (формат «Real-Time»), ВИЧ-ГЕН Набор реагентов Набор реагентов для выявления РНК вируса гриппа А субтипа H5N1(«птичьего гриппа») ВГБ-ГЕН (Influenza A virus subtype H5N1) Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации кДНК HAV, HDV, HGV

6.3 Внесите в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора, не касаясь её края .

6.4 Внесите по 100 мкл подготовленного биоматериала в пробирки для исследуемых образцов (за исключением пробирок с образцами, прошедшими предобработку с получением осадка (см. 6.1), и пробирки «К-») .

6.5 В пробирку, маркированную «К-», внесите 100 мкл отрицательного контрольного образца (комплектация ПРОБА-НК), транспортной среды или физиологического раствора стерильного (комплектация ПРОБА-НК-ПЛЮС). Плотно закройте крышки пробирок, встряхните на вортексе в течение 3–5 сек .

6.6 Термостатируйте пробирки при 65 °С в течение 15 мин, центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение 30 сек .

Внимание! При выделении РНК вируса гриппа A из тканей внутренних органов животных необходимо термостатировать пробирки при 65 °С в течение 30 мин, осадить конденсат центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек и перенести надосадочную жидкость в новую пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

6.7 Добавьте 400 мкл реагента для преципитации и встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек .

Примечание. При выделении НК HAV, HCV, HDV, HGV, HBV и HIV пробирки необходимо встряхнуть на вортексе дважды .

6.8 Центрифугируйте пробирки при 13 000 об/мин в течение 15 мин .

6.9 Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки) .

6.10 Добавьте к осадку 500 мкл промывочного раствора №1, закройте крышки пробирок и 3–5 раз аккуратно переверните пробирки .

6.11 Центрифугируйте пробирки при 13 000 об/мин в течение 5 мин .

6.12 Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки) .

6.13 Добавьте к осадку 300 мкл промывочного раствора №2, закройте крышки пробирок и 3–5 раз аккуратно переверните пробирки .

6.14 Центрифугируйте пробирки при 13 000 об/мин в течение 5 мин .

6.15 Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки) .

6.16 Откройте крышки пробирок и высушите осадок при 65 °С в течение 5 мин .

6.17 Добавьте к осадку 50 мкл (комплектация ПРОБА–НК) или 300 мкл (комплектация ПРОБА–НК–ПЛЮС) буфера для растворения .

Внимание! Буфер для растворения различается для комплектаций ПРОБА–НК и ПРОБА–НК–ПЛЮС .

Использовать буфер для растворения из другой комплектации не допускается .

Внимание! При исследовании клинического материала на наличие инфекций, вызванных только РНКсодержащими вирусами (при работе с наборами ОТ-ГЕПАТОГЕН-С, ОТ-ГЕПАТОГЕН-С ГЕНОТИПИРОВАНИЕ, ВИЧ-ГЕН, комплектами для выявления HAV, HDV, HGV), рекомендуется растворять осадок в 16,5 мкл буфера для растворения, так как увеличение объёма буфера для растворения приводит к пропорциональному разбавлению образца и уменьшению чувствительности анализа .

При работе с набором ВГБ-ГЕН, а также при одновременном исследовании образца на наличие инфекций, вызванных РНК-содержащими вирусами (HAV, HCV, HDV, HGV и HIV) и ДНК-содержащими вирусами (HBV), необходимо растворить осадок в 25 мкл буфера для растворения .

6.18 Осадите капли центрифугированием пробирок на микроцентрифуге/вортексе в течение 1-3 сек .

6.19 Прогрейте пробирки при 65 °С в течение 10 мин. Встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек .

Внимание! При выделении НК HAV, HCV, HDV, HGV, HBV и HIV пробирки не встряхивать!

6.20 Центрифугируйте пробирки при 13 000 об/мин в течение 30 сек .

Препарат НК готов для постановки реакции обратной транскрипции (РНК) или проведения ПЦР (ДНК) .

Примечание. Полученный препарат РНК необходимо сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции. Препарат РНК не подлежит хранению. Препарат ДНК можно хранить при температуре минус 20 °С не более 1 месяца или при температуре минус 70 °С не более 1 года .

7 УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ, ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ КОМПЛЕКТА

7.1 Срок годности комплекта – 12 месяцев со дня приёмки ОТК предприятия-изготовителя при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и эксплуатации .

7.2 Комплект реагентов следует хранить при температуре от 2 °С до 8 °С в течение всего срока годности .

7.3 Транспортирование комплекта осуществляют всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 °С до 8 °С в течении всего срока годности комплекта .

8 УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ

8.1 Комплекты, пришедшие в непригодность, в том числе в связи с истечением срока годности и неиспользованные реактивы, подлежат утилизации в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 и МУ 1.3.2569-09 .

8.2 Непригодные для использования комплекты реагентов, упаковка комплектов реагентов (пробирки, флаконы, полиэтиленовые пакеты с замком и коробки из картона) относятся к отходам класса А и утилизируется с бытовыми отходами .

По вопросам, касающимся качества комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот (ПРОБА-НК/ПРОБАНК-ПЛЮС), следует обращаться к официальному представителю производителя по адресу:

ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, корп.6, тел./факс +7 (495) 640-17-71, www.dna-technology.ru .

Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по России бесплатный), E-mail: hotline@dna-technology.ru

Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:

http://www.dna-technology.ru/customer_support/ Номер 270-1 07.12.16